siRNA沉默结缔组织生长因子对鼠肝星状细胞生物学

目的研究化学合成的小干扰RNA(483 siRNA)对大鼠原代肝星状细胞(HSCs)结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达及细胞生物学特性的影响。方法以胶原酶原位灌注消化、密度梯度离心分离大鼠原代HSCs,以脂质体Oligofectamine包裹483siRNA转染培养72 h的原代HSCs作为转染组,并设空白对照组。收集孵育96 h的HSCs及培养上清液,采用Western blotting、免疫细胞化学染色、MTT和RT-PCR法分别检测细胞CTGF蛋白表达、α-SMA表达、细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达;放射免疫法检测培养上清液中透明质酸及Ⅲ型前胶原含量。结果与对照组比较,转染组HSCs的CTGF蛋白表达下调(92±5)%,α-SMA染色阳性细胞减少(58±6)%,细胞增殖活性下调(18±5)%,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达分别下调(53±6)%和(41±7)%;培养上清中透明质酸和Ⅲ型前胶原含量分别降低(48±5)%和(33±8)%。结论483 siRNA能显著下调原代HSCsCTGF蛋白表达,并由此抑制细胞活化、增殖及细胞外基质的合成和分泌。提示针对CTGF靶位的siRNA可能具有防治肝纤维化的潜力。     

siRNA沉默结缔组织生长因子对鼠肝星状细胞生物学特性的影响

目的研究化学合成的小干扰RNA（483 siRNA）对大鼠原代肝星状细胞（HSCs）结缔组织生长因子（CTGF）蛋白表达及细胞生物学特性的影响。方法以胶原酶原位灌注消化、密度梯度离心分离大鼠原代HSCs,以脂质体Oligofectamine包裹483 siRNA转染培养72h的原代HSCs作为转染组,并设空白对照组。收集孵育96h的HSCs及培养上清液,采用Western blotting、免疫细胞化学染色、MTT和RT—PCR法分别检测细胞CTGF蛋白表达、α-SMA表达、细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达;放射免疫法检测培养上清液中透明质酸及Ⅲ型前胶原含量。结果与对照组比较,转染组HSCs的CTGF蛋白表达下调（92±5）％,α—SMA染色阳性细胞减少（58±6）％,细胞增殖活性下调（18±5）％,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达分别下调（53±6）％和（41±7）％;培养上清中透明质酸和Ⅲ型前胶原含量分别降低（48±5）％和（33±8）％。结论483 siRNA能显著下调原代HSCs CTGF蛋白表达,并由此抑制细胞活化、增殖及细胞外基质的合成和分泌。提示针对CTGF靶位的siRNA可能具有防治肝纤维化的潜力。     

靶向结缔组织生长因子的siRNA对于肝星状细胞介导肝纤维化的研究进展

肝纤维化是多种慢性因素导致肝内细胞发生持续、反复的坏死或炎症刺激,机体发生的修复反应,以肝内细胞外基质（extracellular matrix,ECM）过度沉积和肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSC）活化为特征。它不是一个独立的疾病,而是许多慢性肝病的共同病理过程,持续进展可导致肝内正常组织结构改建形成肝硬化并出现多种危及生命的并发症,预后极差。由于体内存在纤维降解过程,故肝纤维化逆转可以避免病情进展至肝硬化。研究表明靶向结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）可能抑制HSC活化、增殖及ECM的合成,使肝纤维化进程受阻。siRNA介导的CTGF基因沉默为肝纤维化治疗开辟了新的途径。     

