人白细胞介素21在真核细胞中表达及其体外促T细胞增殖作用

目的：构建人细胞因子IL-21表达载体并在Hela细胞中稳定表达，分析rhIL-21体外促T细胞增殖作用。方法：以已构建的pMD-1121为模板，PCR扩增成熟IL-21 cDNA的编码框序列并构建到真核表达载体pCDNA3．1／hismye-B中。挑出阳性克隆进行扩增，脂质体转染入Hela细胞中并以G418加压筛选。有限稀释法、RT-PCR及Western blot筛选出稳定表达的细胞株。培养上清液经金属离子螯合层析分离纯化后，SDS-PAGE、Westem blot鉴定。MIT法测定其与抗CD3单克隆抗体共刺激T细胞增殖活性。结果：SDS-PAGE、Western blot显示Mr为18000的带有myc重组人IL-21融合蛋白(rhIL-21)；并成功地获得hIL-21稳定表达细胞株。rhIL-21融合蛋白具有与抗CD3抗体共刺激T细胞增殖作用。结论：获得具有生物学活性的rhIL-21细胞因子，为进一步研究其功能奠定基础。     

人白细胞介素15cDNA克隆及其在大肠杆菌中表达

从ＬＰＳ活化的人外周血单核细胞总ＲＮＡ中，用ＲＴＰＣＲ方法扩增出编码成熟人白细胞介素１５（ｈＩＬ１５）的ｃＤＮＡ，并将其克隆于ｐＢｌｕｅＳｋｍ质粒中，序列测定结果与预期一致。再将ｈＩＬ１５ｃＤＮＡ克隆于表达载体ｐＢＶ２２０，构建了高效表达克隆ｐＢＶＩＬ１５。热诱导４ｈ，ｈＩＬ１５蛋白表达即达高峰。表达的重组蛋白经ＳＤＳＰＡＧＥ及凝胶密度扫描分析，分子量约１３ｋＤ，占菌体总蛋白的３３％，经包涵体提取及ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１００凝胶过滤纯化，重组蛋白纯度达９５％以上，具有显著的促鼠Ｔ淋巴母细胞增殖作用     

人白细胞介素18 cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达

白细胞介素１８（ＩＬ－１８）是１９９５年克隆的一种新型细胞因子，又称ＩＦＮ－γ诱导因子，主要由活化的巨噬细胞产生，其相对分子质量（Ｍｒ）为１８　３００［１、２］。ＩＬ－１８可诱导ＴＨ１细胞产生ＩＦＮ－γ和ＧＭ－ＣＳＦ等细胞因子，增强ＮＫ细胞和ＣＴＬ的活性［１、２］，促进ＩＬ－２介导的Ｔ细胞增殖；增强ＴＨ１等细胞产生ＴＨ１类细胞因子［３、４］；促进免疫细胞表达ＦａｓＬ，增强Ｆａｓ介导的细胞毒作用等多种生物学功能［５］，在抗病原微生物感染﹑抗肿瘤及抗超敏反应等方面具有潜在的应用前景。因此，我们采用Ｒ…     

人白细胞介素—15cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从正常人外周血中分离粘附的单核细胞，加入ＬＰＳ刺激４ｈ后提取细胞ｍＲＮＡ反转录获得ｃＤＮＡ第一链，用两对特异引物进行巢式ＰＣＲ扩增出含ＢａｍＨＩ酶切位点的编码人１Ｌ－１５成熟蛋白的ｃＤＮＡ，其大小约３６０ｂｐ。用ＰＥＧ法回收其片段并将其连接到ｐＢＳＳＫ载体的ＳｍａⅠ位点上进行序列分析，结果表明其序列与文献报道一致。然后再将其片段亚克隆插入到ｐＧＥＸ－２Ｔ的ＢａｍＨＩ位点。筛选插入方向正确的克隆，转化大肠杆菌ＪＭ１０９，以１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导５ｈ收集菌体直接进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，与阴性对照相比，ＭＷ４４ＫＤ处多出一条带，紫外扫描显示此带占菌体蛋白总量的８．８％。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ证实此带能够特异地与兔抗人ＩＬ－１５的抗体发生反应。证明ＲＴ－ＰＣＲ所得的人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ在大肠杆菌中获得了表达，为进一步探讨人ＩＬ－１５的生物学作用打下基础。     

