重组hIL-31抗体制备及其拮抗皮肤炎症的研究

目的:高效表达重组hIL-31制备IL-31抗体,探讨IL-31抗体拮抗皮肤炎症的作用,为研发IL-31抗体治疗性新药奠定基础.方法:①培养工程苗、IPTG诱导、菌体、超声破碎,用镍NTA柱纯化重组蛋白.②重组hIL-31蛋白溶液加佐剂免疫家兔,制备兔抗IL-31多克隆抗体.③将IL-31抗体分为3个剂量,经皮下注射和皮肤直接涂抹的途径,对已经致皮肤炎症的BALB/c小鼠治疗7d,治疗后3d取治疗部位皮肤作石蜡切片进行HE染色观察组织学变化,并检测血清中IL-6、IL-8、L选择素和MIP-3β等细胞因子的变化.结果:①SDS-PAGE电泳证实获得了高纯度的纯化人IL-31蛋白.②用重组hIL-31蛋白疫苗免疫家兔,在免疫后4周抗体滴度达到高峰,经ELISA法测血清抗体滴度为1:15 000～1:20 000,双扩滴度为1:16.Western blot结果重组IL-31蛋白能与抗IL-31抗体特异性结合.③小鼠皮肤组织切片HE染色显示,治疗组皮下和皮内均有炎症细胞浸润,呈现剂量依赖性趋势.④血清中炎性因子ELISA检测,涂抹组和注射组小鼠血清中IL-6、IL-8、MIP-3β均明显低于阴性对照组(P＜0.05).结论:①获得稳定表达的重组人IL-31蛋白,以此作为免疫原免疫家兔,诱导分泌高滴度的IL-31抗体.②IL-31抗体使皮肤炎症中炎性细胞减少,血清中炎症相关细胞因子明显降低.     

EGFL7的重组表达及其抗体制备和初步应用

目的:新近研究发现EGFL7蛋白与肝癌密切相关。本研究对基因egfl7进行克隆、表达并制备多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础。方法:通过RT-PCR方法,从人肝癌细胞系HepG2细胞中扩增egfl7目的片段,利用基因重组技术构建pET21a(+)-TRX-EGFL7原核表达载体,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。His-tag磁珠纯化试剂盒纯化重组蛋白EGFL7,SDS-PAGE鉴定。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA、Western blot方法检测抗体的灵敏度和特异性,并测定临床血清标本中EGFL7蛋白水平。结果:成功地构建了原核表达质粒pET21a(+)-TRX-EG-FL7。并在大肠杆菌BL21(DE3)内得以高效表达,且以包涵体的形式存在。SDS-PAGE和Western blot证实,重组EGFL7蛋白质与预期结果一致,抗血清能够特异地识别重组蛋白和血清蛋白质。结论:成功制备了EGFL7蛋白质和多克隆抗体,能用于后续研究。     

鼠抗重组人跨膜四蛋白33抗体的制备及其研究

目的 制备鼠抗重组跨膜四蛋白33(TSPAN33)抗体并验证TSPAN33在桥本氏甲状腺炎外周血B细胞中的表达.方法 通过PCR法从霍奇金淋巴瘤细胞的eDNA中扩增TSPAN33基因,并构建到pET32a表达载体中.使用IPTG诱导重组蛋白的表达,通过镍柱亲和层析纯化获得TSPAN33蛋白.以纯化的TSPAN33蛋白混合福氏完全佐剂免疫Balb/c小鼠制备抗体,通过合成TSPAN33胞外区肽段耦联环氧基磁珠,亲和富集抗TSPAN33胞外区特异性IgG,洗脱得抗体用酶联免疫吸附实验(ELISA)和Western blot分别检测效价和特异性.同时使用制备的抗体初步对桥本氏甲状腺炎(HT)患者外周血TSPAN33+B细胞比例进行检测.结果 成功的表达、纯化了TSPAN33重组蛋白,抗TSPAN33蛋白免疫后血清通过固相肽段亲和富集纯化后抗体效价为1∶64 000,Western blot和流式细胞术分析显示该纯化抗体不但能够与TSPAN33蛋白特异性的结合,同时还能够和天然的TSPAN33结合,流式细胞术结果显示HT患者外周血TSPAN33+B细胞比例为(4.71±0.43)％,高于健康组(1.95±0.36)％(P＜0.01).结论 以重组TSPAN33为免疫原,成功地制备高效价、高特异性的兔抗TSPAN33抗体,为进一步进行TSPAN33的检测及其临床应用研究奠定了基础.     

