CDC2敲低治疗人脑胶质瘤的实验研究

目的 提供CDC2作为胶质瘤发生发展相关新分子的实验依据.方法 构建针对目的 基因的shRNA逆转录病毒表达载体;对体外培养的人脑胶质瘤细胞及其裸小鼠移植瘤进行转染,观察与目标基因相关的表型变化;荧光实时定量PCR检测mRNA表达,Western印迹检测蛋白表达;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化.结果 shRNA表达载体使人脑胶质瘤细胞株SHG44 CDC2的mRNA、蛋白表达显著下调,同时出现了明显的细胞G2/M期阻滞,细胞生长抑制,凋亡增加.裸小鼠皮下移植瘤明显缩小;肿瘤颅内移植裸小鼠生存期明显延长.结论 CDC2基因过表达是胶质瘤发生发展病因分子之一,敲低其表达可使肿瘤的恶性增殖得到控制.     

RNAi下调PIK3 CB表达抑制U251胶质瘤细胞生长的体内外研究

目的 探讨应用RNAi技术靶向磷酸肌醇酯-3-激酶β催化亚单位(PIK3CB)抑制恶性胶质瘤细胞系U251的PIK3CB表达后在体内外对U251细胞生长抑制作用.方法 将短发夹RNA(shRNA)表达载体psiRNA-PIK3CB进行脂质体介导的U251人脑恶性胶质瘤细胞系表达,检测细胞转染前后的细胞增殖能力和凋亡的变化.应用裸鼠皮下荷瘤模型观察脂质体介导shRNA基因治疗对U251细胞生长抑制作用,对肿瘤组织应用免疫荧光双染色和免疫组化的方法分析结果.结果 靶向PIK3CB的shRNA转染后U251细胞生长受到抑制,细胞周期出现G2/M阻滞,细胞明显凋亡.裸鼠皮下荷瘤模型实验显示psiRNA-PIK3CB显著抑制皮下肿瘤生长(P＜0.01).结论 靶向PIK3CB的shRNA基因治疗可以成为胶质瘤治疗的新策略.     

MSP58基因RNA干涉后对人脑胶质瘤细胞裸鼠移植瘤的影响

目的观察RNA干涉法（RNA interference,RNAi）抑制人脑胶质瘤U251细胞的MSP58基因表达后,对其在裸鼠体内成瘤性及增殖、侵袭性的影响。方法将特异性的MSP58干涉表达载体pSilencer3．1．MSP58转染人脑胶质瘤细胞系U251（U251．S）,同时构建相应的阴性对照组U251-NC,以及空载体组U251-H1neo。运用逆转录酶-多聚酶链反应（RT—PCR）及蛋白质印迹法（Westernblot）检测各组细胞的MSP58mRNA和蛋白表达水平。用各组U251细胞建立人脑胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型。结果成功建立了具有稳定下调MSP58基因表达的U251-S细胞。U251-S细胞MSP58的表达无论在mRNA水平还是在蛋白质水平均较U251组、U251-H1neo组及U251-NC组细胞显著降低（P〈0．01）。与接种U251、U251-H1neo和U251-NC细胞的裸鼠相比,接种U251-S细胞的裸鼠肿瘤形成时间延迟,肿瘤生长缓慢,肿瘤体积及瘤重均明显减小（P〈0．01）。结论MSP58基因RNAi后抑制了移植瘤细胞MSP58mRNA及蛋白的表达,进而明显抑制移植瘤的增殖和侵袭能力。     

重构型Caspase-3对人脑胶质瘤抑瘤效应的实验研究

目的 探讨重构型Caspase-3对裸鼠皮下人脑胶质瘤生长的影响.方法 用脂质体包裹法将重构型Caspase-3基因的真核表达载体pcDNA-Rev-Caspase-3注入裸鼠皮下SHG 44人脑胶质瘤内,观察肿瘤生长情况并计算抑瘤率,结合病理组织学、电镜确定重构型Caspase-3对人脑胶质瘤的作用.结果 重构型Caspase-3在荷瘤裸鼠瘤体内获得表达,裸鼠肿瘤生长受到抑制,抑瘤率达到46.1%.结论 重构型Caspase-3能够促进肿瘤凋亡,导致肿瘤细胞死亡,抑制人脑胶质瘤生长.为进一步研究胶质瘤的基因治疗打下了基础.     

