藻酸钠复合自体软骨细胞修复猪关节软骨缺损的近期效果

目的:采用藻酸钠自体软骨细胞混合物修复猪的关节软骨缺损,观察近期成骨效应。方法:实验于2004-03/2005-04在中山大学附属第二医院实验中心完成。3个月龄的小型猪8只,取其关节软骨进行细胞原代培养,获取原代细胞后,分别进行免疫组织化学法检测细胞Ⅱ型胶原表达。然后对8只小型猪的32个关节进行动物关节缺损的模型建立,每个关节共造3个人工缺损,选择关节左右随机对照。将已经培养好的软骨细胞与已经配制好并消毒的藻酸钠混合,移植到猪的关节软骨缺损处。每只猪关节内注射3个实验点,1个用藻酸钠/细胞混合液为实验组,1个单纯支架材料为单纯材料对照组,1个缺损做空白对照组,模型中缺损区均为关节负重区,胶原纤维绿色(亮绿复染)。修复所用细胞为自体软骨体外培养后,进行移植修复,采用3代体外培养软骨细胞,均匀混和藻酸钠后,行自体移植。8周后取实验关节进行大体观察、苏木精-伊红染色、Masson染色、免疫组织化学法染色观察及O’driscoll组织学评分。结果:纳入小型猪8只,除其中1例因手术切断伸直肌腱而使猪关节活动障碍,其余均未见手术后关节活动障碍,所有手术无术后感染,无关节内感染,无动物死亡。移植的软骨细胞在藻酸钠载体中生长良好,形成透明软骨。根据O’driscoll组织学评分标准,实验组32个猪关节缺损修复的组织学评分为(20.25±1.64)分,高于单纯材料对照组的(7.46±1.29)分及空白对照组的(6.00±2.09)分。免疫组织化学染色可见修复软骨以表达Ⅱ型胶原为主,无Ⅰ型胶原。结论:藻酸钠复合自体软骨细胞作为软骨移植的替代物是可行的,远期效果还有待进一步研究。     

富血小板血浆复合软骨细胞构建可注射性组织工程化软骨

背景：富血小板血浆中含有大量的生长因子,因此其在骨再生、创伤愈合等方面得到了较多的应用,然而其在组织工程软骨的研究报道较少。 目的：观察富血小板血浆对软骨细胞增殖和分化的影响,以及富血小板血浆复合软骨细胞构建组织工程化软骨的可行性。 方法：检测兔全血、富血小板血浆及激活富血小板血浆中转化生长因子β、胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子BB及表皮生长因子的浓度。将兔软骨细胞在分别含10％,15％,20％,30％富血小板血浆的DMEM培养液中培养7d,CCK-8法检测细胞增殖,QT-PCR检测细胞内II型胶原、蛋白聚糖、Sox-9的表达。在兔皮下注射自体富血小板血浆与软骨细胞复合物,6周后取材进行组织学检测。结果与结论：富血小板血浆中各生长因子浓度高于全血（P〈0．05）,激活富血小板血浆中各生长因子浓度高于富血小板血浆（P〈0．05）。不同浓度富血小板血浆均能促进软骨细胞的增殖,且20％浓度内呈浓度依赖性。20％浓度组促II型胶原表达的能力强于其他浓度组（P〈0．05）,15％浓度组促Sox-9和蛋白聚糖表达的能力强于其他浓度组（P〈0．05）。富血小板血浆一软骨细胞复合物移植后,新生组织呈软骨样并有明显的软骨陷窝,细胞外富含软骨样基质,表明其作为可注射性支架用于软骨组织工程。     

