重组人IL-11的原核表达、纯化和鉴定

以本实验室构建的pET24a-hrIL-11表达载体为模板,PCR扩增重组人白细胞介素11(hrIL-11)的基因,克隆入pET21a表达载体,转化BL-21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生hrIL-11/His融合蛋白,并经Western blot实验确认。原核表达的hrIL-11/His融合蛋白经变性后,利用亲和层析纯化,目的蛋白纯度达95%以上。纯化后蛋白经尿素梯度复性后,比活达到1×106 IU/mg。研究结果为进一步研究该蛋白在促进血小板增殖等方面的作用奠定了基础。     

重组人leptin的复性、纯化和免疫学及生物学活性鉴定

对重组人leptin(rh-leptin)蛋白进行复性及纯化,并鉴定其免疫学及生物学活性.将由大肠杆菌(E.coli)重组表达获得的rh-leptin,复性、纯化后进行SDS-PAGE电泳和Western印迹杂交鉴定其特异性,并通过Km小鼠减肥实验及胃肠推进率测定实验检验其生物学活性.结果表明通过对rh-leptin进行复性和纯化,获得了高纯度的具有免疫学和生物学活性的rh-leptin蛋白,可供进一步研究应用.     

人白细胞介素18(hIL-18)的纯化及生物学活性的鉴定

目的：在大肠杆菌中高效表达重组人IL-18(rhIL-18)蛋白，制备具有高纯度、高活性的rhIL-18。方法：用IFTG诱导重组蛋白表达载体pKK223-3／hIL-18进行蛋白表达；菌体经超声破碎分离包含体，并对包含体进行洗涤、变性和复性处理，用DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换柱纯化复性的rhIL-18；以人外周血单核淋巴细胞，通过T细胞增殖实验、^125I-UdR标记的细胞毒实验、ELISA方法检测细胞因子的产生量等方法，测定rhIL-18的生物学活性。结果：在大肠杆菌中成功地诱导、表达了rhIL-18，SDS-PAGE凝胶电泳分离显示在分子量大约18．3kD处有一诱导蛋白带，Western blot证明表达产物与抗IL-18单克隆抗体有特异性免疫反应；表达产物经纯化后纯度达94％；表达的rhIL-18蛋白具有促进T细胞增殖、增强NK细胞细胞毒作用及诱导外周血单核淋巴细胞合成IFN-γ的能力，基本上具有天然IL-18相同的生物学活性。结论：为rhIL-18的获得及为进一步研究其生物学功能提供了一定的条件，并为将rhIL-18用于肿瘤的免疫生物治疗奠定了基础。     

重组人白细胞介素18的纯化及其生物学活性研究

目的：纯化rhIL-18并对其生物学功能进行初步研究。方法：采用优化的包涵体提取技术和Sephacryl S-200分子筛层析纯化rhIL-18,利用MTT染色法研究rhIL-18对NK细胞促杀伤作用和对外周血单个核细胞（PBMC）的促增殖作用,采用半定量RT－PCR方法研究rhIL-18诱导IFN－γ基因的表达情况。结果：得到纯度达96％的纯品rhIL-18,复性的rhIL-8可以明显地促进PBMC增殖,增强NK细胞细胞毒活性。结论：得到纯度较高、具有较好生物学功能的rhIL-18,可用于进一步的研究。     

小鼠白细胞介素17A的克隆、表达及活性鉴定

目的:克隆小鼠白细胞介素17A(mIL-17A)基因,构建mIL-17A原核表达质粒在E.coil Rosetta(DE3)PlysS表达,得到有活性的mIL-17A蛋白。方法:提取人IL-1β免疫的小鼠胸腺总RNA,反转录成cDNA,以此为模板,根据GenBank报道的mIL-17A序列设计引物,进行巢式PCR,得到成熟mIL-17A的编码序列并构建到pMD18-T载体中,再亚克隆至原核表达载体pHisSUMO Express中,经DNA测序鉴定后转化Rosetta感受态细胞,IPTG诱导表达,Western blot鉴定。纯化后的蛋白处理3T3-L1前体脂肪细胞,real time PCR鉴定白细胞介素6(IL-6)的表达变化。结果:DNA测序证明所克隆基因序列与GenBank报道的完全一致。成功构建了pHisSUMO Express-mIL-17A原核表达质粒以包涵体形式表达了重组mIL-17A蛋白,且Western blot证实为目的蛋白。所得蛋白上调3T3-L1细胞表达IL-6。结论:获得具有生物活性的mIL-17A蛋白,为进一步研究其蛋白特性及其生物活性奠定基础。     

