AdMax~(TM)重组腺病毒载体转染人脂肪间充质干细胞

目的 探讨AdMaxTM重组腺病毒载体转染人脂肪间充质干细胞(ADSCs)的最佳条件.方法 胶原酶消化法获得人ADSCs并行原代培养,流式细胞仪鉴定其表面标记;AdMaxTM重组腺病毒载体以梯度感染复数值(MOI)(10、50、100、200、400、800)转染人ADSCs,分别于转染后24、48、72、96 h,荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)表达,KS400型图像分析仪测定转染效率.结果 当MOI为400时可获得较佳的转染效率,GFP阳性细胞数量达到峰值,转染率达到91.25%.空载体转染人ADSCs的效率与转染时间无显著相关性.结论 AdMaxTM重组腺病毒是转染人ADSCs的较理想载体.通过选择恰当的MOI值能提高细胞对重组腺病毒的摄入,从而提高转染效率.     

碘造影剂对重组腺病毒转染大鼠脂肪干细胞转染效率的影响

目的初步探讨碘造影剂对腺病毒(Ad)转染大鼠脂肪干细胞(ADSCs)转染效率的影响。方法2015年12月—2016年1月于武汉大学心血管病研究所进行实验。体外培养大鼠ADSCs,用携带有TBX18基因的重组腺病毒载体(Ad-TBX18-GEP)转染ADSCs。根据是否加入碘造影剂将分选的脂肪干细胞分为空白对照组(A)组、腺病毒转染组(B)组、腺病毒转染+造影剂0.1 ml组(C)组、腺病毒转染+造影剂0.25 ml组(D)组、腺病毒转染+造影剂0.5 ml组(E)组。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)在靶细胞的表达情况,以每视野内平均阳性表达细胞所占比率判断基因转染效率。结果(1)腺病毒转染ADSCs的最适感染复数(MOI)值为100。(2)除A组外,其余各组在荧光显微镜下均可见绿色荧光,且B组绿色荧光蛋白表达最多,C、D、E组表达明显减少,B组的转染效率明显高于C、D、E组[分别为(77.63±1.74)%、(59.50±1.98)%、(45.10±2.28)%、(25.13±3.20)%],差异有统计学意义(F=1 321.74,P<0.01)。结论碘造影剂明显影响腺病毒对脂肪干细胞的转染效率,且随着造影剂剂量的增加,转染效率逐渐降低。     

不同转染方式对腺病毒介导的基因转染效率的影响

目的:研究携带绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因的重组腺病毒在大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达。方法:将纯化的GFP重组腺病毒分别用单次转染和多次转染两种不同方法转染MSC,观察其感染效率和GFP表达水平。结果:培养的MSC呈CD90和CD105强阳性,且具有成骨、成脂肪等多向分化能力;携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒单次转染和多次转染P3代MSC都呈现出浓度依赖性;单次转染在80MOI时转染效率最高,而多次转染在20MOI时转染效率即已达90%。结论:建立稳定、高效表达Ad-GFP的骨髓间充质干细胞实验体系,为MSC的标记及示踪奠定基础。     

慢病毒负载GFP转染兔脂肪干细胞的效率及毒性评价

目的 探讨慢病毒负载绿色荧光蛋白(GFP)对兔脂肪干细胞(rADSCs)转染的可行性及稳定性,为rADSCs组织工程化角膜上皮的研究提供可靠的体内外示踪方法.方法 以慢病毒作为载体,采用不同感染复数(MOI)慢病毒将GFP基因导入rADSCs,荧光倒置显微镜下观察细胞转染情况,应用MTT法检测慢病毒转染对rADSCs细胞生长的影响,评价细胞毒性.结果 当MOI值为50、100、500时,rADSCs均可被成功转染,120 h后转染效率均可达50％以上.当MOI值为50、100时,GFP-慢病毒对rADSCs的生长无明显影响,而MOI值为500时,细胞生长受到明显抑制.结论 慢病毒负载GFP可成功导人rADSCs,为进一步对ADSCs组织工程化角膜上皮的研究奠定了良好的实验基础.     

hVEGFA基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建携带hVEGFA基因的重组腺病毒载体.方法:采用分子克隆技术,从PCR2.1-hVEGFA质粒中克隆出hVEGFA基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-CMV-hVEGFA,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠埃希菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-hVEGFA.鉴定后,将pAdeasy-1-hVEGFA转染人胚肾细胞(HEK293A细胞),获得含hVEGFA基因的重组腺病毒(rAd-hVEGFA).反复感染HEK293A细胞扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度,荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达.结果:成功构建出含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,转染HEK293A细胞后出现绿色荧光蛋白表达,证明腺病毒载体rAd-hVEGFA 转染成功,通过反复感染HEK293A细胞获得大量病毒.结论:成功构建含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,可为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基因载体.     

慢病毒载体介导CD1d和GFP融合基因转染PANC-1细胞的实验研究

目的构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合基因慢病毒载体并转染人胰腺癌细胞(PANC-1).方法实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定.通过慢病毒转染预实验确定MOI,进行人CD1d重组慢病毒载体转染胰腺癌PANC-1细胞株.结果电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染PANC-1细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光.结论成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体并转染人胰腺癌细胞.     