AdLacZ基因修饰山羊耳软骨细胞复合F127构建组织工程化软骨

目的:应用AdLacZ基因修饰体外培养的山羊耳软骨细胞,并与Pluronic F127支架材料复合,观察裸鼠皮下软骨形成的情况,为进一步应用软骨分化因子基因修饰重建软骨的研究提供参数。方法:实验于2004-11/2006-12在上海交通大学医学院附属第九人民医院完成。①实验材料:取健康雄性山羊,体质量26～30kg。6周龄BALB/c裸鼠24只,体质量20g。体外培养山羊耳软骨细胞,转染AdLacZ基因,检测基因转染效率。②实验方法:将基因修饰的细胞与可吸收生物材料PluronicF127混合形成细胞-生物材料复合物,并注射到6只裸鼠皮下,每只在其背部皮下分别接种2个点,分别在术后2,4周取材,每个时间点有标本6例。另取裸鼠18只,同样设计,分别以未转基因的软骨细胞-材料复合物、单独注射的软骨细胞、或单独注射的F127支架作为对照组,每组6只。③实验评估:标本行苏木精-伊红染色、阿利新蓝染色,并对4周标本行X-gal染色,Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。结果:纳入BALB/c裸鼠24只,均进入结果分析。①50pfu/细胞可以获得80%的转染效率。②2周时细胞-材料复合物形成了不成熟的软骨样组织,苏木精-伊红染色显示外周呈纤维样组织包裹,中部大部分为不成熟的软骨细胞;4周实验组中央部位出现少量稍成熟的软骨,阿利新蓝染色显示该部位为深蓝色的巢状软骨,部分细胞有Ⅱ型胶原阳性表达。冰冻切片X-gal染色提示细胞来自于植入的软骨-材料复合物。对照组未转基因的软骨细胞-材料复合物,其组织学及Ⅱ型胶原免疫组织化学表现与实验组没有明显差别,而X-gal染色为阴性。单独注射软骨细胞或单独注射F127支架,在4周内则均未见到软骨形成。结论:腺病毒载体可向软骨细胞高效转移目的基因,F127支架材料是软骨再生较为理想的支架材料。     

深低温冻存软骨细胞构建组织工程化软骨

目的 :研究深低温冻存的软骨细胞作为种子细胞构建组织工程化软骨的能力。方法 :取 2周龄新西兰兔关节软骨细胞 ,经深低温冻存、复苏及体外培养 ,取第 3代对数生长期培养细胞 ,制成细胞悬液 ,调整其为 5× 10 7个 / ml左右 ,接种于 PGA三维支架材料上 ,复合物体外培养 1周 ,移植于裸鼠皮下 ,术后 12周取材 ,行大体及组织学观察。结果 :经深低温冻存的软骨细胞与新鲜的软骨细胞一样形成了预定形态的软骨结构 ,组织学观察有软骨生成及基质分泌 ,单纯PGA支架及单纯的细胞悬液无软骨组织生成。结论 :经深低温冻存的软骨细胞保持了分裂增殖及合成基质的能力 ,可用于组织工程构建组织工程化软骨     

外源性软骨细胞在组织工程化软骨组织形成中的作用

目的：观察腺病毒介导的绿色荧光蛋白(green fluorescent protem，GFP)标记软骨组织工程种子细胞的可行性，探讨外源性软骨细胞在组织工程化软骨组织形成中的作用。方法：实验于2002-01／08在解放军第一军医大学实验室完成。腺病毒GFP表达载体以巨细胞病毒(CMV)为启动子转染体外培养软骨细胞作为种子细胞与poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)(PHBHH)复合后植入兔体内，术后一定时间取材，确定组织工程化组织的表型，观察GFP的表达。结果：以CMV为启动子的腺病毒GFP载体能有效转染体外培养软骨细胞，转染效率达53．66％。携带GFP的软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞，6周和12周形成的组织工程化组织中检测到GFP表达，经苏木精一伊红染色、免疫组织化学检查和特殊染色确定获取的组织为软骨组织，且与未转染软骨细胞形成的组织工程化软骨组织形态学一致。结论：腺病毒介导的GFP能有效转染体外培养软骨细胞，外源性软骨细胞是体内组织工程化软骨组织形成的源细胞。     

