肾综合征出血热病人恢复期血清对汉滩病毒感染体外培养神经元的保护作用

目的用体外培养的昆明小鼠胚胎脑皮质神经元，感染汉滩病毒后，加入肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）病人恢复期血清，观察病毒感染神经元后细胞的变化以及ＨＦＲＳ病人恢复期血清对神经元的保护作用。方法将病毒感染的神经元加入不同浓度的ＨＦＲＳ病人恢复期血清（同时设立阴性血清对照组及正常细胞对照组和感染病毒对照组），使用ＭＴＴ比色试验检测神经元存活情况。结果各组神经元活性的ＭＴＴ比色试验显示，病毒感染组与未感染对照组比较差异有非常显著性（Ｐ＜０．００１），阴性血清对照组与正常细胞对照组比较，差异也有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。ＨＦＲＳ病人恢复期血清保护组与阴性血清对照组各小组间比较差异也都有非常显著性（Ｐ＜０．００１）。结论ＨＦＲＳ病人恢复期血清具有一定的中和病毒保护培养的神经元作用     

汉滩病毒核蛋白纯化及其免疫学特性的研究

目的　研究汉滩病毒核蛋白及其免疫学特性,研制新一代的肾综合征出血热(HFRS)亚单位疫苗。方法　用亲和层析法纯化重组杆状病毒表达的汉滩病毒核蛋白及野生汉滩病毒76-118的核蛋白,以聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹实验(Westernblot)鉴定纯化蛋白。用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,分别以福氏佐剂(FCA)和氢氧化铝［Al(OH)     

我国疫区HFRS患者汉滩病毒核蛋白特异性CTL克隆的建立

目的：探讨汉滩病毒核衣壳蛋白（HTNV-NP）诱生的特异性细胞免疫的分子基础，阐明HFRS的发病机理。方法：分离HFRS患者的PBMC，建立HTNV-NP特异性的CTL克隆，同时将克隆有HINV S基因不同片段的真核表达载体转染患者自身的B淋巴母细胞系（BLCL），建立CTL靶细胞系，并进行细胞杀伤试验。结果：建立的特异性CTL克隆对表达完整NP、NP羧基和氨基端肽段的靶细胞均有比较明显的杀伤效应，平均杀伤率分别为50.2%、39.0%和25.4%。结论：NTNV-NP优势T细胞表位可能主要位于病毒核蛋白的羧基端。     

汉滩病毒M片段噬菌体表位文库的构建及筛选

目的 通过构建汉滩病毒M片段的噬菌体展示文库，筛选汉滩病毒包膜蛋白的抗原表位。方法 DNaseⅠ随机消化的M片段与载体pComb3连接，转化宿主XL-1Blue，在辅助噬菌体VCSM13存在的条件下，获得M片段的随机噬菌体文库.利用纯化的恢复期病人血清对M片段噬菌体文库进行3轮淘洗，通过ELISA、序列分析对所获得的克隆进行鉴定。并对其中2个阳性克隆的目的片段进行了原核表达和免疫原性分析。结果 筛选获得的5个阳性噬菌体克隆均位于G1蛋白编码区，原核表达的2个阳性：充隆片段蛋白免疫兔，免疫兔血清能与病毒抗原发生特异反应。结论 本技术路线可用于汉滩病毒包膜蛋白抗原表位的研究，为汉滩病毒诊断试剂的研制、亚单位疫苗的设计提供了数据。     

用于汉滩病毒固有免疫应答研究的永生化人脐静脉内皮细胞系的建立

目的 通过导入人端粒酶逆转录酶(hTE RT)基因构建永生化人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC-hTERT),探索永生化HUVEC对汉滩病毒(HTNV)感染效率及细胞固有免疫调控的影响,评价HUVEC-hTERT作为研究HTNV细胞模型的潜能.方法 将hTERT基因克隆入慢病毒载体,构建pCDH-CMV-hTERT-EF...     

病毒跨神经元的束路追踪研究

近来的研究证明，一些活的病毒可用作神经束路追踪剂。这些病毒作为神经束路追踪剂的特点是其能够在神经网络中产生顺行或逆行的跨神经元输送并在输送过程中有自我复制、扩增能力。这些特点使病毒在显示有功能联系的神经元链方面有独特的优点。各种病毒中，单纯疱疹病毒（Ｉ型）和伪狂犬病毒应用最为普遍。在使用中，选择毒株、滴度和存活期对获得满意结果是重要的。事实证明，病毒作为新的神经束路追踪剂在神经生物学研究中有良好的前景。     