白细胞介素4生物学功能研究进展

ＩＬ－４丰富多彩的生物学功能，日益受到人们的重视。本文对ＩＬ－４体内的生物功能，ＩＬ－４在细胞因子网络中的调节作用等新近研究成果进行综述。     

重组人白细胞介素10在毕赤酵母中的表达及生物学活性测定

目的在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人白细胞介素10(rhIL-10),用于IL-10的生理功能研究和动物试验。方法通过PCR扩增IL-10基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点处,再将融合基因αIL-10重组到表达质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,SalⅠ酶切线性化重组质粒IL-10/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的基因IL-10,甲醇诱导rhIL-10的表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定目的蛋白,用ELISA定量测定及MC/9细胞分析IL-10生物学活性。结果成功构建了重组表达质粒IL-10/pPIC9K,获得了4个含IL-10基因的高拷贝毕赤酵母转化子,甲醇诱导后,在摇瓶水平的IL-10表达量为(0.627±0.09)mg/L,比活性为1.5×105U/mg。结论毕赤酵母分泌表达的IL-10具有良好的生物学活性。     

重组人白细胞介素—15的纯化及生物活性鉴定

目的探讨人白细胞介素15的纯化工艺和进行活性鉴定。方法将rhIL-15工程菌大量扩增后通过包涵体提取、复性、凝胶过滤、阴离子交换层析、高效反相液相色谱等技术进行纯化。结果经纯化得到rhIL-15,其分子量为14.4kD,蛋白纯度为99％以上,比活为1×107U/mg,对NK细胞杀伤活性具有明显的促进作用。结论通过三步纯化方法可以获得高纯度、高回收率和高生物学活性的rhIL-15,且具有明显的促NK细胞杀伤活性。     

用包涵体复性的方法制备重组人白细胞介素-1受体拮抗剂

通过大肠杆菌将IL-1ra表达成包涵体,将包涵体用8M尿素溶解后,稀释4倍后直接用离子交换柱层析进行复性和纯化,复性后得到的IL-1ra纯度大于95%,生物活性大于1×105IU/mg,内毒素含量也比较低。Western-Blotting印迹也表明重组蛋白具有IL-1ra的抗原活性。     

可溶性白细胞介素15受体α亚单位的原核表达、纯化及生物学活性鉴定

目的:对鼠白细胞介素15受体α亚单位(IL-15Rα)的胞外区段,即可溶性IL-15Rα(sIL-15Rα)进行原核表达及纯化,并测定其配体结合能力及相应生物学功能.方法:采用RT-PCR方法,以鼠脾脏细胞总RNA为模板扩增编码sIL-15Rα的基因片段,经测序确证后与原核表达载体pQE-30连接,所得重组表达质粒pQE-30 /sIL-15Rα转化E.coli M15构建表达重组子.通过降低诱导温度和IPTG浓度的方式实现重组蛋白的可溶性表达,金属镍螯合的Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白,并经SDS-PAGE和Western blot验证.采用固相受体结合分析法测定重组蛋白与IL-15间的亲和力,并以CTLL-2细胞为靶细胞测定重组蛋白的生物学活性.结果:成功构建了重组表达质粒pQE-30 /sIL-15Rα,并在25℃、0.5 mmol/L IPTG条件下实现了重组蛋白的可溶性表达.所得重组蛋白的相对分子量约为29 kD,纯度大于95%,与IL-15之间的亲和力为4.9×10-11 mol/L,具有显著的协同IL-15促CTLL-2细胞增殖效应.结论:获得了功能性的重组蛋白sIL-15Rα,为深入系统地研究IL-15Rα的独特生物学性状,以及开展IL-15靶向性的研究工作奠定了基础.     

重组人B淋巴细胞刺激因子纯化及其生物活性鉴定

目的 获得高纯度和高活性的B淋巴细胞刺激因子。方法 重组原核表达载体pQE-80L-BLyS112-285在大肠杆菌DH5a中经IPTG诱导表达rhBLyS112-285，超声碎菌，提取包涵体，经Ni^2 -NTA亲和层析和Sepharcryl S-200凝胶过滤层析纯化后，选择不同氧化还原条件进行复性，进而检测其生物学活性。结果 得到了有较高纯度和较好生物学活性的rhBLyS112-285蛋白。结论 优化了BLyS蛋白的纯化和复性的参数，所获结果为进一步研究创造了条件。     

人肿瘤抑素相关T21RGD肽的表达与纯化

目的 构建引入RGD序列人肿瘤抑素相关21肽（T21RGD）―内含肽―几丁质结合蛋白融合表达载体，实现目的肽的几丁质珠亲和层析一步纯化。方法 人工设计合成T21RGD肽基因， 经重组定向克隆插入到原核表达载体pTYB2，酶切和测序鉴定正确后转化入大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导其融合表达，对表达蛋白进行几丁质珠亲和层析，DTT诱导柱上裂解以获得T21RGD肽。经Trcine-SDS-PAGE和反相高效液相色谱(RP-HPLC)对纯化产物进行鉴定。结果 质粒酶切和测序结果显示，含T21RGD肽基因按正确方向和序列插入质粒,融合蛋白表达量达菌体蛋白总量的50％以上，Trcine-SDS-PAGE显示了T21RGD肽目的条带与预期相符，反相高效液相色谱测定峰纯度达97％。结论 成功构建T21RGD肽融合表达载体，实现了融合蛋白在大肠杆菌中高效表达和T21RGD肽几丁质珠亲和层析一步纯化，为进一步研究T21RGD肽抗肿瘤活性和作用机理奠定基础。     

