重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α分泌型真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的构建重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α的分泌型真核表达载体并检测其在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中的稳定表达。方法以人胚肾293细胞为材料,提取总RNA,用RT-PCR方法合成人tumstatin cDNA,将该cDNA克隆到pGEM-T载体获得重组质粒pGEM-T/tumstatin。利用PCR从pGEM-T/tumstatin和PBV220-TNF-α载体中分别扩增出sig-tumstatin-linker和linker-TNF片段,将其克隆得到sig-tumstatin-linker-TNF片段,sig-tumstatin-linker-TNF片段经酶切后,插入经同样酶切pIRESneo3质粒,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的sig-tumstatin-linker-TNF基因片段及重组载体进行验证。将重组sig-tumstatin-linker-TNF真核表达载体转染到CHO-K1对其表达状况进行检测。结果所获得的sig-tumstatin-linker-TNF片段(1.32kb)序列与报道的序列完全一致。酶切鉴定的结果表明含肿瘤抑素基因的重组pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF表达载体构建成功。转染重组pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF的CHO-K1表达了肿瘤抑素融合蛋白tumstatin-linker-TNF。从生长曲线结果来看,转染pIRESneo3/sig-tumstatin-linker-TNF真核表达载体和转染pIRESneo3的CHO-K1比未转染的CHO-K1细胞的生长速度要慢。结论成功地构建了重组人肿瘤抑素融合蛋白的真核表达载体,并获得能稳定表达人肿瘤抑素融合蛋白的CHO-K1。     

小鼠IL-33基因cDNA克隆与真核质粒的构建与表达

目的克隆小鼠IL-33基因（mIL-33）cDNA构建其真核表达质粒,并转染EL-4细胞检测其表达。方法提取小鼠脑与肺组织总RNA,经逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-33基因cDNA,酶切后插入pcDNA-3.1构建其真核表达载体pcDNA-mIL-33,重组质粒转染EL-4细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。结果 pcDNA-mIL-33中插入的DNA序列测定结果与mIL-33 cDNA序列一致,重组质粒转染EL-4细胞后检测到相应基因表达。结论成功克隆小鼠IL-33基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础.     

重组人肿瘤抑素分泌型真核表达载体的构建及其表达

目的 构建重组人肿瘤抑素分泌型真核表达载体并检测其在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达.方法 以人胚肾293细胞为材料,提取总RNA,用RT-PCR方法合成人tumstatin cDNA,将该cDNA克隆到pGEM-T载体获得重组质粒pGEM-T/tumstatin.以pGEM-T/tumstatin为模板扩增含Ⅳ型胶原信号肽sig基因的sig-tumstatin基因片段,sig-tumstatin 片段经酶切后,插入经同样酶切的pIRESneo3质粒,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的sig-tum-statin基因片段及重组载体进行验证.将重组sig-tumstatin 真核表达载体转染到CHO-K1对其表达状况进行检测.结果 所获得的sig-tumstatin片段(822 bp)序列与报道的序列完全一致.酶切鉴定的结果表明含重组人肿瘤抑素的pIRESneo3/sig-tumstatin表达载体构建成功.转染重组pIRESneo3/sig-tumstatin的CHO-K1分泌表达了重组人tum-statin.另外,从生长曲线结果来看,转染了 pIRESneo3/sig-tumstatin真核表达载体和空载体的CHO-K1比未转染的CHO-K1细胞的生长速度要慢一些.结论 成功地构建了重组人tumstatin分泌型真核表达载体并获得能稳定表达tumstatin的CHO-K1,为开展下一步的实验奠定了基础.     