RNA干扰敲低Wnt2的表达抑制U251细胞生长的体内外研究

目的 在体内外研究转染靶向Wnt2的siRNA对U251细胞的抑制效果.方法 向U251细胞转染靶向Wnt2的siRNA后,免疫印记检测转染后Wnt2及相关蛋白表达,MTT检测细胞增殖,annexin标记细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期分布,鼠尾胶3D生长实验检测细胞侵袭能力的变化.建立裸鼠胶质瘤皮下动物模型,瘤内注射Wnt2 siRNA观察肿瘤生长情况.结果 转染Wnt2siRNA后,U251细胞的Wnt2、frizzled2、磷酸化GSK-3β、β-catenin等表达降低,细胞增殖受抑,凋亡率升高,细胞阻滞于G0/G1期.体内研究发现转染靶向Wnt2的siRNA后,裸鼠皮下肿瘤的生长速度缓慢,相应的蛋白表达降低.结论 转染靶向Wnt2的siRNA可有效敲低该基因在U251细胞内的表达,从而抑制了胶质瘤细胞生长,具有潜在的治疗前景.     

胶质瘤治疗的靶分子CDC2 RNA干扰的体外实验研究

目的 探讨抑制细胞周期依赖性激酶CDC2基因对人脑胶质瘤细胞生长的影响,并为其作为胶质瘤发生发展相关基因在胶质瘤治疗方面的应用价值提供实验依据.方法 利用本实验室基因重组构建的CDC2 shRNA逆转录病毒表达质粒对体外培养的人脑胶质瘤细胞进行转染.倒置显微镜观察细胞形态和数量变化;RT-PCR及荧光实时定量PCR检测CDC2 mRNA表达;Western blot检测CDC2蛋白表达;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化;透射电子显微镜观察细胞超微结构.结果 人脑胶质瘤细胞系U251在转染针对CDC2的shRNA逆转录病毒表达质粒48h后,贴壁生长的细胞逐渐漂浮,细胞生长受到抑制,CDC2 mRNA下调均达98%以上,蛋白表达下调达92%以上,同时出现了明显的细胞G2/M期阻滞,细胞凋亡由0.57%上升到13.01%,并且超微结构受损明显.结论 CDC2 shRNA逆转录病毒表达质粒介导的RNA干扰能有效的抑制U251细胞的增殖,CDC2可作为胶质瘤基因治疗靶分子作进一步研究.     

IFN-β裸DNA对人脑胶质瘤生长的抑制作用

目的探讨β干扰素(IFN-β)基因对人脑胶质瘤生长的抑制作用,以及人IFN-β裸DNA治疗人脑胶质瘤的可行性.方法建立裸鼠SHG44胶质瘤模型,用脂质体包埋法将含IFN-β基因的真核表达载体(pSV2IFN β)注入裸鼠皮下SHG44脑胶质瘤,观察肿瘤生长情况并计算肿瘤体积,通过免疫组化、原位末端转移酶标记(TUNEL)染色以及瘤体坏死区计数检测,了解IFN-β基因对人脑胶质瘤生长的抑制作用.结果 IFN-β在荷瘤裸鼠瘤体内获得表达,裸鼠皮下胶质瘤生长受到抑制,并诱导SHG44胶质瘤细胞凋亡.结论 IFN-β裸DNA能够抑制人脑胶质瘤生长,该实验为IFN-β基因治疗人脑胶质瘤的应用奠定了初步基础.     

