NF-κB p50亚基同源结构域相互作用多肽的筛选

目的：应用酵母双杂交技术筛选获得与核因子κB（NF-κB）p50亚基同源结构域（RHD）相互作用的多肽。方法：应用酵母双杂交技术，以NF—κBp 50 RHD为诱饵，筛选16肽cDNA文库，寻找与其相互作用的多肽，应用β-gal试验、酵母交配试验及一对-酵母回复性杂交等方法筛除假阳性克隆，确定阳性克隆。结果：经酵母双杂交及反复的排查，共获得8个阳性克隆。通过GenBank进行检索，未发现与之相匹配的蛋白序列。结论：获得8个与NF-κB p50 RHD相互作用的新型多肽，多肽的功能需进一步验证。     

核因子-κB p50亚基同源结构域的克隆鉴定及自主报告基因活性的检测

目的：获得NF-κB p50亚基同源结构域(RHD)cDNA及构建酵母双杂交系统的“饵”载体,并检测靶基因的酵母细胞毒性及自主报告基因的活性。方法：提取人外周血单个核细胞(PBMC)的总RNA,以RT—PCR扩增NF—κB p50亚基RHD基因片段,重组入酵母双杂交载体pGBKT7中。应用乙酸锂法,将重组质粒转化酵母细胞AH109,在SD／-Trp选择培养基上培养,观察转化株的生长情况;用滤膜影印法验证靶基因有无自主报告基因的活性。结果：经酶切及PCR鉴定,重组质粒中插入片段的大小与预期的结果相符。测序结果表明,其基因序列正确,无读码框移位,命名为pGBKT7-p50。转化酵母细胞后,对酵母细胞无毒性也无自主报告基因的活性：结论：pGBKT7-p50可作为酵母双杂交系统中的“饵”载体,用于后续的肽库筛选,捕捉与靶基因相互作用的多肽。     

GST Pull-down实验鉴定NF-κB相互作用多肽

目的 体外鉴定NF-κB相互作用多肽与p50和p65间的相互作用。方法 首先构建GST-作用多肽融合蛋白的原核表达载体pET-42a/polypeptide及NF-κB p50和p65亚基保守结构域的原核表达载体pET22b／p50和pET22b／p65，并在大肠杆菌E．coli BL-21中诱导表达，后进行GST pull-down实验验证多肽与NF-κB p50和p65的结合效应。结果 经诱导表达获得了可溶性的GST-多肽融合蛋白和具有DNA结合活性的p50、p65蛋白，GST pull-down实验证实3条多肽与p50发生特异地相互作用。结论 证实3条多肽在体外能与p50发生物理性的相互作用，这为获得靶向NF-κB的功能拮抗多肽工作奠定了基础。     

柯萨奇病毒A16型2 B基因的酵母双杂交诱饵载体的构建及其特性鉴定

目的：构建柯萨奇病毒A16的2B基因的酵母诱饵表达载体,用于筛选与2B相互作用的蛋白。方法 PCR扩增2B全序列,克隆入pGBKT7?BD,将构建好的 pGBKT7?2B转化到酵母细胞 Y2HGold;用Western印迹分析诱饵蛋白的表达,检测诱饵蛋白有无毒性和自激活效应。结果成功克隆了pGBKT7?2B并转化至Y2 HGold中,转化细胞Y2 HGold [pGBKT7?2B]可以表达诱饵蛋白2B,2B蛋白对转化细胞无细胞毒性和自激活效应。结论成功构建了酵母诱饵表达载体pGBKT7?2B,可用于酵母双杂交筛选与2B蛋白相互作用的宿主靶蛋白。     

巨噬细胞移动抑制因子活性抑制肽的筛选和鉴定

目的：巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）参与了多种病理生理过程，如多种类型的感染以及关节炎、肾小球肾炎等自身免疫疾病以及动脉粥样硬化的发生、形成过程。本文将利用酵母双杂交技术从预制随机肽库中筛选能有效抑制MIF活性的多肽，为研制MIF活性抑制剂提供候选分子。方法：利用亚克隆技术，构建“诱饵”载体pGBKT7-MIF。将pGBKT7-MIF与预制随机肽库质粒DNA共转化酵母Y190，进行酵母双杂交实验。从SD／-Leu／-His／-Trp／＋3-AT板上挑取阳性酵母克隆，扩增并提取阳性克隆的质粒DNA，再与pGBKT7-MIF行酵母双杂交以排除假阳性克隆。测定获得的克隆质粒上短肽的编码序列，并分别人工合成一定量的短肽。利用巨噬细胞移动抑制实验和血管内皮细胞成管腔实验测定短肽对MIF活性的抑制作用。     