藻酸钙复合材料构建组织工程化骨及软骨的实验

背景：软骨组织工程的两个关键问题是种子细胞和支架材料，保证支架材料上有足够数量的功能细胞是体内形成骨和软骨组织的基础。目的：对经体外培养的骨髓基质干细胞与藻酸钙载体及生长因子复合形成的组织工程性骨及软骨进行形态学观察。设计：细胞形态对比，观察12周实验结果。单位：郑州大学骨科研究所，上海第二医科大学骨科实验室。对象：实验于2001—09／2002—06在上海第二医科大学骨科实验室完成。3月龄雄性新西兰大白兔9只，平均体质量3．2kg。方法：复合材料分别为：①藻酸钙。②藻酸钙＋骨髓基质细胞。③藻酸钙＋骨髓基质细胞＋类胰岛素生长因子Ⅰ。④藻酸钙＋骨髓基质细胞＋转化生长因子β。⑤藻酸钙＋骨髓基质细胞＋转化生长因子β＋类胰岛素生长因子Ⅰ。将5种组合注射于同一个体新西兰火白兔背部不同部位皮下组织中，每组各注射2处，共10处，每处0.2mL，分别做好标记。按组分别于术后4，8，12周取材，各时间点处死动物3只，取兔背部皮下增殖物进行骨和软骨组织生成物观察，应用苏木精-伊红、甲苯胺蓝、Masson、番红-O染色技术。主要观察指标：兔背部皮下增殖物的组织学观察。结果：兔背部皮下增殖物的组织学观察结果：4周时可见藻酸钙＋骨髓基质细胞＋类胰岛素生长因子Ⅰ、藻酸钙＋骨髓基质细胞＋转化生长因子β、藻酸钙＋骨髓基质细胞＋转化生长因子β＋类胰岛素生长因子Ⅰ组有岛状软骨样组织形成，软骨细胞包绕于碱性基质中，8周时复合物中形成大量的类软骨结构，并部分向骨组织转化，细胞周围有大量的基质分泌，部分软骨细胞呈簇状分布。12周时藻酸钙＋骨髓基质细胞＋转化生长因子β＋类胰岛素生长因子Ⅰ组软骨组织基本转变为骨组织，并开始吸收。结论：骨髓基质细胞-藻酸钙-生长因子复合材料能形成软骨及骨组织。藻酸钙适合骨髓基质细胞生长，是一种良好的骨及软骨组织工程载体。     

外源性软骨细胞在组织工程化软骨组织形成中的作用

目的:观察腺病毒介导的绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)标记软骨组织工程种子细胞的可行性,探讨外源性软骨细胞在组织工程化软骨组织形成中的作用。方法:实验于2002-01/08在解放军第一军医大学实验室完成。腺病毒GFP表达载体以巨细胞病毒(CMV)为启动子转染体外培养软骨细胞作为种子细胞与poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)(PHBHH)复合后植入兔体内,术后一定时间取材,确定组织工程化组织的表型,观察GFP的表达。结果:以CMV为启动子的腺病毒GFP载体能有效转染体外培养软骨细胞,转染效率达53.66%。携带GFP的软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞,6周和12周形成的组织工程化组织中检测到GFP表达,经苏木精-伊红染色、免疫组织化学检查和特殊染色确定获取的组织为软骨组织,且与未转染软骨细胞形成的组织工程化软骨组织形态学一致。结论:腺病毒介导的GFP能有效转染体外培养软骨细胞,外源性软骨细胞是体内组织工程化软骨组织形成的源细胞。     

藻酸钙凝珠复合自体软骨细胞修复成年兔关节软骨缺损

背景:软骨缺损的修复一直是骨科界的难题之一,近几年发展起来的应用组织工程学技术修复软骨缺损的方法,逐渐被认为是一种有希望治疗关节软骨缺损的手段.目的:应用藻酸钙凝珠一自体软骨细胞移植修复兔膝关节软骨缺损,观察损伤近期修复情况.方法:成年新西兰大白兔30只,左膝取软骨细胞,右膝造模.采用体外培养后的第3代自体软骨细胞复合海藻酸钠凝胶,混入CaCl2溶液中制成串珠状凝珠,体外培养4周.实验组植入海藻酸钙凝珠-自体软骨细胞复合物,对照组植入不含细胞的海藻酸钙凝珠,空白组不做任何处理.结果与结论:纳入新西兰大白兔30只,除其中1只术后单侧膝关节僵硬强直外,其余均未见手术后关节活动障碍,所有动物术后无感染,无死亡.苏木精一伊红染色可见,实验组修复组织以透明软骨为主,对照组以纤维软骨修复为主,空白组修复不明显,以纤维软组织修复为主.免疫组织化学染色可见实验组修复组织以表达II型胶原为主,对照组Ⅱ型胶原免疫组化着色较淡,Ⅱ型胶原表达量少.空白组修复组织不表达Ⅱ型胶原.结果提示藻酸钙凝珠-自体软骨细胞修复软骨缺损有较好效果,表明自体软骨细胞复合藻酸钙凝珠能为软骨组织工程提供一种很好的思路.     