白藜芦醇对裸鼠U87细胞移植瘤生长及血管生成的影响

目的 研究白藜芦醇(Res)对人脑胶质瘤系U87细胞的体内抗癌活性及血管生成的影响. 方法 BALB/c裸鼠20只,背部皮下接种胶质瘤细胞U87建立皮下移植瘤模型.随机数字表法分为10、100mg/kgRes治疗组,溶剂对照组,空白对照组,每组5只.观察4组裸鼠移植瘤的生长曲线并应用免疫组织化学法检测瘤组织中微血管密度(MVD)及血管内皮生长因子(VEGF)的表达:采用原位末端标记法(TUNEL)检测瘤组织细胞的凋亡. 结果与空白对照组及溶剂对照组相比,100 mg/kg Res治疗组裸鼠移植瘤的体积、重量降低;100 mg/kg Res治疗组瘤组织中MVD、VEGF的表达明显降低,凋亡细胞数增高,差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 Res对U87人脑胶质瘤细胞裸鼠移植瘤的生长具有明显抑制作用,这可能与Res导致U87移植瘤细胞凋亡及血管生成减少有关.     

白藜芦醇对裸鼠U87细胞移植瘤生长及血管生成的影响

目的 研究白藜芦醇(Res)对人脑胶质瘤系U87细胞的体内抗癌活性及血管生成的影响. 方法 BALB/c裸鼠20只,背部皮下接种胶质瘤细胞U87建立皮下移植瘤模型.随机数字表法分为10、100mg/kgRes治疗组,溶剂对照组,空白对照组,每组5只.观察4组裸鼠移植瘤的生长曲线并应用免疫组织化学法检测瘤组织中微血管密度(MVD)及血管内皮生长因子(VEGF)的表达:采用原位末端标记法(TUNEL)检测瘤组织细胞的凋亡. 结果与空白对照组及溶剂对照组相比,100 mg/kg Res治疗组裸鼠移植瘤的体积、重量降低;100 mg/kg Res治疗组瘤组织中MVD、VEGF的表达明显降低,凋亡细胞数增高,差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 Res对U87人脑胶质瘤细胞裸鼠移植瘤的生长具有明显抑制作用,这可能与Res导致U87移植瘤细胞凋亡及血管生成减少有关.     

靶向表皮生长因子受体的shRNA抑制U251胶质瘤生长的实验研究

目的探讨靶向表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的RNA干涉(RNAi)技术抑制恶性胶质瘤体外细胞系U251的EGFR表达后,在体内外对U251细胞生长抑制作用。方法在人EGFR开放阅读框的细胞内区酪氨酸激酶结构域选择1个siRNA靶序列、进行短发夹RNA(shRNA)表达载体psiRNA-2400的构建,并以含有随机序列的psiRNA-scr表达质粒为对照进行了脂质体介导的U251人脑恶性胶质瘤细胞系表达。应用RT-PCR检测EGFR表达水平,应用MTT法、流式细胞术和Matrigel基质生长实验评价肿瘤细胞转染前后的生物学行为。进一步应用裸鼠皮下荷瘤模型观察脂质体介导shRNA基因治疗对U251细胞生长抑制作用。对肿瘤组织应用免疫组化的方法进行EGFR、PCNA和GFAP表达比较。结果脂质体介导、靶向EGFR的shRNA可显著抑制U251细胞ECFR表达,MTT法分析显示psiRNA-2400转染组细胞生长抑制率为68%;与对照组和psiRNA-scr转染组比较,细胞周期分析结果表明psiRNA-2400转染组G_0～G_1期细胞数没有明显变化,进入S期的细胞数较对照组减少了12.7%～13%,而进入G_2期细胞则增加了10.5%～11.7%。Matrigel基质生长实验显示对照组和psiRNA-scr转染组细胞呈正常形态贴壁生长,而psiRNA-2400转染组细胞不能贴壁生长,呈团块状簇集生长。裸鼠皮下荷瘤模型实验显示psiRNA-2400显著抑制皮下肿瘤生长,组织病理学分析显示治疗组EGFR表达下降、PCNA标记指数降低而GFAP表达上调。结论靶向EGFR的RNAi技术可以显著抑制U251细胞的EGFR表达,在体内外对U251细胞生长均产生明显抑制作用。因此,shRNA表达质粒介导的基因治疗可以成为胶质瘤靶向性EGFR治疗的新策略。     