Construction of a recombinant adenovirus Ad5F11p-TPEGFp and evaluation of its transfection efficiency to UT-7/Epo cells

目的 构建携带报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP,并且研究该病毒对人白血病细胞UT-7/Epo的感染效率及其在细胞中的复制.方法 先通过分子克隆技术构建重组腺病毒质粒pAd5F11pTPEGFP,然后利用脂质体转染法,将其转染至HEK293细胞包装出重组腺病毒Ad5 F11 pTPEGFP,经酶切和PCR鉴定正确后,扩增并纯化得到滴度较高的重组腺病毒.以空载体病毒Ad5GFP作为对照,将纯化的重组腺病毒感染UT-7/Epo细胞,经流式细胞仪检测在不同感染复数(MOI)下荧光阳性细胞比例,即为Ad5F11pTPEGFP病毒对UT-7/Epo细胞的感染效率,同时将冻融后的重组腺病毒感染的UT-7/Epo细胞上清感染HEK293细胞,48 h后观察GFP在HEK293细胞中的表达.结果 成功制备了重组腺病毒Ad5 F 11 pTPEGFP,其对UT-7/Epo细胞的感染效率明显高于空载体对照病毒Ad5GFP,在MOI为200时,感染效率达98.2％,而空载体病毒在MOI为200时,对UT-7/Epo细胞的感染效率仅为29.7％.感染了重组腺病毒的UT-7/Epo细胞冻融上清感染新的HEK293细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达.结论 成功构建了重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP,其对UT-7/Epo细胞有较高的感染效率,并能在其中复制.     

重组腺病毒Ad-DDAH2转染大鼠脂肪干细胞的可行性

目的 探讨腺病毒载体(Ad-DDAH2)转染大鼠脂肪干细胞(ADSCs)的可行性。方法 构建Ad-DDAH2-GFP质粒。原代培养大鼠ADSCs,流式细胞术检测免疫表型CD29、CD45、CD90表达情况。以不同滴度的Ad-DDAH2-GFP转染ADSCs,用荧光显微镜计数转染效率及细胞形态。通过RT-PCR及Western Blot检测DDAH2在ADSCs中的表达情况。结果 Ad-DDAH2-GFP重组腺病毒载体构建、包装成功,且病毒滴度达到2E+10PFU/ML。第4代ADSCs生长曲线呈现“S”形。细胞免疫表型CD29、CD90阳性率分别为(95.83±0.53)%、(91.32±0.27)%, CD45阳性率为(1.59±0.06)%,符合ADSCs免疫表型特征。当病毒感染复数值为80、100时,转染效率均可达到90%以上。但病毒感染复数值为100时,ADSCs出现明显细胞病理现象,因此病毒感染复数值为80被视为最佳感染复数,RT-PCR及Western Blot鉴定可见阳性扩增条带。结论 Ad-DDAH2-GFP重组腺病毒载体构建成功,可以高效转染大鼠ADSCs。DDAH2在mRNA及蛋白稳定长期表达,为后续体内实验奠定了实验基础。     

重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP的构建及其对UT-7/Epo细胞感染效率的检测

目的构建携带报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP,并且研究该病毒对人白血病细胞UT-7/Epo的感染效率及其在细胞中的复制。方法先通过分子克隆技术构建重组腺病毒质粒pAd5F11pTPEGFP,然后利用脂质体转染法,将其转染至HEK293细胞包装出重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP,经酶切和PCR鉴定正确后,扩增并纯化得到滴度较高的重组腺病毒。以空载体病毒Ad5GFP作为对照,将纯化的重组腺病毒感染UT-7/Epo细胞,经流式细胞仪检测在不同感染复数(MOI)下荧光阳性细胞比例,即为Ad5F11pTPEGFP病毒对UT-7/Epo细胞的感染效率,同时将冻融后的重组腺病毒感染的UT-7/Epo细胞上清感染HEK293细胞,48 h后观察GFP在HEK293细胞中的表达。结果成功制备了重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP,其对UT-7/Epo细胞的感染效率明显高于空载体对照病毒Ad5GFP,在MOI为200时,感染效率达98.2%,而空载体病毒在MOI为200时,对UT-7/Epo细胞的感染效率仅为29.7%。感染了重组腺病毒的UT-7/Epo细胞冻融上清感染新的HEK293细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达。结论成功构建了重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP,其对UT-7/Epo细胞有较高的感染效率,并能在其中复制。     

两种重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白转染大鼠成骨细胞效率的体外研究

目的 比较2种不同重组腺相关病毒(rAAV)介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)对大鼠成骨细胞的转染效率,评价其作为成骨细胞病变基因治疗载体的可行性.方法 采用Ⅰ型胶原酶阶段消化法分离培养大鼠成骨细胞并鉴定,rAAV-EGFP按转染复数(MOI) 1×10~3、1×10~4、1×10~5、5×10~5分为只加rAAV和rAAV与腺病毒(ADV)共同转染组转染成骨细胞,倒置荧光显微镜观察转染后荧光强度随转染时间的变化,流式细胞仪检测rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP对成骨细胞的转染效率及荧光强度,确定转染的较佳MOI值,以此值用MTT法描绘细胞生长曲线,观察rAAV对细胞的毒性.结果 分离培养的细胞具有体内成骨细胞的生物学行为,rAAV对成骨细胞的转染效率随MOI值的增加而提高,ADV(-)组荧光强度在第5 d达到高峰,当MOI为1×10~5时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率分别为90.2%、66.1%,MOI值增到5×10~5时转染效率无显著提高;ADV(+)组荧光强度在第3 d即达高峰,MOI值为5×10~5时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率为47.6%、30.5%.细胞生长正常,rAAV对细胞活性影响小.结论 两种病毒载体对成骨细胞转染效率均较高,其中rAAV2/6高于rAAV2/9,是一种理想的基因治疗载体.