RIK蛋白的重组表达、多克隆抗体制备及其功能的初步研究

目的本研究从MHV68转化得到的小鼠B淋巴瘤细胞中筛选出一种功能尚未明确的蛋白质,暂时命名为RIK。通过对RIK基因克隆、表达和纯化并成功制备其多克隆抗体,并初步探讨其生物学功能,为该蛋白的进一步深入研究奠定基础。方法通过RT-PCR的方法检测B淋巴瘤细胞系和原代B细胞中的RIK m RNA水平,并扩增出RIK的基因片段,采用基因重组技术构建出RIK的原核表达载体,经诱导表达后,利用镍离子柱亲和纯化出RIK重组蛋白,免疫新西兰大耳兔,制备抗RIK多克隆抗体,ELISA和Western blot检测抗体灵敏度和特异性。最后,通过在过表达鼠源RIK的小鼠NIH3T12细胞中,进行MHV68病毒感染实验,初步确定其生物学功能。结果 RT-PCR检测发现RIK在B淋巴瘤细胞系中m RNA水平高于原代B细胞,并且成功构建人源和鼠源重组表达质粒p ET-28a(+)-h/m RIK,实现包涵体形式RIK蛋白的诱导表达纯化和抗体制备,SDS-PAGE和Western blot证实获得的抗RIK多克隆抗体与预期结果一致,能够特异地识别RIK蛋白。同时,研究发现,在小鼠NIH3T12细胞中过表达m RIK蛋白,能够有效的抑制MHV68对该细胞的感染。结论本研究成功实现了RIK的重组表达、抗体制备,并且发现RIK蛋白对于MHV68的感染具有十分有效的抑制作用,实现了对其功能的初步研究,并且为深入研究奠定了基础。     

重组hIL-10在毕赤酵母X-33的表达及其生物活性鉴定

目的:用毕赤酵母表达hIL-10并探索合适的表达条件,为IL-10生物制品研发及临床应用奠定基础。方法:以0.5%甲醇诱导酵母X-33表达rhIL-10,用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定rhIL-10,比较不同温度、不同pH值和有无PMSF条件下rhIL-10的表达水平。用ELISA法测定培养液rhIL-10含量,用Bradford法测定培养液总蛋白含量,计算rhIL-10占总蛋白的比例。以淋巴细胞转化试验分析rhIL-10的生物学活性。结果:SDS-PAGE后可见42 kD左右蛋白条带;Western blot也检测到42kD左右特异性蛋白质条带。pH值为6.0、温度在28℃并加入抑制剂时rhIL-10表达量最高值为20 mg/L,同时段培养液中总蛋白质含量为50 mg/L,rhIL-10占总蛋白比例为40%。在外周血淋巴细胞转化试验中,rhIL-10抑制了淋巴细胞的增殖。结论:hIL-10能在毕赤酵母高效表达,表达产物有较好生物活性;发酵条件对rhIL-10的表达水平影响大,改善发酵条件能促进rhIL-10的表达。     

骆驼重组SpaA-N单域抗体的制备与性质研究

目的:获得特异识别SpaA-N的单域抗体。方法:用His-SpaA-N重组抗原从新疆双峰驼单域抗体噬菌体展示文库中,筛选SpaA-N的结合子。经测序后亚克隆至pET30a并在E.coli BL21高表达,用镍离子亲和层析柱纯化。ELISA分析重组单域抗体的热稳定性,Western blot检测结合特异性。结果:经His-SpaA-N筛选富集后,筛选得到2个目的克隆。构建至pET30a,PCR和酶切鉴定目的基因大小与预计相符。SDS-PAGE显示,Mr 29 000和23 000有特异性目的条带。ELISA检测显示,抗SpaA-N的VHH对SpaA-N重组蛋白具有很好的结合活性;VHH热变性后,经室温复性均可以恢复其抗原结合活性。Western blot显示,重组VHH在Mr 66 000处可以识别丹毒丝菌中存在的表面蛋白。结论:获得了具有热稳定性和特异结合SpaA-N的单域抗体,为进一步研究spaA抗原在丹毒丝菌感染免疫中的作用提供了基础。     

哺乳动物细胞CHO制备重组抗体关键技术研究进展

哺乳动物细胞能够提供复杂的翻译后修饰,表达蛋白性质与天然蛋白接近,使蛋白药物更加稳定有效.自 1987 年 FDA 批准第一个中国新药组织型纤溶酶原激活剂(TPA),哺乳动物细胞广泛应用于重组蛋白的生产,开始了工业化生产之路.在生物制药行业几十年的快速发展中,哺乳动物 CHO 细胞成功生产了众多细胞因子、重组酶、重组抗...     