靶向leptin基因的siRNA对大鼠肝星状细胞生物学特性的影响

目的 构建具有特异性瘦素（leptin）基因小于扰RNA（small interfering RNA，siRNA）功能的表达质粒，研究靶向leptin基因的siRNA对大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）中leptin表达及HSC生物学特性的影响。方法 以leptin为目的基因，以产生siRNA质粒载体psiRNA-hHlneo为表达模板，细胞内转录合成4对特异的siRNA和1对对照siRNA。构建能在真核细胞中表达的重组质粒leptinsi RNA，用酶切方法和测序法对重组体进行鉴定。应用脂质体介导重组质粒转染HSC。RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学法检测HSC的leptin表达情况，用MTT法检测细胞增殖，用流式细胞仪分析细胞凋亡。结果 酶切和序列测定表明，成功构建了leptinsiRNA表达质粒；外源重组质粒siRNA3和siRNA4能够抑制leptinm RNA和蛋白表达（均P〈0．01）；HSC增殖活性显著降低（P〈0．05），凋亡增加（P〈0．01）。与未转染组相比，consiRNA、siRNA1和siRNA2转染组没有显著改变（均P〉0．05）。结论 构建的leptinsi RNA表达载体可减少leptin的表达，抑制HSC增殖并诱导其凋亡。为肝纤维化基因治疗提供了新的靶点。     

锌指结构9、结缔组织生长因子在大鼠肝星状细胞中的表达

目的:通过研究肝纤维化大鼠原代肝星状细胞锌指结构9(ZF9)、结缔组织生长因子(CTGF)的表达及其动态变化,初步探讨CTGF、ZF9在肝星状细胞活化中的作用。方法:32只雄性SD大鼠皮下注射40%植物油CCl4,每周2次,并分别于注射1,4,8周后作大鼠肝原位灌注,分离肝星状细胞,Western blot法检测CTGF蛋白,RT-PCR检测ZF9 mRNA水平。结果:正常大鼠肝星状细胞ZF9基因可见弱表达,注射CCl41周后其表达增强,注射CCl44周后转录明显增强,8周时仍高表达。正常大鼠肝星状细胞CTGF蛋白无明显表达,模型组大鼠皮下注射CCl41周后,蛋白出现少量表达,注射CCl44周后,表达进一步增加,第8周CTGF蛋白表达更强。结论:ZF9、CT-GF基因随着肝损伤的加重,在肝星状细胞中的表达逐渐增加,共同促进肝纤维化的发生。     

结缔组织生长因子与肝纤维化的研究进展

结缔组织生长因子（CTGF）是近年来发现的在多种器官组织纤维化过程起重要作用的细胞因子，CTGF在多种纤维化疾病中介导了TGF-β1的许多功能，几乎与TGF-β1表达于所有纤维化组织中．但CTGF并不具有TGF-β1的抑制细胞过度增殖及免疫抑制作用等生理功能，因而被认为是TGF-β1的部分下游效应分子。由于其作用更局限于影响纤维化的发生，对它的深入研究有可能为有效防治肝纤维化找到一个新的方法。     

内毒素对原代大鼠肝星状细胞表达结缔组织生长因子影响机制的研究

目的研究内毒素（LPS）与其刺激的Kupffer细胞（KCs）培养上清（KCCM）及NF—κB通路抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）对大鼠原代肝星状细胞（HSCs）表达结缔组织生长因子（CTGF）的影响,探讨LPS刺激HSCs表达CTGF的机制。方法分离培养原代大鼠HSCs、KCs。培养72h的KCs经1mg／LLPS刺激48h后收集上清标记为KCCM1。未经LPS刺激的上清标记为KCCM0。将培养72h的HSCs随机分为空白对照组、KC—CM0组、LPS组、KCCM1组、PDTC组、（PDTC＋LPS）组、（PDTC＋KCCM1）组。各组HSCs经相应的处理48h后,Westernblot检测各组HSCs表达CTGF水平,ELISA检测培养上清中I型胶原含量。结果各组HSCs中CTGF蛋白表达水平为：空白对照组（1．95-±0．67）、KCCM0组（2．15±1．10）、LPS组（4．56±4．16）、KCCM1组（5．21±3．23）、PDTC组（0．06±0．02）、（PDTC＋LPS）组（0．10±0．08）、（PDTC＋KCCM1）组（2．77±4．08）。LPS与KCCM1作用于HSCs后CTGF表达增加（P〈0．05）;PDTC几乎可以完全阻断正常及LPS刺激的HSCs表达CTGF（P〈0．01）,但只能降低KCCM1组CTGF的表达（P〈0．05）：KCCM1组HSCs上清中I型胶原的含量增加（P〈0．05）。结论LPS可直接通过HSCs内的NF—κB通路使其表达CTGF水平上调,LPS刺激的KCs还可能通过其他途经使HSCs表达CTGF水平上调。     