外源性分化抑制因子Id2在C2C12细胞中的表达

目的：构建大鼠Id2基因真核荧光表达载体,并观察外源性Id2基因C2C12细胞中的表达。方法：RT-PCR扩增出Id2全长cDNA,T4DNA连接酶将载体pGEM-T和Id2cDNA进行连接,构建克隆载体,经限制性内切酶EcoRI酶切pGEM-Id2克隆载体和pEGFP-C2真核表达载体,构建出重组真核表达载体pEGFP-C2-Id2,经酶切分析、PCR鉴定及DNA测序证实cDNA片段大小和序列的正确性;通过电穿孔转染法将外源性Id2基因导入C2C12成肌细胞中。分别于转染4、8、12、24、36、72h后通过荧光倒置显微镜下观察细胞整体情况,并计算转染效率。结果：经酶切分析和序列测定证实pEGFP-C2-Id2含大小正确的正向I（12cDNA片段,获得高转染率和高表达外源性Id2基因的C2C12细胞,转染8h时,转染效率约为（10．5±2．8）％;转染12h后,转染效率约为（20．9±3．1）％;转染24h后,转染效率最高,约为（60．8±3．2）％。结论：成功构建了同时携带有G418筛选位点和Id2基因的真核表达载体;并获得高表达外源性Id2基因的C2C12细胞。     

重叠延伸PCR法构建人肿瘤坏死因子前体水解酶系列突变重组体及稳定转染HeLa细胞株的建立

目的 构建人肿瘤坏死因子前体水解酶(TACE)系列真核表达载体,转染HeLa细胞,建立稳定转染的HeLa细胞系.方法 以THPl细胞eDNA为模板,PCR扩增人TACE基因的全长eDNA编码区序列,将其插入pMD18T载体中,构建出pMD18T-FL-TACE载体.在此基础上,应用重叠延伸PCR扩增出缺失解整合素区的TACE重组cDNA和缺失酶区的TACE重组cDNA,利用DNA重组技术将其分别定向插入真核表达载体plRES2.0-EGFP中,同时TACE全长也构建入pIRES2.0-EGFP,这3种真核表达载体经酶切和测序鉴定后,用脂质体法转染HeLa细胞,经过G418筛选,获得稳定转染的HeLa细胞株,采用RT-PCR、Western blot及荧光法检测表达.结果 成功构建了pIRES2.0-EG-FP/FL-TACE、plRES2.0-EGFP/dis△-TACE、plRES2.0-EGFP/met△-TACE真核表达载体,并建立了稳定转染的HeLa细胞株,成功地表达了目的基因.结论 真核表达载体的构建和稳定转染HeLa细胞株的建立为进一步研究TACE功能奠定了必要的实验基础.     

人肠三叶因子重组真核表达载体的构建及在CHO/dhfr-细胞中的稳定表达

目的：构建人肠三叶因子（hITF）重组真核表达载体,并检测其在CHO/dhfr-细胞中的表达。方法：通过重叠延伸PCR法获得hITF cDNA片段,将目的基因插入真核表达载体pIRES/dhfr,得到重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr;经脂质体介导转染CHO/dhfr-细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO/dhfr-细胞系;用RT-PCR及ELISA法检测hITF的表达。结果：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达了目的基因。结论：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr,并在CHO/dhfr-细胞中分泌表达hITF蛋白,为进一步进行重组hITF的临床前研究奠定良好的实验基础。     

人EGFR基因真核表达质粒的构建及其在293细胞中的表达

目的:构建人表皮生长因子(EGFR)基因真核表达系统,拟为EGFR靶向腺病毒准备包装细胞.方法:用RT-PCR法,从人A431细胞中逆转录出EGFR基因cDNA,插入到pcDNA3.1(+)质粒中,拟构建EGFR真核表达载体,经测序证实.用脂质体将重组质粒转染293细胞,经G418筛选获得稳定表达EGFR重组克隆,用Western blot鉴定转染细胞中EGFR基因的表达.结果:经限制性内切酶酶切及测序结果分析证实EGFR基因已插入重组质粒.Western blot方法证实转基因293细胞中存在人EGFR基因的表达.结论:成功构建的人EGFR/pcDNA3.1(+)真核表达系统能够在293细胞稳定表达.     