SEPT7基因抑制U251 MG裸鼠皮下荷瘤侵袭的体内实验研究

目的 探讨SEPT7 基因在体内抑制胶质瘤生长和侵袭的作用.方法 建立人脑胶质母细胞瘤U251细胞来源的裸鼠皮下胶质瘤模型,并给予SEPT7治疗,定期测量肿瘤体积变化,检测肿瘤组织中SEPT7以及侵袭相关蛋白MMP2、MMP9、MT1-MMP、TIMP1、TIMP2和整合素α_v β_3的表达.结果 SEPT7 显著抑制肿瘤生长.治疗组肿瘤体积明显小于对照组(P＜0.01).SEPT7 治疗组中,肿瘤组织细胞内SEPT7表达明显上调.MMP2,MMP9,MT1-MMP和整合素α_v β_3的表达下降,而TIMP1、TIMP2 的表达明显升高.结论 SEPT7基因对于胶质瘤的侵袭和生长具有抑制作用.     

利用RNA干扰技术抑制Cyr61表达对人脑胶质瘤细胞药物敏感性和凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制Cyr61基因表达增强人脑胶质瘤U251细胞对化疗药物敏感性及凋亡能力的研究.方法 针对Cyr61 Mrna序列设计合成小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建Prnat-Cyr61重组表达载体,转染人脑胶质瘤U251细胞:通过RT-PCR和Western blot分析其对U251细胞内源性Cyr61表达的影响;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察U251细胞对化疗药物顺铂和替莫唑胺敏感性的改变;用流式细胞仪检测U251细胞体外凋亡的变化.结果 成功构建Prnat-Cyr61重组质粒,并成功转染U251细胞;RT-PCR和Western blot结果证实重组质粒在Mrna及蛋白水平分别显著抑制Cyr61基因表达(P<0.01);MTT及流式细胞仪结果证明在和顺铂或替莫唑胺联合作用下,Prnat-Cyr61组U251细胞的生长抑制率和凋亡率都明显增高(P<0.01).结论 Prnat-Cyr61可抑制Cyr61在人脑胶质瘤U251细胞中的表达,并增强U251细胞对化疗药物敏感性及其体外凋亡率.     

重组VEGF165-PE38融合基因对裸鼠移植性人胶质瘤血管生成的抑制作用

目的 研究血管内皮细胞生长因子(VEGF)和铜绿假单胞菌外毒素A(PE)融合基因的真核表达载体对裸鼠移植性人脑恶性胶质瘤血管生成的影响,探索抗肿瘤血管生成的新方法.方法 采用裸鼠背部皮下注射U251细胞建立移植性恶性胶质瘤模型,9 d后按随机数字表法将裸鼠分为未治疗组、PBS组、空质粒组、重组质粒组,采用HE染色观察肿瘤组织的形态学变化.免疫组织化学SP法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAF)、CD31、PE的表达.分析肿瘤组织的微血管密度(MVD). 结果 注射后第16天重组质粒组裸鼠移植瘤体积明显小于其他3组,差异有统计学意义(P<0.05);重组质粒组裸鼠移植瘤MVD低于其他3组,差异均有统计学意义(P<0.05);重组质粒组裸鼠肿瘤组织PE呈阳性表达,而在空质粒组、PBS组及未治疗组均为阴性表达. 结论 VEGF165-PE38融合基因的表达产物对人脑恶性胶质瘤有明显的抑制作用,并能抑制肿瘤新生血管生成,可能为一种有效抗肿瘤血管治疗的新策略.     