HSPC238相互作用蛋白RPL5的初步筛选北大核心CSCD

目的:构建HSPC238诱饵载体,筛选与HSPC238相互作用的目标蛋白。方法:基因合成法合成HSPC238基因,sfi IA和sfi IB双酶切后与pGBKT7诱饵载体连接,获得诱饵质粒pGBKT7-HSPC238,经测序鉴定后与酵母双杂交空质粒pGBKT7共同转化到酵母菌株AH109,在营养缺陷培养基中观察pGBKT7-HSPC238的自激活作用,进一步从人胎肝c DNA文库中筛选与HSPC238相互作用的目标蛋白。结果:诱饵载体pGBKT7-HSPC238构建成功,经表型筛选检测无自激活作用,经酵母双杂交技术结合文献分析,从人胎肝c DNA文库中初步筛选发现核糖体蛋白L5(Ribosomal protein L5,RPL5)可能是HSPC238相互作用的目标蛋白之一。结论:成功构建pGBKT7-HSPC238诱饵质粒载体,且经酵母双杂交技术结合文献分析发现RPL5可能是与HSPC238相互作用的目标蛋白之一。     

BI-1作为酵母双杂交系统诱饵的载体构建

目的 用人BI-1完整编码区构建酵母双杂交系统的诱饵蛋白载体,排除自身激活作用,并证实其能否在酵母细胞中的表达,验证它能否用于酵母双杂交系统。方法 以人正常肺组织cDNA为模板,扩增BI-1完整编码区,经EcoRI、SalI双酶切后克隆到酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7上,构建诱饵蛋白载体pGBKT7-BI-1,转化酵母细胞,通过β-半乳糖苷酶活性分析验证有无自激活,Western验证其表达。结果 DNA测序显示BI-1编码区内无突变,β-半乳糖苷酶活性分析显示转入pGBKT7-BI-1和阴性对照的酵母菌落没有激活报告基因LacZ,而阳性对照菌落呈现蓝色。结论 含有BI-1完整编码区的诱饵载体不存在自身激活作用,并能在酵母细胞中表达BI-1蛋白,能够应用于酵母双杂交系统筛选相互作用蛋白。     

酵母双杂交筛选与单剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白

目的 筛选与单剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白.方法 PCR扩增单剪接型2.2 kb HBV剪接特异性新基因TPss并克隆于诱饵载体pGBKT7,在证实TPss蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛查与TPss蛋白相互作用的肝细胞蛋白,进而通过哺乳动物细胞双杂交实验验证候选肝细胞蛋白与TPss蛋白在Huh7和HepG2肝细胞中的相互作用.结果 构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-TPss,Western blot显示其在酵母中表达TPss蛋白.酵母双杂交筛选及哺乳动物细胞双杂交证实TPss蛋白可与4种肝细胞蛋白相互作用,即组织蛋白酶B、微粒体环氧化物水解酶、组织蛋白酶D与纤维蛋白原γ链.结论 TPss可与多种肝细胞蛋白相互作用.     

人肝再生增强因子cDNA的克隆及其酵母双杂交载体的构建

目的：获取人肝再生增强因子（hALR)阅读框的cDNA及构建其酵母双杂交系统的“诱饵”质粒。方法：利用RT－PCR方法，从人胎肝组织中扩增出一约380bp的DNA片段，重组入pGBKT7载体中，构建成pGBKT7-hALR，然后研究此重组质粒在酵母AH109中的表达情况并用于筛选人肝cDNA文库，结果：获得的378bp的DNA序列与文献报道的人ALR序列一致；转化的酵母细菌在选择性培养基SD／-Trp上培养65小时，长出约Φ1mm大小的白色菌落，而在SD／－Trp/-His上不生长；酵母提取液的Western blot分析，证实ALR基因在AH109以融合蛋白的形式表达，并具有免疫活性；初步得到hALR相互作用的阳性克隆。结论：pGBKT7-hALR对宿主菌AH109没有毒性作用，也没有自身激活报告基因，可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”质粒。     

酵母双杂交诱饵载体pGBKT7_pprⅠ的构建及自激活检测

目的构建耐辐射球菌（Deinococcvz radiodurans）R1 pprⅠ蛋白的诱饵表达载体,为应用酵母双杂交系统筛选与pprI相互作用的蛋白建立实验基础。方法PCR扩增pprⅠ基因片段,克隆入诱饵载体pGBKT7中,经测序鉴定后,将构建好的诱饵载体pGBKT7_pprⅠ转化到酵母细胞AH09中,检测诱饵蛋白有无毒性、渗漏和自激活作用。结果成功扩增了pprⅠ基因片段,并克隆入pGBKT7中,测序结果正确。诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,诱饵蛋白无毒性、渗漏和自激活作用。结论成功构建了pprⅠ的酵母诱饵表达载体,为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础。     