组织工程软骨细胞体外培养技术要点

通过组织工程技术，采用自身软骨细胞体外增殖构建软骨来修复关节软骨损伤，在临床上已成为一种有效的新方法。近年来，有关体外软骨细胞培养技术的研究较多。通过对入选文献进行分析、整理，对影响体外构建软骨的因素包括培养空间、应力、细胞密度和氧张力等方面进行分析，体外采用三维多条件联合培养软骨细胞可以改善构建软骨的生物品质。但是影响软骨细胞生长的因素众多复杂，在体外如何更好地构建软骨，有待进一步研究。     

组织工程化软骨的低温保藏

背景:如何保存大量的具有生物活性的组织工程化软骨,并且长时间保持组织工程化软骨的生物活性,建立组织工程软骨库,是组织工程尚待解决的课题.目的:观察低温冻存对组织工程化软骨生物活性的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-02/2008-12在解放军第四军医大学唐都医院中心实验室完成.材料:聚羟基乙酸无纺网为美国Albany公司产品.2周龄新西兰白兔5只,成年新西兰白兔20只由解放军第四军医大学实验动物中心提供.方法:体外培养2周龄新西兰兔关节软骨,取第2代对数生长期培养软骨细胞,制成细胞悬液,调整软骨细胞悬液浓度约为5×1010L-1,接种于聚羟基乙酸三维支架材料上,复合物体外培养1周后冻存,冻存4,8,12周后解冻复苏.1周后接种于成年新两兰兔皮下,术后12周取材.主要观察指标:采用光镜及扫描电镜观察冻存复苏后的组织工程化软骨的生长情况.采用四唑盐比色法测定细胞存活率.体内实验观察软骨细胞形态、软骨分泌胶原情况、基质分泌酸性黏多糖情况.结果:经低温冻存的组织工程化软骨生长良好,冻存4,8,12周细胞存活率差异无显著性意义.组织学观察冻存组织工程骨植入区有软骨生成、胶原和黏多糖生成丰富.结论:深低温冻存对组织工程化软骨的生物活性无明显的影响,可用于保存组织工程化软骨.     

管状支架体外静态培养组织工程气管软骨

背景:前期实验已证实人气管软骨细胞在DegraPol片状支架上保持了正常的形态和活力,同时分泌软骨特有基质成分.目的:以大鼠剑突软骨细胞为种子细胞种植于DegraPol管状泡沫支架,观察新形成的工程化组织在体外静态培养条件下的组织和力学特点.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-12/2008-02在深圳市人民医院医学研究中心完成.材料:DegraPol管状材料为瑞士联邦理工大学聚合材料研究所提供:实验动物为2周龄体质量50～60g的SPF级SD幼鼠.方法:收集第3代幼鼠剑突软骨细胞接种于DegraPol管状支架,形成软骨细胞-支架复合物,体外静态培养6周.主要观察指标:①AO/PI荧光染色观察软骨细胞在DegraPol管状泡沫支架中的存活情况,于培养3,6周取出软骨细胞-DegraPol支架复合体,MTT法测定细胞增殖情况.②培养3,6周,应力-应变机械力学方法测定最大应变和应力的变化.③培养3,6周,扫描电镜观察软骨细胞在DegraPol支架中培养后的超微结构.结果:①AO/PI荧光染色显示软骨细胞在DegraPol支架内保持良好的活性,MTT法结果显示培养6周组A值高于培养3周组(P<0.05).②应力-应变机械力学测定结果显示,培养3周组应力值和应变值高于培养6周组(P<0.05).③扫描电镜结果显示DegraPol支架与大鼠剑突软骨细胞有良好的生物相容性,培养6周后获得更多的软骨细胞增殖和更多的细胞外基质.结论:DegraPol管状泡沫支架有良好的生物相容性并且软骨细胞在支架上保持正常活性,但由于工程化复合物的生物力学强度较差,培养条件和培养方式有待进一步改善.     