Granulysin真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建颗粒溶解素(granulysin)cDNA真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出颗粒溶解素蛋白cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的相应酶切位点,将此重组质粒进行序列测定,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。结果:重组质粒插入基因序列测定证实为颗粒溶解素cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。结论:成功构建颗粒溶解素真核表达载体,为进一步研究其抗结核作用奠定了基础。     

mIL-21／PcDNA3．1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建mIL-21／PcDNA3．1真核表达载体。方法从ConA活化的BALB／c小鼠脾细胞中抽提总RNA,RT—PCR方法扩增小鼠IL-21基因,XhoⅠ和HindⅢ双酶切后克隆入真核细胞高效表达载体pcDNA3．1中,构建小鼠IL-21真核表达载体mIL-21／PcDNA3．1,并经PCR、限制性酶谱分析和DNA序列分析对重组子的正确性进行鉴定。结果构建的小鼠IL-21真核表达载体mIL-21／PcDNA3．1经PCR、限制性酶谱分析和DNA序列分析证明获得了目的基因,其序列与Genbank中登录的小鼠IL-21基因序列完全一致。结论成功构建了。mIL-21／PcDNA3．1真核表达载体,为IL-21分子的进一步研究奠定了基础。     

重组人半乳糖苷结合凝集素-9质粒的构建及表达

目的构建人半乳糖苷结合凝集素-9(Galectin-9)的真核表达质粒pGalectin-9,并检测其表达。方法通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆Galectin-9基因,插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pGalectin-9瞬时转染中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary,CHO)细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法检测Galectin-9的表达。结果 DNA测序和酶切鉴定证明Galectin-9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点;以重组质粒pGalectin-9瞬时转染CHO细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法,在分子和细胞水平证实Galectin-9的表达。结论成功构建pGa-lectin-9的重组质粒,并证实其在CHO细胞中可以成功表达。     

人源性鼻咽癌抗独特型单链抗体基因G22真核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建含人源性鼻咽癌抗独特型单链抗体基因G22的真核表达载体,并观察其在直肠癌细胞(rectal cancer cells,CMT-93)中的表达.方法:将目的基因G22克隆入真核质粒pcDNA3.1( )中构建真核表达载体pcDNA3.1( )-G22,并进行酶切鉴定和DNA序列测定.用脂质体法将重组质粒转染入CMT-93细胞,以Western免疫印迹、流式细胞术和免疫荧光检测G22基因的表达.结果:酶切鉴定和DNA序列分析证实,重组质粒pcDNA3.1( )-G22含有人源性鼻咽癌抗独特型单链抗体基因G22的全长序列,转染实验表明G22基因能在真核细胞CMT-93中正确表达.结论:人源性鼻咽癌抗独特型抗体基因G22真核表达载体构建及其在CMT-93细胞中的表达均获成功,为基因疫苗的进一步研究奠定了基础.     

霍乱肠毒素基因DNA疫苗的构建和体外表达

目的构建霍乱弧菌ctxAB融合基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法用限制性核酸内切酶从原核表达重组质粒pET32a-ctxAB上切下ctxAB基因,导入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-ctxAB。用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxAB转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot对pcDNA3.1-ctxAB的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定。结果真核表达重组质粒pcDNA3.1-ctxAB成功转入NIH3T3细胞,利用免疫荧光技术检测到其在细胞膜和细胞浆中获得瞬时表达,对稳定转染细胞用Western blot分析,发现在约40.5kDa处有阳性杂交信号。结论成功构建霍乱弧菌ctxAB基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中获得表达。     

5-LO真核表达载体的构建及其在RAW264.7细胞中的表达的初步研究

目的构建5-LO真核表达载体并初步研究其在RAW264．7细胞中的表达,为建立5-LO高表达转基因小鼠模型提供表达载体。方法从人全血标本中提取细胞总RNA,以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法扩增5-LO基因,分别构建5-LO目的基因的克隆载体与表达载体,提取质粒,进行酶切、PCR和DNA测序鉴定,将重组融合表达载体pEGFP-5-LO稳定转染RAW264．7细胞,RT-PCR、western blot方法检测pEGFP-5-LO的表达情况。结果构建了重组克隆载体pUCm-5-LO和真核表达载体pEGFP-5-LO,经酶切、PCR及测序鉴定正确;转染细胞后,在荧光显微镜下观察到pEGFP-5-LO融合蛋白的表达,RT—PCR和Westemblot结果表明转染pEGFP．5-LO的RAW264．7细胞中有5-LO的表达。结论成功克隆了5-LO基因,构建的表达载体pEGFP-5-LO在RAW264．7细胞中表达5-LO蛋白,为进一步5-LO高表达转基因鼠模型的建立和临床应用奠定了基础。     