早幼粒细胞白血病基因结构域诱饵载体的构建及鉴定

目的 研究早幼粒细胞白血病基因(promyelocytic leukemia,PML)中含环指/B-BOX结构与含coiled-coil结构的两个结构域的功能,构建含其结构域序列的诱饵表达载体,为进一步应用酵母双杂交系统筛选与之相互作用的蛋白建立实验基础.方法 PCR扩增PML的两个结构域序列,克隆入诱饵载体pGBKT7中,经测序鉴定后,将诱饵载体转化到酵母细胞AH109中,检测诱饵蛋白有无毒性,渗漏和自激活作用,同时利用蛋白印迹法分析诱饵蛋白的表达.结果 成功扩增了PML两个结构域的基因片段,并正确克隆入pGBKT7中.诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,其中一个诱饵蛋白BD-PML-B无毒性,但具有渗漏和自激活作用,另一个诱饵蛋白BD-PML-C无毒性,渗漏和自激活作用,蛋白印迹法分析证实酵母细胞表达诱饵蛋白.结论 含环指/B-BOX的结构域具有转录因子活性,全长PML的转录活性与之有关;成功构建了含coiled-coil结构的PML结合域的酵母诱饵表达载体,为运用酵母双杂交技术筛选与之作用的蛋白并探讨其功能奠定了基础.     

LPS诱导MC3T3-E1成骨细胞增殖并增加NF-κB p65蛋白的表达

目的： 研究LPS-NF-κB信号通路在骨形成过程中的作用。方法: MC3T3-E1成骨细胞常规培养,待细胞融合率为80%时,分别加入100 μg/L和500 μg/L LPS处理6 h。流式细胞仪检测细胞周期,计算细胞DNA相对增殖指数;RT-PCR法检测LPS处理成骨细胞后NF-κB mRNA的表达;蛋白质印迹法（Western blotting）检测LPS处理成骨细胞后NF-κB p65蛋白的表达;细胞免疫荧光法检测LPS处理成骨细胞后NF-κB p65的核易位情况;电泳迁移率变动分析（EMSA）LPS处理MC3T3-E1细胞后NF-κB活力的变化情况。结果: 100 μg/L和500 μg/L LPS可诱导MC3T3-E1成骨细胞增殖;LPS处理成骨细胞后NF-κB mRNA的表达与正常组比较无显著变化（P>0.05）,而NF-κB p65蛋白的表达明显高于对照组（P<0.01）;LPS处理成骨细胞后免疫荧光法可明显观察到NF-κB p65从细胞质转移入细胞核,且EMSA结果显示LPS处理组细胞核内NF-κB结合活性增加。结论: 低浓度的LPS可促使成骨细胞增殖,此过程中并不影响NF-κB p65的基因表达水平,但能增加NF-κB p65蛋白的表达并提高细胞核内NF-κB的结合活性。     

甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与宿主蛋白的相互作用的初步研究

目的利用酵母双杂交技术研究甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与人类宿主蛋白的相互作用,为该病毒蛋白的功能研究和致病机制提供理论依据。方法以本实验室分离和鉴定的甲型H3N2流感病毒A／Guangdong／7028／2010为模版,构建pGBKT7-PB1-F2重组载体,利用Y2HGold酵母双杂交系统,从人类通用cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白。结果成功构建含诱饵蛋白基因的pGBKT7-PB1-F2重组载体,转化酵母自激活和毒性实验显示为阴性：酵母双杂交实验显示Y2HGold和Y187酵母的结合率为5．22％,符合实验要求;经筛选和验证后,得到3个与截短型PB1-F2蛋白有相互作用的阳性克隆,分别为钾／钠ATP酶B1亚基、热休克蛋白40和白介素-2受体1亚基。结论初步推断截短型H3N2流感病毒PB1-F2蛋白可能影响流感病毒在宿主细胞中的复制功能和凋亡调控。     

酵母双杂交诱饵载体pGBKT7_ppr Ⅰ的构建及自激活检测

目的 构建耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)R1 ppr Ⅰ蛋白的诱饵表达载体,为应用酵母双杂交系统筛选与ppr Ⅰ相互作用的蛋白建立实验基础.方法 PCR扩增ppr Ⅰ基因片段,克隆入诱饵载体pGBKT7中,经测序鉴定后,将构建好的诱饵载体pGBKT7_ppr Ⅰ转化到酵母细胞AH109中,检测诱饵蛋白有无毒性、渗漏和自激活作用.结果 成功扩增了ppr Ⅰ基因片段,并克隆入pGBKT7中,测序结果正确.诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,诱饵蛋白无毒性、渗漏和自激活作用.结论 成功构建了ppr Ⅰ的酵母诱饵表达载体,为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础.     