重组登革病毒2型NS1蛋白的分泌表达及其抗体制备

目的分泌表达重组登革病毒2型NS1蛋白,并制备兔抗NS1多克隆抗体。方法应用毕赤酵母表达系统表达全长登革病毒2型NS1蛋白,制备抗原,免疫家兔;采集免疫血清,制备兔抗NS1蛋白多克隆抗体;应用Western-blot、ELISA法鉴定和检测抗体效价;经辛酸-硫酸铵法、亲和层析法纯化抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度：用Western-blot、ELISA法检测纯化后IgG性质及效价。结果重组NS1蛋白获得分泌表达。其免疫血清经Western-blot、ELISA法证实获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,抗体效价为1：6000。结论重组登革病毒2型NS1蛋白在毕赤酵母真核表达系统中高效表达,纯化产物有较强的免疫原性,成功获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体在登革病毒致病与免疫机制中的作用奠定了基础。     

兔抗重组人钙网蛋白抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备兔抗人钙网蛋白抗体并进行特性鉴定。方法:用PCR法扩增人钙网蛋白(CRT)基因,并克隆至pET32a表达载体中。以重组质粒pET32a/hCRT转化大肠杆菌BL-21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达,通过Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化目的蛋白。以纯化的hCRT为免疫原免疫新西兰大白兔制备抗体,用ELISA法、Westernblot和免疫组化染色法检测抗体的效价和特异性。结果:成功地表达并纯化hCRT重组蛋白。以纯化的重组hCRT免疫新西兰大白兔制备的抗体,ELISA检测其效价为1∶51 200,Western blot分析显示,该抗体能与hCRT特异性结合。免疫组化染色法检测结果表明,该抗体能识别天然的hCRT。结论:以重组hCRT为免疫原,成功地制备效价高、特异性好的兔抗hCRT抗体,为进一步进行钙网蛋白的检测及其临床应用研究奠定了基础。     

小鼠几丁质酶的重组表达和抗体制备

目的: 检测脂多糖(LPS)刺激成骨细胞后, 几丁质酶(chitotriosidase)基因表达变化情况.进行小鼠chitotriosidase的原核和真核表达, 并利用原核表达纯化的蛋白, 制备兔抗鼠多克隆抗体.方法: 用LPS刺激MC3T3-E1细胞, 提取mRNA, 通过RT-PCR获得小鼠chitotriosidase的编码区全长序列, 克隆进pRSET A载体, 转化BL21菌株, IPTG诱导表达.获得的包涵体蛋白用镍柱纯化后, 作为抗原免疫兔子, 制备多克隆抗体.用该抗体检测真核表达的小鼠chitotriosidase蛋白, 并确定抗体的灵敏度和特异性.结果: LPS明显刺激chitotriosidase表达.原核表达的包涵体蛋白经镍柱纯化后也能制备出效果较好的多克隆抗体.结论: 成功地克隆表达了小鼠的chitotriosidase蛋白, 并制备出高灵敏度、高特异性的多克隆抗体, 为进一步阐明chitotriosidase在病理条件下的表达变化和功能提供了一条途径.     

重组人脑髓鞘碱性蛋白及其抗体的研究

将EcoR1和SalⅠ酶切的人脑髓鞘碱性蛋白（MBP）基因cDNA克隆片段与表达载体pGEX-5T重组后转化大肠杆菌，经筛选，增殖和IPTG诱导，阳性克隆SDS－PAGE结果证实表达一条特异42KDa区带，Western印记杂交证实该区带具MBP抗原特异性，免疫斑点杂交和ELISA检测表达产量占菌体可溶性蛋白含量6％，达到414.6mg/L菌液，将含可溶性MBP蛋白的菌液后SDS－PAGE分离纯化得重组MBP抗原，对新西兰兔进行背部皮下多点注射，5次免疫后以琼脂板免疫双扩法检测抗效价达1：16，并通过免疫斑点杂交和Western印亦杂交证实证抗体具抗MBP特异性。     