hIL-15成熟肽段基因的克隆及其原核表达载体的构建

本文采用ＲＴ ＰＣＲ的方法自成人脾脏中扩增出ｈＩＬ １５成熟肽段基因，定向克隆入ｐＵＣ１９中，筛选带有插段的阳性克隆。经序列测定证实后，插入大肠杆菌融合表达载体ｐＧＥＸ ４Ｔ １中，构建重组表达质粒ｐＧＩＬ １５。ＳＤＳ ＰＡＧＥ证实ｐＧＩＬ １５大肠杆菌中可表达分子量为３８６ｋＤ的融合蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的１８５％。目的蛋白经纯化后具有促进靶细胞ＤＮＡ合成的作用。     

人腺苷激酶在大肠杆菌中的表达与纯化

目的诱导人腺苷激酶重组蛋白在大肠杆菌中表达,并对表达的重组蛋白进行纯化。方法将由人腺苷激酶基因开放阅读框与原核表达载体pET30a（＋）连接构建的重组蛋白表达载体pET30a（＋）／ADK转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）感受态细胞。1mmol／L的1PTG诱导重组蛋白表达。离心收集菌体后结合使用溶菌酶、冻融和超声破碎的方法裂解菌体。用含2mol／L和4mol／L尿素的结合缓冲液洗涤包涵体去除部分杂蛋白。随后用含8mol／L尿素的结合缓冲液变性溶解剩余包涵体沉淀。用Ni—NTA柱通过亲和层析纯化重组蛋白,用含8mol／L尿素的洗脱缓冲液洗脱。收集样品透析复性。结果成功构建人腺苷激酶原核表达载体且目的蛋白以包涵体形式表达。经包涵体洗涤、变性溶解,亲和层析及分步透析复性获得纯度达85％以上的重组蛋白。结论人腺苷激酶表达载体的成功构建以及重组蛋白的纯化,为进一步进行其结构和功能的研究奠定了基础。     

小鼠B细胞趋化因子原核表达与纯化

用多聚酶链反应 (PCR)扩增小鼠 B细胞趋化因子 (BL C)基因片断并导入 Bam H1和 Pst1两个酶切位点 ,插入到原核表达载体 PQE30中 ,构建重组质粒 p BL C- PQE30 ,并诱导相对分子量为 10 Kda的重组目的蛋白r BL C的表达 ,通过 Ni柱亲和层析纯化目的蛋白。双酶切和测序分析显示小鼠 B细胞趋化因子片断正确插入原核表达载体 PQE30中 ,重组蛋白 Western blot分析显示出特异性条带。提示已通过基因工程方法获得并纯化了小鼠B细胞趋化因子重组蛋白。     

重组人IL-2在E.coli中的高效表达诱导因素及其纯化的研究

表达人IL-2的E.coli pETI-2/MM294在色氨酸饥饿的培养基中发酵,加入一定量的3—吲哚乙酸诱导其trp启动子,可以使rlL-2的表达量高达总菌体蛋白量的19％。高水平表达的rlL-2以不溶性的包含体形式存在于E.coli的胞浆中。通过破碎细菌、变性抽提和使rlL-2复性后,再经CM-SephadexC-50、DEAE-SephadexA-50、SephadexG-75等一系列层析步骤纯化,最终得到的rlL-2纯度达90％以上,比活性为7.21×10~5μ/mg,总回收率为10.5％。     

含人基质金属蛋白酶组织抑制因子-1重组腺病毒的构建与体外表达

从人肝癌组织中提取总RNA，RT—PCR合成hTIMP-1的全长cDNA，克隆到腺病毒载体AdEasy系统的穿梭质粒pAdTraek—CMV上，与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183受体菌中进行同源重组，成功构建含hTIMP-1全长eDNA的重组腺病毒载体，经293细胞的包装、扩增，生成含hTIMP-1基因的重组腺病毒AdhTIMP-1并实现体外表达，为进一步研究肝癌浸润和转移机理以及肝癌的基因治疗提供实验基础。     

人内皮抑素基因改造、表达、纯化及活性检测

目的克隆诱变的人内皮抑素(human endostatin,hES)氨基端基因,并检测其活性。方法双酶切已诱变的人内皮抑素基因,电泳回收氨基端片段,与质粒pTYB-2重组,转化E．coli BL-21(DE3)。通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验,MTT实验,HE染色及流式细胞术检测重组小分子人内皮抑素对新生血管生成、细胞增殖和细胞凋亡的影响。结果基因重组小分子内皮抑素对鸡胚尿囊膜新生血管生成具有明显的抑制作用;对脐静脉内皮细胞和肝癌细胞增殖的抑制存在量效关系;作用24h后,观察到细胞凋亡现象;与对照组相比,细胞凋亡数增加。结论成功构建了人内皮抑素氨基端基因工程菌,得到了具有生物活性的氨基端小分子内皮抑素,为便利临床应用奠定了基础。