蛇毒解聚素在裸鼠胶质瘤模型中的干预治疗作用研究

目的研究蛇毒解聚素（CN）对裸鼠人脑胶质瘤动物模型的治疗可行性,探讨蛇毒解聚素抑制U87胶质瘤裸鼠移植瘤生长的作用机制。方法建立BALB／c裸鼠U87胶质瘤移植瘤模型,将荷瘤裸鼠随机分为2组,采用间质内注射给药方法。蛇毒解聚素按40μg每次给药。定期观察肿瘤生长情况,测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线并计算抑瘤率。全部BALB／c裸鼠移植瘤石蜡标本用SP法免疫组化染色,检测移植瘤组织中的微血管计数（MVD）,Ki-67标记指数以及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。结果与溶媒对照组相比,蛇毒解聚素组均能抑制肿瘤生长（P〈0．01）,其体积抑瘤率为50％,并能明显降低肿瘤微血管密度、能下调移植瘤组织中bFGF的蛋白表达及Ki-67标记指数。结论蛇毒解聚素能明显抑制U87裸鼠移植瘤生长。     

WISP-2siRNA对人脑胶质瘤U251细胞增殖、凋亡的影响

目的 探讨siRNA沉默WISP-2基因表达对人脑胶质瘤细胞U251增殖、凋亡的影响.方法 脂质体介导siRNA转染人脑胶质瘤细胞U251后,检测U251细胞的增殖、凋亡的变化,并用Western blot法检测WISP-2、Bcl-2、Bax蛋白的表达.结果 WISP-2 siRNA能有效抑制U251细胞株的生长,诱导凋亡,siRNA干扰组WISP-2蛋白表达水平为(18.67±1.40)％,明显低于空白对照组(70.18±1.82)％和阴性对照组(69.41±1.77)％,且差异有统计学意义(P＜0.01);siRNA干扰组Bcl-2、Bax蛋白表达水平为(29.67±1.47)％、(31.62±1.32)％,明显低于空白对照组和阴性对照组,且差异有统计学意义(P＜0.01).结论 WISP-2 siRNA抑制WISP-2 mRNA和蛋白表达后,能有效抑制胶质瘤细胞的增殖,增加U251细胞凋亡,可能通过下调Bcl-2/Bax蛋白表达的比值来诱导细胞凋亡.     

RNA干扰XBP1基因表达对人胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨X-盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)对人脑胶质瘤细胞增殖与凋亡的影响。方法 设计并合成干扰XBP1表达的小干扰RNA(siXBP1),转染人脑胶质瘤U251细胞,MTT 法检测细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst 33258染色观察细胞凋亡,Western blot法检测Bax、Caspase-3及Bcl-2的表达水平。结果 siXBP1可有效抑制U251细胞增殖,促进细胞凋亡,Western blot显示,siXBP1上调了U251细胞中促凋亡信号分子Bax及Caspase-3的表达,抑制了U251细胞中抗凋亡信号分子Bcl-2的表达。结论 下调脑胶质瘤细胞XBP1基因表达有望为脑胶质瘤的治疗提供理想的分子靶点。     

2-甲氧基雌二醇对神经胶质瘤荷瘤小鼠的抑瘤作用研究

目的 探讨2-甲氧基雌二醇(2-ME)对神经胶质瘤U251细胞移植瘤的增殖抑制、凋亡及可能的分子机制。方法 构建胶质瘤裸鼠移植瘤模型,经2-ME治疗后分别记录移植瘤的重量、体积; 通过移植瘤HE、免疫组化、TUNEL染色分析2-ME对移植瘤的增殖抑制、凋亡及对Bcl-2、VEGF表达水平的影响; 检测2-ME对裸鼠肝肾功能的影响。结果 2-ME对肿瘤的体积和重量均有抑制作用; HE染色显示实验组出现不同程度的肿瘤细胞密度减低; 免疫组化染色显示,随着2-ME水平的升高,肿瘤组织内Bcl-2、VEGF的表达水平逐渐下降; TUNEL染色显示2-ME诱导裸鼠移植瘤组织细胞凋亡; 肝肾功能检测未见损害发生。结论 2-ME在体内能有效抑制胶质瘤移植瘤的生长、诱导其凋亡,其抗肿瘤作用可能与Bcl-2、VEGF表达水平有关,且无明显毒副作用。     