人IL-31基因克隆、表达及在皮肤炎症中的作用

目的 克隆人IL-31基因,构建原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌中表达,研究hIL-31蛋白与皮肤炎症的关系.方法 采用RT-PCR克隆人IL-31基因,将其克隆到原核表达载体pET28a( ),并通过IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中表达,用该目的蛋白刺激人表皮角质细胞HaCaT,RT-PCR检测趋化因子MIP-3β、TARC及TCA-3(I-309)mRNA的表达;小鼠皮内注射该目的蛋白,观察局部炎症表现,皮肤标本HE染色观察皮肤炎性特征,采血进行白细胞计数及分类,ELISA法检测血清IL-1βIL-6和TNF-α水平,流式细胞仪分析胸腺及脾脏T细胞亚群.结果 成功获得495bp的人IL-31基因,原核表达质粒构建正确,IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中大量表达;该目的蛋白可刺激HaCaT表达趋化因子MIP-3β、TARC、I-309;小鼠皮肤注射部位有脱毛,HE染色可见炎性细胞浸润,外周血白细胞总数增加,中性粒细胞比例增高,血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平增高,脾脏CD4 T细胞百分比增高,CD8 T细胞百分比减少.结论 人IL-31基因克隆及原核表达已获成功,hIL-31蛋白可刺激HaCaT细胞表达MIP-3β、TARC、I-309,诱导小鼠皮肤炎症反应.     

重组hIL-17F原核蛋白表达和生物学活性初步研究

目的:研制hIL-17F/His重组蛋白并初步研究其体外生物学活性。方法:RT-PCR法克隆得到hIL-17F基因序列。将测序正确的hIL-17F基因片段装入PQE3.0原核表达载体构建重组载体hIL-17F/PQE3.0。将该重组载体导入宿主菌M15,经异丙基B-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后产生hIL-17F/His重组蛋白,并用Western blot实验确认。结果:原核表达的hIL-17F/His重组蛋白变性、复性后,经过HiTrapTM亲和层析得到纯品蛋白。体外活性实验表明,该融合蛋白具有上调人巨噬细胞TNF-α、IL-6等分子表达的作用,并促进He-La细胞的增殖。结论:制备了具有生物学活性的hIL-17F/His重组蛋白,为进一步研究该分子独特的生物学功能奠定了基础。     

单链重组抗体的表达及其临床应用

利用ＤＮＡ重组技术，在体外构建Ｆｖ和单链Ｆｖ（ｓｃＦｖ）的重组基因，并连入多种类的表达载体，使重组抗体在原核细胞、哺乳类动物细胞、酵母、噬菌体表达系统中获得表达。体外表达高产量、天然活性的Ｆｖ和ｓｃＦｖ蛋白在临床的诊断、治疗等方面均具有广泛的应用。本文就Ｆｖ和ｓｃＦｖ重组抗体的表达系统和临床应用进行综述     

兔抗重组穿孔素抗体的制备及特性鉴定

目的:制备兔抗重组穿孔素的抗体,检测其免疫反应性,并用于穿孔素的体外功能定位分析。方法:以纯化的全长穿孔素融合蛋白DsbAfulllength免疫新西兰大白兔制备抗血清,用免疫双扩法检测抗血清的效价,Westernblot检测抗血清与5个穿孔素侯选活性区域重组融合蛋白的免疫反应性。将活性重组穿孔素体外作用HIV1SF33感染的MT4细胞后,用免疫组化染色法显示穿孔素作用的部位。结果:用免疫双扩法检测表明,兔抗穿孔素融合蛋白抗血清的效价为1∶32;Westernblot显示,抗血清可与穿孔素各重组融合蛋白发生特异性结合;免疫组化显示,穿孔素作用的部位位于靶细胞的胞质和胞膜。结论:制备的兔抗重组穿孔素融合蛋白的抗体具有较好的免疫反应性和特异性,为穿孔素的深入研究提供了有力的工具。     

人致肺纤维化因子的重组表达和抗体制备

目的:进行人致肺纤维化因子的原核和真核表达,并利用原核表达蛋白制备兔抗人致肺纤维化因子多克隆抗体。方法:人致肺纤维化因子为同一基因的一组可变剪切产物,将其共有cDNA序列(ChS)插入质粒pQE-30,构建ChS-pQE表达质粒,转化大肠杆菌M15,表达菌株经IPTG诱导,获得大量不可溶的包涵体蛋白。以之为抗原免疫新西兰大白兔,制备出多克隆抗体。对该多克隆抗体初步检测证明获得较高滴度和较高特异性的抗体,并用Western blot鉴定这组cDNA连接到pcDNA3.1D载体后在真核细胞的重组表达。结果:原核表达的不可溶性重组蛋白也能成功地制备出多克隆抗体。结论:成功地表达了人致肺纤维化因子,并制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体,人致肺纤维化因子的表达和功能研究提供了一条途径。     

重组荞麦rBTI的多克隆抗体制备及鉴定

目的: 制备重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)的多克隆抗体.方法: 通过大肠杆菌原核表达系统制备高纯度的rBTI蛋白, 免疫大白鼠, 制备多克隆抗体.用Western blot、间接ELISA及免疫细胞组织化学法检测该抗体的效价和特异性.结果: 间接ELISA法检测所制备抗体的效价达1∶ 128 000以上;Western blot显示该抗体能与BTI蛋白特异结合;免疫组织化学法检测结果显示rBTI主要存在于EC9706细胞的胞质和细胞核内.结论: 所制备的大鼠抗rBTI的抗血清具有较高的免疫反应性和特异性, 为rBTI诱导肿瘤细胞凋亡的机制研究及进一步揭示荞麦胰蛋白酶抑制剂的结构与功能的关系提供重要的基础.     