HFRS患者汉滩病毒核蛋白特异性T细胞克隆及其靶细胞的建立

目的　建立肾综合征出血热 (HFRS)患者汉滩病毒 (HTNV)核衣壳蛋白 (NP)特异性CTL克隆 ,为HTNVNPT细胞表位鉴定及HFRS患者T细胞免疫功能研究奠定基础。方法　采用Fi coll密度梯度离心法分离HFRS患者外周血单个核细胞 (PBMC) ,用灭活HTNV和IL 2体外刺激 ,有限稀释法建立T细胞克隆 ,流式细胞术鉴定克隆表型。并用EB病毒 (EBV)转化B淋巴细胞 ,建立B淋巴母细胞样细胞系 (B LCL) ,以含HTNVS基因的重组痘苗病毒感染B LCL作靶细胞 ,以CTL克隆作效应细胞进行细胞毒杀伤试验 ,测定T细胞克隆的抗原特异性。结果　T细胞克隆能特异性识别表达NP的B LCL。在 5名患者中 ,3名有较高的杀伤率 ,并自 2名患者建立了 5株HTNV特异性CTL克隆 ,其表型为CD8 均大于 6 0 %。结论　成功建立了HFRS患者HTNVNP特异性CTL克隆及其靶细胞。NP是HFRS患者HTNV特异性CTL应答的主要靶抗原之一。     

肾综合征出血热病人恢复期血清对汉滩病毒感染体 …

目的 用体外培养的昆明步鼠胚胎脑皮质神经元,感染汉滩病毒后,加入肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）病人恢复期血清,观察病毒感染神经元后细胞的变化以及ＨＦＲＳ病人恢复期血清对神经元的保护作用。方法 将病毒感染的神经元加入不同浓度的ＨＦＲＳ病人恢复期血清（同时设立阴性血清对照组及正常细胞对照组和感染病毒对照组）,使用ＭＴＴ比色试验检测神经元存活情况。结果 各组神经元活性的ＭＴＴ比色试验显示,病毒感染组与未感染     

调节性T细胞与病毒感染

调节性T细胞是机体维持自身免疫耐受的重要组成部分，在免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫反应和维持机体免疫平衡方面都有一定作用。近年来，人们认识到调节性T细胞在机体应对外来抗原的免疫机制中起重要作用，为此本文拟就调节性T细胞在外来微生物感染尤其是病毒感染中发挥的作用做一综述。     

体外培养大鼠小脑神经元划痕模型的建立

目的:建立体外培养SD大鼠小脑神经元划痕模型。方法:用200μl塑料枪头划痕体外培养大鼠小脑神经元,观察相同视野下不同时间点(0,24,48 h)的划痕宽度。结果:倒置相差显微镜下可见划痕细胞后0 h即形成划痕区,边缘整齐。24 h后,划痕边缘变模糊同时划痕宽度变窄。48 h后,划痕宽度进一步缩小。结论:本模型简便经济,能较好地模拟脑损伤后神经元的迁移。     

有源汉坦病毒疫苗候选株的分离鉴定及其某些特性 …

目的 对人源汉坦病毒疫苗候选株作分离鉴定及特性的研究。方法 用Ｖ ｅｒｏ细胞分离病毒,用免疫荧光法作病毒效价测定。用ＲＴ－ＰＣＲ及部分核苷酸序列分析等检定。结果 用Ｖｅｒｏ细胞从安徽省凤台县肾综合征出血热病人血清中分离一株汉坦病毒（ＨＶ）,其抗原特性及ＰＣＲ分型结果证明为汉滩病毒（Ⅰ型病毒）;其免疫血清对来源于不同地区的ＨＶ均有中和活性。Ｍ片段部分序列分析结果表明,该毒株与７６－１１８等毒株苷酸序     

Ⅰ型出血热患者中性粒细胞与淋巴细胞功能变化研究

目的研究肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）患者的淋巴细胞和中性粒细胞免疫功能变化及其相互间关系，进一步阐明发病机理。方法采用Ｅａ、Ｅｔ花环形成、ＰＨＡ皮肤试验及中性粒细胞趋化、吞噬、ＮＢＴ还原等多种试验方法同时对３２例由Ｈａｎｔａａｎ病毒引起的姬鼠型ＨＦＲＳ患者的淋巴细胞和中性粒细胞免疫功能变化及其相互间关系进行动态测定。结果ＨＦＲＳ患者早期前五项指标均明显低于正常人（Ｐ＜０．０１）；病程中，淋巴细胞损伤程度较粒细胞更加突出；中性粒细胞ＮＢＴ还原能力在恢复期反降至最低（Ｐ＜０．０５）。此外，患者这两种细胞的免疫功能在恢复期并未能完全达到正常水平。结论ＨＦＲＳ患者淋巴细胞免疫功能损伤程度与病程密切相关，可能是Ｈａｎｔａａｎ病毒直接作用的结果；而中性粒细胞免疫功能变化比较复杂，有待进一步研究。恢复期患者细胞免疫功能未能完全恢复提示临床治疗应予以关注。     