Construction of tissue-engineered cartilage with BMP7 gene-transfected chondrocytes

In this study, the expression of bone morphogenetic protein-7 (BMP7) was investigated in tissue-engineered cartilage constructed using chondrocytes transfected with the BMP7 gene and that constructed using non-transfected chondrocytes after 7, 14, 21 and 28 days. The volume of the BMP7 gene-transfected tissue-engineered cartilage culture after 5 - 7 days was 9 x 9 x 2 mm, while that of the non-transfected tissue-engineered cartilage culture was 8 x 8 x 2 mm. Histomorphological analysis showed that both cultures comprised cartilaginous tissue. Both BMP7 mRNA and BMP7 protein were expressed in BMP7 gene-transfected cartilage culture grown in vitro for 7, 14, 21 or 28 days. The chondrocytes in the BMP7 gene-transfected cartilage culture were active, with increased mitochondria, Golgi bodies and rough endoplasmic reticulum compared with non-transfected cartilage. These results provide an ideal foundation for the study of BMP7 gene-transfected tissue-engineered cartilage transplantation in the repair of cartilaginous defects.     

体外动态环境培育组织工程心血管补片的特点

背景：搏动性生物反应器可以提供体外动态培育环境，给血管组织补片以血流剪切力和培养液的波动灌流，模拟体内血流动力学环境。 目的：观察体外动态培育环境下肌成纤维细胞在组织工程心血管补片材料中的生长特点。 设计、时间及地点：对比观察实验，于2007-01／12在暨南大学第二临床医学院中心实验室完成。 材料：新生儿脐带组织为产妇自愿捐献，并对实验内容知情同意。聚-4-羟基丁酸酯为Tepha公司产品。 方法：应用液氮冷冻保存的人脐带血管壁肌成纤维细胞种植在聚-4-羟基丁酸酯材料构建的补片支架材料上，体外动态培育制备组织工程心血管补片。动态组织培育组：细胞-组织材料复合物先体外静态培育14d，再置入生物反应器中继续动态组织培育7d。静态组织培育组：细胞-组织材料复合物体外静态培育21d。 主要观察指标：①行苏木精-伊红染色对组织补片进行形态学分析。②补片组织扫描电镜观察其超微结构。③应用免疫组织化学对比分析样本中Ⅰ型胶原蛋白、alpha平滑肌肌动蛋白的合成情况。 结果：苏木精-伊红染色显示动态培育的聚合材料表面完全被有序的层状致密组织覆盖。静态培育的材料表面组织形成较少。扫描电镜检测显示，动态培育的补片材料表面组织致密平整，细胞、组织呈轴向性排列。而静态培育的材料表面组织均一性较差，细胞、组织轴向性排列差。免疫组织化学染色显示动态培育环境下补片材料中有更多的胶原蛋白、alpha平滑肌肌动蛋白合成。 结论：动态培育环境可显著促进肌成纤维细胞在补片材料中的增殖及合成细胞外基质。     