重组hIL-10抗家兔皮肤移植反应中CC、IL-8/CXCL8趋化因子的变化

目的:检测家兔皮肤移植经rhIL-10作用后,血清中CC、IL-8/CXCL8趋化因子的变化,探讨CC、IL-8/CXCL8趋化因子在rhIL-10抗免疫排斥机制中的作用。方法:皮肤移植家兔分6组:①rhIL-10低剂量,②rhIL-10高剂量,③CsA低剂量,④CsA高剂量,⑤rhIL-10+CsA低剂量联合和⑥生理盐水组;每只家兔均于术前1天开始肌注给药,连续注射10天;各组分别于术前1天、术后1、4、7、14、21、28天取外周血,分离血清,以ELISA法检测移植家兔血清CC、IL-8/CXCL8趋化因子水平。结果:(1)术后各组IL-8水平均升高,术后4天、7天⑥组IL-8水平高于各组(P<0.05)。(2)术后各组MCP-1水平明显升高,术后1天、4天,⑥组MCP-1水高于各组(P<0.05),术后7天⑥组MCP-1水平高于①组、⑤组(P<0.05);术后7天、14天CsA抑制组高于联合组(P<0.05)。(3)术后各组MIP-1α明显升高,术后4天⑥组MIP-1α水平高于①、③、⑤组,术后7天⑥组MIP-1α水平高于各组(P<0.05);(4)术后各组MIP-1β水平升高,但同时间段组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CC、IL-8/CXCL8趋化因子在皮肤移植后明显升高,表明在急性排斥反应中发挥了重要作用,随排斥反应加重而进一步增高,皮片排斥后下降,可作为观察和诊断移植排斥的合适标志物。     

HPV16型E7重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E7原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因,克隆至pET21a(+)载体并构建pET21a(+)/HPV16 E7重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化的HPV16 E7重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA检测多克隆抗体的效价,并用Western blot法及免疫荧光技术分析多克隆抗体的特异性。结果 HPV16 E7重组蛋白可通过原核表达系统进行表达和纯化;通过兔免疫后可制备特异性的多克隆IgG抗体,效价达1∶30 000;经Western blot法和免疫荧光染色结果证实兔多克隆抗体可特异性识别HPV16 E7蛋白。结论成功进行了HPV16 E7原核表达并制备了HPV16 E7兔多克隆抗体。     

人Izumo4和Tssk6 cDNA的重组及其多克隆抗体的制备

目的研究Izumo4和Tssk6在精卵融合中的相互作用。方法根据世界卫生组织标准选取的正常精液标本取自内蒙古医科大学附属医院生殖医学中心。SPF级昆明种小鼠5只,雄性,4~6周龄,体质量18~22 g。利用精液提取RNA,克隆人类Izumo4和Tssk6的c DNA序列,原核表达,通过重组质粒p MD-Izumo4、重组质粒p MD-Tssk6转染BL21(DE3)感受态菌制备HIS-Izumo4和HIS-Tssk6;然后通过小鼠腹腔制备小鼠抗人Izumo4和Tssk6腹水多克隆抗体。结果提取的人精子RNA在260 nm光密度值与280 nm光密度值比值为1.86、1.87,提取物无蛋白和杂质。克隆出正确的Izumo4和Tssk6 c DNA序列的p MD-Izumo4和p MD-Tssk6重组质粒。p ET-Izumo4和p ET-Tssk6重组载体在E.coli BL21(DE3)中复制,表达HIS-Izumo4和HIS-Tssk6融合蛋白,其相对分子质量分别位于35 000~45 000、45 000~55 000。2次切胶后,获得较纯的HIS-Izumo4/Tssk6融合蛋白。通过小鼠腹腔免疫,获得可以识别人内源性Izumo4和Tssk6蛋白的小鼠抗人HIS-Izumo4/Tssk6腹水多克隆抗体。结论实验制备小鼠抗人HIS-Izumo4/Tssk6腹水多克隆抗体,可特异性识别人的Izumo4/Tssk6蛋白,可以用于对人HIS-Izumo4/Tssk6蛋白的研究。