小鼠白细胞介素21 cDNA的克隆及真核表达质粒的构建

目的：克隆小鼠自细胞介素2l(IL-21)基因，构建真核表达质粒，用以进行肿瘤的基因治疗。方法：用RT-PCR法。从ConA活化的小鼠T细胞中扩增IL-21 cDNA。克隆人哺乳动物细胞高效表达质粒pcDNA3．1中，构建重组mIL-21真核表达质粒。重组体用载体上的通用引物和PCR下游引物为测序引物，鉴定克隆的正确性。将已鉴定的重组质粒用脂质体法转染Sp2／0细胞，用RT-PCR法鉴定转染细胞中IL-21基因的表达，用MTT比色法检测表达的mIL-21诱导的NK细胞杀伤活性的增强。结果：正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1／mIL-21，并在转染的细胞中检测出IL-2l的表达，表达的mIL-21可在体外增强NK细胞的杀伤活性：结论：成功地构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1／mIL-21，为进一步在肿瘤动物模型中进行IL-21基因治疗及疗效观察奠定了基础.     

大鼠白细胞介素10(IL-10)cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:克隆大鼠白细胞介素10（IL-10）cDNA的全长序列,并使其在大肠杆菌中表达,为其分子生物学利用奠定基础。方法:无菌条件下切取大鼠的脾脏,收获脾细胞,用LPS刺激培养4h;提取细胞的总RNA,用RT-PCR技术克隆IL-10cDNA的全长序列;经测序后将IL-10cDNA插入表达载体 pJW2,转染 DH5α细胞后进行热诱导表达并对表达蛋白进行测定。结果:脾细胞经LPS刺激后IL-10转录水平增加,从提取的RNA易反转录并扩增出期望的PCR产物,测序结果表明得到的IL-10CDNA序列与基因库报告的序列完全一致。将其插入表达载体pJW2后经热诱导顺利表达出蛋白分子量与文献报道一致。Western-blot分析表明表达的条带可与小鼠抗大鼠IL-10抗体特异性结合。结论:大鼠的IL-10cDNA全长序列被成功克隆,克隆序列能够在大肠杆菌中表达。     

人白细胞介素13cDNA克隆及序列分析

人白细胞介素１３ｃＤＮＡ克隆及序列分析范灵芝，杨新科，段淑敏，刘彦仿，侯云德白细胞介素１３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１３，ＩＬ－１３）是近年来发现的一种新的免疫调节介质［１］，它主要由激活的Ｔ淋巴细胞产生，具有调节单核细胞及Ｂ淋巴细胞的功能，在病毒免...     

人白细胞介素-3基因cDNA的克隆及其真核表达质粒的构建

目的:克隆人白细胞介素-3(hIL-3)基因cDNA,构建其真核表达质粒pcDNA3/hIL-3。方法:从人外周血单个核细胞中提取IL-3mRNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增IL-3基因cDNA,通过T/A克隆法,首先构建pUCm-T/hIL-3,然后构建其真核表达型载体pcDNA3/IL-3。结果:pUCm-T/hIL-3内插入片段序列与hIL-3基因序列一致;pcDNA3/IL-3经酶切鉴定与预期结果一致。结论:成功完成了hIL-3基因克隆和pcDNA3/IL-3真核表达质粒的构建。     

小鼠白细胞介素17A的克隆、表达及活性鉴定

目的:克隆小鼠白细胞介素17A(mIL-17A)基因,构建mIL-17A原核表达质粒在E.coil Rosetta(DE3)PlysS表达,得到有活性的mIL-17A蛋白。方法:提取人IL-1β免疫的小鼠胸腺总RNA,反转录成cDNA,以此为模板,根据GenBank报道的mIL-17A序列设计引物,进行巢式PCR,得到成熟mIL-17A的编码序列并构建到pMD18-T载体中,再亚克隆至原核表达载体pHisSUMO Express中,经DNA测序鉴定后转化Rosetta感受态细胞,IPTG诱导表达,Western blot鉴定。纯化后的蛋白处理3T3-L1前体脂肪细胞,real time PCR鉴定白细胞介素6(IL-6)的表达变化。结果:DNA测序证明所克隆基因序列与GenBank报道的完全一致。成功构建了pHisSUMO Express-mIL-17A原核表达质粒以包涵体形式表达了重组mIL-17A蛋白,且Western blot证实为目的蛋白。所得蛋白上调3T3-L1细胞表达IL-6。结论:获得具有生物活性的mIL-17A蛋白,为进一步研究其蛋白特性及其生物活性奠定基础。     