Infection of Hantaan virus strain AA57 leading to pulmonary disease in laboratory mice

Hantaan virus (HTNV) is a causative agent of hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS). The pathogenesis of HFRS has not been fully elucidated, mainly due to the lack of a suitable animal model. In laboratory mice, HTNV causes encephalitis. However, that symptom is dissimilar to human hantavirus infections. We found that HTNV strain AA57 (isolated from Apodemus agrarius in Far East Russia) caused pulmonary disease in 2-week-old ICR mice. The clinical signs of the infected mice were piloerection, trembling, hunching, labored breathing, and body-weight loss. A large volume of pleural effusion was collected from thoracic cavities of the dead mice. Overall, 45% of the mice inoculated with 3000 focus forming units (FFU) of the virus began to show clinical symptoms at 8 days post-inoculation, and 25% of the inoculated mice died within 3 days of onset of the disease. The morbidity and mortality rates of the mice inoculated with 30-30,000 FFU of HTNV strain AA57 were roughly equivalent. The highest rates of virus positivity (11/12) and the highest titers of HTNV strain AA57 were detected in the lungs of the dead mice, while lower detection rates and viral titers were found in the heart, kidneys, spleen, and brain. Interstitial pneumonia, perivascular edema, hemorrhage, inflammatory infiltration and vascular failure were observed in the lungs of the sick mice. Hantaviral antigens were detected in the lung endothelial cells of the sick mice. The symptoms and pathology of this mouse model resemble those of hantavirus pulmonary syndrome (HPS) and, to a certain extent, those of HFRS. This is the first report that, in laboratory mice, the HFRS-related hantavirus causes a HPS-like disease and shares some symptom similarities with HFRS.     

汉滩病毒感染血管内皮细胞引起TLR4表达上调

目的 探讨汉滩病毒感染血管内皮细胞后,Toll样受体(TRY)分子的表达变化,为抗感染免疫和致病机制研究提供重要资料.方法 分别用LPS,CL097,Poly I:C以及汉滩病毒76-118刺激血管内皮细胞,6 h后提取总RNA,进行反转录获得cDNA,再分别用各自的引物进行PCR反应,产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析,并用间接免疫荧光测定汉滩病毒感染血管内皮细胞后TLR4的表达.结果 汉滩病毒刺激感染后,血管内皮细胞TLR2、TLR4转录水平增高,TLR3转录水平降低,细胞膜表面的TLR4表达上调.结论汉滩病毒76-118感染血管内皮细胞后,可以引起TLRs分子转录水平发生改变,其中TLR4表达上调,固有免疫参与了汉滩病毒致病过程.     

汉滩病毒感染成龄鼠模型用于特异性单克隆抗体保护作用的研究

目的建立汉滩病毒感染成龄鼠的模型,以进行mAb的保护实验.方法将7～8wkBalb/c小鼠于感染病毒前1d及感染后1d,2d和4d,分别经腹腔注射环磷酰胺65mg/kg体重,总剂量为260mg/kg体重,观察其发病及死亡情况,并检测其体内不同脏器中汉滩病毒抗原的分布及滴度.用mAb对上述感染小鼠进行保护实验.结果经环磷酰胺处理的成龄鼠,由汉滩病毒隐性感染变为急性致死性感染(死亡率达100%).其发病症状与汉滩病毒感染的乳鼠类似,平均发病与死亡时间较感染乳鼠晚2～3d,且较为规律和集中.汉滩病毒抗原在感染的成龄鼠和乳鼠体内的分布及滴度基本相同.用mAb对感染的成龄鼠和乳鼠分别进行保护实验,结果完全一致.结论经环磷酰胺处理的成龄鼠,可作为汉滩病毒和HFRS研究用的动物模型.     

北京市肾综合征出血热聚集疫情分析

目的 描述分析北京市一起肾综合征出血热聚集性疫情,探讨低发病率地区聚集性疫情的流行病学特征.方法 2007-2014年肾综合征出血热病例数据来源于中国疾病预防控制信息系统中现住址为北京市的病例.疫情数据来源于流行病学调查和疫情防控记录.病例血清汉坦病毒抗原和抗体检测采用ELISA法.啮齿类动物使用夹夜法捕捉,其血清汉坦病毒抗原抗体使用间接免疫荧光方法检测.结果 2007-2014年北京市平均每年报告肾综合征出血热病例18例,年发病率在0.09/105-0.16/105.聚集疫情共涉及2名实验室确诊病例和1名无症状感染者.病例临床症状相对较轻,居住地灭鼠前鼠密度为10.0％,灭鼠后密度为1.3％.家鼠肺标本汉坦病毒抗体阳性率为12.5％(1/8),宠物鼠中未检出汉坦病毒.结论 北京市仍存在发生肾综合征出血热聚集疫情的可能,这起涉及3名感染者的疫情为“城中村”家鼠传播.