聚己内酯-聚乙二醇共聚物复合软骨细胞构建组织工程化软骨

目的:观察聚己内酯-聚乙二醇共聚物与兔关节软骨细胞在体外复合培养以及体内植入后异位成软骨情况。方法:实验于2006-01/06在北京积水潭医院骨科研究所完成。①实验材料:3周龄新西兰白兔1只,SPF级4～6周龄BALB/C-nu/nu裸鼠7只,雌雄不限,聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物(由清华大学机械系提供)。②实验干预:取兔双膝及股骨头关节软骨,通过酶消化法获取软骨细胞,进行原代和传代培养;将聚己内酯-聚乙二醇载体材料切成小块,乙醇浸泡并三蒸水冲洗后晾干,60Co辐照灭菌;收集第3代软骨细胞,以3×10~(10)L-1浓度接种于6片材料上,孵箱中培养1周。③实验分组:将7只裸鼠随机分为材料细胞复合组5只,背部植入培养1周的材料细胞复合物,单纯材料组2只,植入单纯材料。④实验评估:对第3代软骨细胞通过甲苯胺蓝染色进行鉴定;通过倒置显微镜和扫描电镜观察软骨细胞在载体材料上的生长增殖情况;材料种植于体内6周后取材,进行大体观察和组织学观察。结果:①关节软骨细胞形态学观察和鉴定:1～3代软骨细胞形态基本一致,大多呈多角形,少数为梭形,核圆且清晰可见,3代以后软骨细胞形态变宽变扁。甲苯胺蓝染色证实第3代软骨细胞胞浆内呈蓝紫色异染颗粒。②软骨细胞在载体材料上的生长增殖情况:细胞接种于材料1d后,倒置显微镜下观察,可见细胞以单个、多层或团状形式吸附在材料表面。电镜观察:细胞形状为圆球形,贴附在材料表面。③体内植入物大体和组织学观察:体内植入6周后,材料细胞复合组材料孔隙间形成透明软骨组织,单纯材料组材料孔隙间为纤维组织充填。结论:聚己内酯-聚乙二醇共聚物可以作为软骨细胞生长的支架载体,可以异位构建组织工程化软骨,材料的降解性还需要继续观察。     

骺板软骨细胞的体外培养及鉴定

目的:建立体外培养及鉴定骺板软骨细胞的方法。方法:实验于2005-03/2006-05在苏州大学附属儿童医院骨科实验室完成。选用3只生后14～28d的新西兰幼兔,空气栓塞处死,暴露股骨下端和胫骨上端,分别取2处的骺板组织,将其剪切成1～3mm3的小块,经胰蛋白酶消化,接种于含150g/L牛血清的1640培养基中,饱和湿度培养,传代。①细胞接种后3h在倒置显微镜下观察细胞生长情况,见细胞贴壁后每天观察2次。②第2代细胞达到80%～90%左右汇合时采用常规苏木精-伊红染色,光镜观察细胞爬片情况。③第3代细胞爬片至细胞达到80～90%左右汇合时,采用苏木素染色3min,3%亮绿染色5min,蕃红花“O”染色5min,光镜观察细胞产生蛋白聚糖情况。④采用PCR检测细胞Ⅱ型胶原的表达。⑤采用四唑盐MTT比色法检测细胞活性。结果:①骺软骨细胞刚接种后呈大小不等之圆形悬浮于培养液中,3h后见大部分细胞贴壁,24h后贴壁细胞呈短梭形、圆形、三角形和不规则形,见细胞分裂相。48h后见细胞伸展明显,细胞分裂相每高倍镜视野可见多个。经隔日换液细胞生长至第5天,细胞呈聚集生长,达到汇合状态,将细胞传代。接种后第1代细胞2d后呈梭形,培养4d传至第2代,第2代细胞长满瓶底后,90%呈胞膜较厚的圆形,10%为梭形,第3代、第4代亦如此。传至第5代见肥大细胞增多,细胞松散,折光性减弱,呈凋亡状态。②细胞爬片后观察骺软骨细胞形态以梭形居多,同时也有圆形、三角形和不规则形。可见细胞分裂及细胞中的分泌小泡。③见细胞呈红色,无绿色,证明蕃红花“O”-亮绿染色阳性,显示所培养的细胞可以分泌蛋白聚糖。④PCR检测术所养细胞含有Ⅱ型胶原,电泳带在440bp上。⑤四唑盐MTT比色法检测显示,第3代骺软骨细胞的生长曲线近似倒“S”形,在第4,5,6天细胞呈对数生长,约在7,8,9,10d达平台期,至第12天细胞出现生长抑制。结论:建立了骺板软骨细胞的体外培养方法,并证实所培养出的细胞分泌蛋白聚糖和Ⅱ型胶原,具有软骨细胞的共同特点。     