白细胞介素-15及其受体

白细胞介素-15(IL-15)是一种新发现的细胞因子,其生物学性质与IL-2相似。IL-15的受体由IL-15Rα、IL-2Rβ、IL-2Rγ组成,其中IL-2Rγ是参与IL-15信号传递过程的必要成分。IL-15和IL-2的体内表达及受体分布存在差异预示着IL-15在体内具有独特的生物学作用。     

人细胞角蛋白8(CK8)基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆人细胞角蛋白8(CK8)基因cDNA并在大肠杆菌中表达CK8蛋白产物。方法:运用DNA重组技术,设计CK8基因特异引物,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从人肝细胞癌7721细胞中扩增CK8编码区cDNA,将其插入克隆载体pMD18-T simple vector中,获得重组质粒pMD18-CK8,转化感受态大肠杆菌DH5α。继而采用PCR技术从重组质粒pMD18-CK8中扩增出约1500bp目的片段,再次级克隆到原核表达质粒pET-28a(+)载体中,获得pET-28a-CK8重组原核表达质粒;经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21(DE3)菌株,在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE电泳及Western blot检测CK8蛋白表达水平。结果:成功建立了人CK8基因cDNA重组体的无性繁殖系。②在原核细胞中成功地表达出人CK8蛋白,该蛋白具有很好的免疫原性。结论:运用原核细胞基因工程技术成功构建和表达了人细胞角蛋白8(CK8)基因,为进一步研究CK8的基因型及探讨该基因编码的CK8蛋白的性质和生物学活性创造条件。     

rhIL-15表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 获得rhIL-15基因工程菌，方法 从肺癌细胞株A549中提取细胞总RNA，用RT-PCR法扩增编码人IL-15成熟区基因的片段，经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，插入融合表达质粒pGEX-4T-2的相应酶切位点，构建重组融合蛋白表达质粒，并转化感受态大肠杆菌BL2l而得到工程菌。结果 重组质粒插入片段核酸序列测定的结果，与文献报道的IL-15蛋白成熟区的核酸序列相一致，该工程菌所表达的融合蛋白多数以包涵体的形式存在，占菌体蛋白总量的39%。复性后，纯化的rhIL-15蛋白经MTT比色法初步测定，具有促进CTLL-2细胞增殖的能力，结论 获得了具有生物学活性的rhIL-15高效表达菌株。     

小鼠canstatin cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:从小鼠肝脏组织克隆canstatin cDNA并在大肠杆菌(E.coli)中表达, 为进一步研究其抗肿瘤血管生成活性奠定基础。方法: 用Trizol试剂提取小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-PCR扩增小鼠canstatin(m canstatin)的cDNA,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将小鼠canstatin cDNA 定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中, 在大肠杆菌E.coli BL21中经IPTG诱导表达。结果:小鼠canstatin的cDNA长度为684bp,编码227个氨基酸,与已知的人canstatin的cDNA同源性为89%,氨基酸的同源性为96%。IPTG诱导原核表达载体pET30a(+)/m canstatin在大肠杆菌E.coli BL21中表达。结论: 首次成功克隆了小鼠canstatin的cDNA, 其原核表达载体pET30a(+)/m canstatin在大肠杆菌E.coli BL21中高效表达,小鼠canstatin抗肿瘤血管生成活性有待进一步研究。     

大鼠IL-6受体基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：获取大鼠IL－6受体（IL－6R）的基因并高效表达。方法：用PCR技术，从正常成年大鼠脑的cDNA文库中，获得编码IL－6R基因的序列。测序后，通过PCR扩增和基因重组，分别构建IL－6R基因全长和羧基端部分编码序列的表达载体，并导入大肠杆菌DH5α中，通过IPTG诱导表达重组融合蛋白。对表达的羧基端序列编码的融合蛋白过谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化。结果：获得正常成年大鼠I-6R(98-1493位）的基因，测序结果与已发表的基因序列相一致。重组蛋白以包涵体的形式进行表达。经SDS－PAGE分析，在相对分子质量（Mr)为74000和43000处，各有1条特异的蛋白带。对羧基端基因表达的包涵体形式的蛋白进行变性、重折叠及纯化后，得到了庙纯度融合蛋白。结论：成功地克隆正常成年大鼠IL－6R基因，并在E.coli DH5α中高效表达，为进一步制备抗IL－6R抗体和进行原位分子杂交研究创造了条件。     