反义hTERT抑制恶性胶质瘤生长的体内外研究

目的 探讨腺病毒介导的反义hTERT在体内外对恶性胶质瘤细胞生长的影响.方法 构建含有hTERT反义序列的腺病毒载体在体内外转染恶性胶质瘤细胞系U251,检测肿瘤细胞生长情况、细胞周期变化、端粒酶活性、hTERT蛋白表达等.结果 腺病毒介导的hTERT反义治疗在体外明显抑制肫瘤细胞生长,增殖减慢,凋亡增多,细胞较多聚集在G1/G0期,转染后第6天细胞生存率为46.9%,端粒酶活性和hTERT蛋白表达都明显下降,在体内实验中肿瘤生长明显减慢.结论 腺病毒介导的反义hTERT在体内外能明显抑制恶性胶质瘤细胞的生长.     

反义AKT2 RNA抑制U251胶质瘤细胞生长的体内外研究

目的 研究反义AKT2RNA对U251人脑胶质瘤细胞在体内外的生长抑制效用。方法 将逆转录病毒pLXSN为载体的反义AKT2构建体转染U251人脑胶质瘤细胞系，应用蛋白印记确定基因转染前后AKT2的表达水平。流式细胞法与Matrigel基质生长实验评价肿瘤细胞转染前后的增殖活性。进一步应用裸鼠皮下荷瘤模型观察脂质体介导pLXSN、pLXSN-AS-AKT2基因治疗对U251细胞生长抑制作用。在28d的观察期内定期测量皮下肿瘤体积，对肿瘤标本应用免疫组化的方法进行AKT2和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达比较。结果 脂质体介导pLXSN-AS-AKT2可显著抑制U251细胞AKT2表达。与对照组和pLXSN转染组比较，细胞周期分析结果表明AK—AKT2转染组进入S期的细胞数减少了8．5％～8．9％，而进入G0＋G1期细胞则增加了7．9％～8．6％。Matrigel基质生长实验显示对照组和pLXSN转染组细胞呈正常形态贴壁生长，而AS～AKT2转染组细胞不能贴壁生长，呈团块状簇集生长。裸鼠皮下荷瘤模型实验显示pLXSN-AS-AKT2显著抑制皮下肿瘤生长，组织病理学分析显示AS-AKT2转染组AKT2表达下降而GFAP表达上调。结论 体内外实验证明反义AKT2方法在抗胶质瘤增殖方面作用重要，AKT2可作为基因治疗胶质瘤的优选靶标。     

雷公藤红素对荷瘤裸鼠移植瘤生长及血管生成的影响

目的：探讨雷公藤红素对荷SHG44胶质瘤裸鼠移植瘤生长及血管生成的影响。方法34只SHG －44胶质瘤裸鼠随机分为空白对照组、顺铂组、4 mg／kg雷公藤红素组、2 mg／kg雷公藤红素组和1 mg／kg雷公藤红素组,每周两次,共给药4周。定期观察肿瘤生长情况测量肿瘤体积,计算抑瘤率。免疫组化染色检测移植瘤组织中的MVD、bFGF、VEGF、VEG‐FR1、VEGFR2的蛋白表达。结果4 mg／kg和2 mg／kg的雷公藤红素能抑制肿瘤生长,下调移植瘤组织中VEGFR1、VEG‐FR2的蛋白表达和降低微血管计数（MVD）,4 mg／kg的雷公藤红素还能下调荷瘤裸鼠移植瘤组织中bFGF的蛋白表达。结论雷公藤红素能明显抑制荷SHG44胶质瘤裸鼠的移植瘤生长和血管生成,其机制可能与雷公藤红素下调肿瘤组织中bF‐GF、VEGFR1、VEGFR2的蛋白表达有关。