真核表达质粒pDisplay-hGITRaa1-165构建及其在COS-7细胞中的表达

目的:构建含有人GITR胞外段的真核表达质粒pDisplay-hGITRaa1-165,并检测其在真核细胞内的表达。方法:将带有信号肽的GITR基因片段克隆至真核表达载体pDisplay,经酶切鉴定及测序分析,脂质体介导法转染COS-7细胞,通过蛋白质印迹法检测其在COS-7细胞内的表达水平。结果:所构建的真核表达质粒pDisplay-hGI-TRaa1-165转染COS-7细胞后,在其培养上清中检测到目的蛋白的表达。结论:成功表达pDisplay-hGITRaa1-165蛋白,为GITR的生物学功能研究奠定了基础。     

新型基因佐剂SPreS2真核表达载体的构建及其瞬时表达

目的 构建重组真核表达载体pVAX1-SPreS2作为基因佐剂,用以增强或调节弓形虫DNA疫苗的体液及细胞免疫效果。方法 采用重叠延伸PCR技术,扩增乙肝病毒表面抗原S和PreS2基因,引入编码GSGSGS柔性多肽序列作为接头拼接S和PreS2基因,构建重组克隆载体pMD18T-SPreS2和重组真核表达载体pVAX1-SPreS2,分别进行PCR、酶切和测序鉴定;脂质体法将重组载体pVAX1 SPreS2转染人成纤维细胞,建立体外真核细胞瞬时表达系统,SDS-PAGE和Western blot检测重组载体转染HFF细胞瞬时表达状况及其表达产物的免疫活性。结果 PCR、酶切、测序结果表明,重组克隆载体pMD18T SPreS2和重组真核表达载体pVAX1 SPreS2正确构建,融合基因SPreS2在真核细胞中可以瞬时表达,其表达产物具有一定的免疫活性。结论 成功构建重组真核表达载体pVAX1-SPreS2,为增强或调节弓形虫DNA疫苗免疫效果提供一种新型基因佐剂。     

靶向人RIP RNAi真核表达载体构建及在人肝癌细胞Huh7细胞中的表达

目的:构建靶向人RIP的小分子干扰RNA(siRNA)真核表达载体(pSUPERpuro-RIP),在Huh7细胞系中瞬时表达后,检测其对RIP的沉默效果。方法:设计4对含RIP mRNA特异性序列的60 nt DNA链,通过基因克隆技术将其插入真核表达载体pSUPER-puro,构建重组pSUPERpuro-RIP siRNA载体,以EcoRⅠ和HindⅢ双酶切及测序验证其正确性。再瞬时转染Huh7细胞,Western blot检测RIP蛋白表达。结果:酶切测序证实载体构建成功,无碱基突变。Western blot结果表明pSUPERpuro-RIP siRNA在Huh7细胞系中有较好的沉默效果。结论:成功构建了靶向人RIP基因的siRNA载体pSUPERpuro-RIP siRNA。     

CONSTRUCTION AND IMMUNOGENICITY OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 6B L1 RECOMBINANT PLASMID

Objective To construct a DNA vaccine as a prophylactic model to prevent condyloma acuminatum and detect its immunogenicity in mice. Methods The major capsid protein (L1) gene of human papillomavirus (HPV) 6b was inserted into an eukaryotic expression plasmid (pcDNA3.1). The recombinant plasmid was transfected into COS-7 cells. Western blot were performed to detect whether L1 protein can be expressed in eukaryotic cells. Eighteen female BALB/c mice were tested for immunogenicity study. Results The recombinant plasmid (pcDNA3. 1-HPV6bL1) was verified as HPV6b L1 gene by sequencing. Western blot showed specific strip. Anti-L1 protein antibodies could be detected in the mice‘s sera inoculated with pcDNA3.1-HPV6bL1. Similarly, IL-4, IL-2, and IFN-γ were increased in the same mice. Conclusion HPV6b L1 recombinant plasmid was constructed successfully which had immunogenicity for BALB/c mice. It provided experimental evidence for the research of DNA vaccine of condyloma acuminata.