FSHR胞外区基因片段的原核表达及多克隆抗体的制备

目的 构建人卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)胞外区的原核表达载体,并用纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备抗血清.方法 采用RT-PCR克隆人FSHR胞外区,将其克降到原核表达载体pET32a(+),并通过IPTG诱导目的 基因在大肠杆菌中表达,所获得的包涵体蛋白通过Ni-NAT离子交换柱层析纯化重组蛋白,并用SDS-PAGE和蛋白印迹法鉴定.结果 PCR扩增出1 047 bp目的 基因片段,测序证实克隆的基因序列与GenBank中的FSHR序列相符.工程菌pET32 a(+)/FSHR胞外区经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,Mr约为58 000,与预期的一致.其表达形式为不溶性包涵体,此包涵体蛋白通过Ni-NAT离子交换柱层析纯化,纯化的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带.该蛋白免疫小鼠制备抗血清,抗体效价为1:12 800,Western blot检测证实该抗体能与目的 蛋白发生特异性结合.结论 获得了人FSHR胞外区融合蛋白及特异性多克隆抗体,为进一步研究FSHR蛋白的功能奠定了基础.     

hIL-1Ra基因的克隆及在原核细胞中的表达

目的 :克隆hIL 1Ra基因并在大肠杆菌中高效表达。方法 :从人外周血中分离白细胞并提取其总RNA。用RT PCR获得hIL 1RacDNA ,克隆入pBV2 2 0表达载体进行诱导表达。对表达产物进行复性和纯化。结果 :成功地构建了pBV2 2 0 IL 1Ra表达载体 ,并在大肠杆菌中获得高效表达 ,表达量占全菌的 4 0 %。对表达产物进行分离纯化及活性分析表明 ,获得纯度大于98%的样品。该样品具有明显抑制IL 1刺激EL 4细胞分泌IL 2的作用。结论 :在大肠杆菌中成功地表达有活性的hIL 1Ra基因 ,为进一步的开发利用奠定了实验基础。     

人白介素1受体拮抗剂的cDNA克隆和原核表达

从活化的正常人外周血单核细胞中提取总ＲＮＡ，经逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）获得了人白介素１受体拮抗剂（ＩＬ－１Ｒａ）ｃＤＮＡ。经过ＤＮＡ测序分析，发现该片段和国外发表的ＩＬ－１ＲａｃＤＮＡ序列一致，将该目的基因插入ｐＢＶ２２０载体，并转入大肠杆菌ＨＢ１０１中，经热诱导表达重组蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后发现，菌体超声裂解后，在可溶性上清中有一Ｍ１７０００的特异带，约占菌体可溶性总蛋白的８０％以上     

人白细胞介素32基因的克隆表达及其生物学活性的研究

目的:克隆人白细胞介素32(hIL-32)基因,构建高效稳定的hIL-32大肠杆菌表达菌株,并对纯化的目的蛋白进行生物学活性的初步测定.方法:将人外周血单个核细胞( PBMC)经刀豆素A( Con A)刺激60 h后提取细胞的总RNA,通过逆转录聚合酶链式反应( RT-PCR)从刺激的PBMC中扩增出hIL-32的基因,通过基因克隆技术,构建hIL-32在pET-30 a(+)中的重组质粒pET30a-hIL32,用IPTG进行诱导,得到hIL-32的原核表达蛋白;采用Ni2+ -NTA亲和层析方法纯化目的蛋白;应用ELISA方法检测纯化蛋白诱导人PBMC产生IL-6的情况.结果:序列测定表明,hIL-32基因核苷酸长度为567 bp,编码189个氨基酸.重组质粒pET30 -hIL32转化至大肠杆菌BL21( DE3),重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量(Mr)为28 000的重组蛋白,表达的重组蛋白IL-32可促进人PBMC产生IL-6,浓度达到(127±4.8)ng/L,而对照组IL-6的浓度仅为(25±2.3)ng/L.结论:成功克隆了hIL-32基因并构建了高效且稳定表达hIL-32基因的大肠杆菌菌株,且表达的目的蛋白能诱导IL-6细胞因子的产生.     

人La多肽融合蛋白在E.coli中的表达

目的　构建在E .coli中表达人La多肽的质粒。方法以人脾cDNA为模板 ,通过PCR获得La多肽 (全长 )的DNA片段。将此片段利用双酶切定向克隆到MBP(麦芽糖结合蛋白 )融合系统的载体pMALTM c中 ,表达可溶性融合蛋白 ,并通过亲和层析予以纯化。结果免疫印迹实验 (IBT)证明 ,表达的融合蛋白具有La抗原多肽的特异性 ,而敏感性超过生化制备的ENA制品。结论重组融合蛋白与天然ENA制品存在免疫学同一性