同种异体软骨细胞直接体内构建组织工程软骨的实验研究

目的:研究兔同种异体软骨细胞直接在体内构建组织工程化软骨的可行性。方法:获取个月龄兔耳郭软骨,分离消化后将软骨细胞种于1PDLLA上形成复合物,6h后植于兔皮下,分别于,,周取材行大体和组织学61218观察以及苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色和Masson's三色染色。结果:体内培养6周后,软骨细胞/PDLLA复合物中有基质分泌,软骨细胞不成熟,12周时,软骨细胞接近成熟并形成凹陷,18周时,新生软骨基本接近正常软骨。结论:利用同种异体软骨细胞直接构建组织工程化软骨的方法可以在动物体内形成新的软骨。     

复合骨髓基质细胞的藻酸钙凝珠体外培养特征

背景载体材料是种子细胞生长微环境的重要组成部分,有实验进行了软骨细胞在藻酸钙凝胶载体中的长期体外培养.目的观察骨髓基质细胞复合藻酸钠形成的藻酸钙凝珠体外培养扩增后其细胞活力、组织形态学和细胞超微结构的变化.设计单一样本观察.单位郑州大学骨科研究所,上海第二医科大学骨科实验室.材料实验于2001-09/2002-03在上海第二医科大学骨科实验室完成.4～6周龄新西兰大白兔8只用于骨髓基质细胞提取.方法取白兔8只,麻醉后,用肝素预处理过的16号穿刺针于股骨第3转子下抽取骨髓1.0～2.0 mL,用于骨髓基质细胞培养,传代培养的骨髓基质细胞;制备藻酸钠溶液;藻酸钠复合骨髓基质细胞形成藻酸钙凝珠,细胞密度为1×109 L-1,体外培养4周.①骨髓基质细胞活力观察采用锥虫蓝染色,倒置相差镜下观察.②骨髓基质细胞组织学检测采用甲苯胺蓝染色.③骨髓基质细胞超微结构观察采用透射电镜检查.主要观察指标①骨髓基质细胞活力.②骨髓基质细胞组织学观察.③骨髓基质细胞超微结构观察.结果①骨髓基质细胞活力倒置相差显微镜下可见细胞为圆形,大小不一,部分细胞呈团状分布,胞核清楚,个别为双核细胞,几乎无蓝染细胞.②骨髓基质细胞组织学观察结果细胞与材料均匀混合,材料无着色;细胞均匀着色,大小不一,核大浆少,个别为双核或多核细胞,可见细胞分裂相;细胞结构完整、轮廓清楚,周围有少量的异染性反应.③骨髓基质细胞超微结构结构正常,无线粒体肿大及核糖体脱颗粒现象发生;胞核完整,形态幼稚且较大,呈圆形、椭圆形或不规则形,可见双核.结论①复合骨髓基质细胞的藻酸钙凝珠亲水性好,营养物质易于渗透,适合细胞生长、增殖.②骨髓基质细胞增生分裂能力活跃,通过体外培养,使体内骨髓基质细胞实现数目扩增是可行的.③藻酸钙复合骨髓基质细胞用于组织工程方法修复骨软骨缺损具有可行性.     

A mixed co‐culture of mesenchymal stem cells and transgenic chondrocytes in alginate hydrogel for cartilage tissue engineering

To regenerate articular cartilage tissue from degeneration and trauma, synovial mesenchymal stem cells (SMSCs) were used in this study as therapeutic progenitor cells to induce therapeutic chondrogenesis. To accomplish this, chondrocytes pre‐transduced with adenoviral vectors carrying the transforming growth factor (TGF) β3 gene were selected as transgenic companion cells and co‐cultured side‐by‐side with SMSCs in a 3D environment to provide chondrogenic growth factors in situ. We adopted a mixed co‐culture strategy for this purpose. Transgenic delivery of TGF‐β3 in chondrocytes was performed via recombinant adenoviral vectors. The mixed co‐culture of SMSCs and transgenic chondrocytes was produced in alginate gel constructs. Gene expression in both SMSCs and chondrocytes were characterized. Biochemical assays in vitro and in vivo showed that release of TGF‐ß3 from transgenic chondrocytes not only induced SMSC differentiation into chondrocytic cells but also preserved the chondrocytic phenotype of chondrocytes from suspected dedifferentiation. As a result, this mixed co‐culture strategy in conjunction with TGF‐ß3 gene delivery could be a promising approach in cartilage tissue engineering. Copyright © 2012 John Wiley & Sons, Ltd.