NF-κB在脑缺血预处理上调GLT-1表达和诱导脑缺血耐受中的作用

<正>目的:本实验旨在观察NF-κB在脑缺血预处理(CIP)上调GLT-1表达和诱导脑缺血耐受中是否发挥作用。方法:应用Western blot观察GLT-1和NF-κB p50蛋白表达;免疫共沉淀观察NF-κB p50/p65二聚体复合物的表达;电泳迁移率变动分析(EMSA)观察NF-κB DNA结合活性的变化;硫堇染色进行神经病理学评价。结果:在CIP诱导脑缺血耐受过程中,GLT-1表达     

应用酵母双杂交技术筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白

目的: 应用酵母双杂交技术筛选小鼠巨噬细胞中与核因子κB受体激活因子(RANK)蛋白上新基序IVVY相互作用的蛋白,以探寻RANKL/RANK系统中介导破骨细胞形成的RANK下游新信号转导蛋白。方法: 应用GAL4酵母双杂交系统3,构建仅包含编码新基序⁵³⁵IVVY⁵³⁸ 的一小段RANK的cDNA片段为诱饵质粒pGBKT7-IVVY,并与巨噬细胞cDNA文库质粒pGADT7-library共转化AH109酵母,筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白,通过回复性杂交实验验证其可靠性,并对阳性克隆进行测序和基因同源性分析。结果: 筛选出4个可能与IVVY基序有相互作用的蛋白,包括Ring1和YY1结合蛋白(RYBP)、ATP结合盒、E2F转录因子和热休克蛋白8,其中表达RYBP的阳性克隆出现频率高、速度快。结论: 应用酵母双杂交技术成功地筛选出4个可能与IVVY基序相互作用的候选蛋白,其中RYBP可能性最大。     

猪苓多糖对膀胱癌细胞TLR2/4-NF-κB信号通路相关基因影响

目的:研究猪苓多糖(PPS)对膀胱癌细胞(T739)TLR2/4-NF-κB通路相关基因表达的影响及其与TLR2/4关系.方法:应用qRT-PCR、Western blot和流式细胞术(FCM)等方法检测PPS作用T739细胞后IKKB、NF-κB p65、ICAM1和CCL2 mRNA与蛋白表达变化;应用标记探针结合酶联免疫吸附法检测PPS作用T739细胞后NF-κB p65 DNA结合活性改变;应用免疫组化方法观察PPS作用T739细胞后NF-κBp65胞核表达变化.结果:PPS作用T739细胞后,IKBKB(IKKβ)、Rel A(NF-κB p65)、ICAM1和CCL2 mRNA表达均显著下降,IKKB、CCL2蛋白表达也下调,ICAM1蛋白表达无明显变化,并且沉默TLR4后能抑制上述基因表达下调,沉默TLR2作用不明显.同时PPS能减弱T739细胞胞核的NF-κBp65 DNA结合活性及下调NF-κB p65胞核表达;沉默TLR4后能抑制NF-κB p65的DNA结合活性的降低与NF-κB p65胞核表达的下调.结论:猪苓多糖主要经TLR4信号通路抑制相关基因表达、NF-κB p65 DNA结合活性与胞核表达,TLR2信号通路也参与了2个基因表达的介导作用.     

酵母双杂交技术筛选NECL1胞内区的结合蛋白

目的 筛选人源膜表面黏附分子NECL1蛋白胞内区相互作用蛋白。 方法 构建含人NECL1蛋白胞内区氨基酸编码序列的诱饵质粒pGBKT7-NECL1C,对人胎脑cDNA文库进行酵母双杂交筛选。用GST pull down实验进行体外蛋白相互作用的验证。结果 酵母双杂交阳性克隆测序后显示共存在9段不同序列（存在重复克隆）。比对氨基酸序列得到5个可能相互作用蛋白。通过GST pull down 实验验证了其中两个蛋白与NECL1胞内区的相互作用。结论 应用酵母双杂交系统,获得了一些候选的NECL1胞内区相互作用蛋白。     

LPS致大鼠肺泡巨噬细胞NF-κB促进TNF-α分泌

目的: 观察脂多糖（LPS）致大鼠肺泡巨噬细胞（AMs）中核因子NF-κB活性及其调控肿瘤坏死因子-α（TNF-α）分泌的作用。 方法: LPS作用大鼠AMs后，用电泳迁移率改变分析法（EMSA）测NF-κB活性；用特异的反义寡核苷酸阻断NF-κB亚基（p65）后，Western blotting检测p65表达变化；ELISA法检测细胞上清中TNF-α的含量。 结果: 于LPS作用AMs后4 h，NF-κB活性达到峰值，24 h仍维持在高水平；作用后4 h上清中TNF-α的含量达到峰值。反义寡核苷酸阻断NF-κB亚基（p65）表达后，LPS致AMs上清中TNF-α的含量显著低于未阻断组（P<0.01）。结论: LPS致大鼠AMs中NF-κB正向调控TNF-α分泌。