苦参素对肝星状细胞增殖及结缔组织生长因子表达的影响

目的 观察苦参素对肝星状细胞(HSC)增殖及结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响,探讨苦参素抗肝纤维化的作用机制.方法 利用胶原酶/链蛋白酶灌注梯密度离心分离大鼠HSC,用噻唑蓝(MTT)比色法观察苦参素对HSC增殖的影响,利用qRT PCR观察对CTGF表达的影响.结果 体外实验表明苦参素可以呈剂量依赖关系抑制HSC增殖,并抑制其CTGF的表达.结论 苦参素可能通过抑制HSC增殖及CTGF的表达介导其抗肝纤维化作用机制.     

RNA干扰抑制大鼠肝星状细胞CTGF表达的实验研究

目的构建针对结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的RNA干扰重组质粒及其对照质粒,将其转染到体外培养的大鼠肝星状细胞(Hepatic Stellate Cells,HSC)中,进一步应用Real-time PCR方法检测CTGFmRNA的表达,观察RNA干扰对大鼠肝星状细胞CTGF表达的抑制作用,为临床基因治疗提供依据。方法①利用pGCsi载体构建介导CTGF短发夹RNA(shRNA)表达的质粒重组体,并通过基因测序分析进行鉴定。②将构建成功的4组重组质粒转染大鼠肝星状细胞株(HSC-T6),另设空白对照组,48 h后,共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达,分析转染效果。③检测CTGFmRNA表达水平,筛选出有效抑制CTGF表达的序列。④应用SPSS 17.0软件对数据进行方差分析。结果成功构建了能表达CTGFshRNA的三组重组体pGCsi-CTGFshRNA。pGCsi-CTGFshRNA成功转染到肝星状细胞中。与空白对照组相比,pGCsi-CTGFshRNA1组及pGCsi-CTGFshRNA2组细胞CTGFmRNA不同程度下降,pGCsi-CTGFshRNA3组细胞及非特异性shRNA组mRNA表达水平无明显变化。结论本实验成功构建了pGCsi重组质粒。重组质粒成功转染到大鼠肝星状细胞中。筛选出两条有效抑制CTGF基因表达的序列,pGCsi重组质粒能高效抑制大鼠肝星状细胞中CTGF的表达。     

结缔组织生长因子与肝纤维化

最近的研究表明，肝纤维化形成的主要原因是由于细胞外基质的增加而不是其降解的减少，其发生机制较为复杂。在肝纤维化的发病过程中，细胞因子始终是人们研究的热点。其中结缔组织生长因子（CTGF）被视为转化生长因子岛（TGF-β1）的下游反应元件，具有促进成纤维细胞增殖以及参与细胞外基质（ECM）产生积聚等功能，这在多种纤维化疾患的研究中已得到证实，在体内和体外实验研究中均证实CTGF的异常高表达在肝纤维化的发生发展过程中起关键作用，已成为肝纤维化新的研究热点，仅就这方面近几年的相关研究综述如下。     

过氧化物酶增殖物激活受体γ抑制大鼠肝星状细胞中转化生长因子-β1诱导的结缔组织生长因子表达

目的 探讨过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)对大鼠肝星状细胞(HSC)中转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的结缔组织生长因子(CTGF)表达的抑制作用.方法 常规培养大鼠HSC,预先给予或不给予PPARγ特异性拮抗剂GW9662处理,再经系列浓度的PPARγ天然配体(15-d-PGJ2)或合成配体(GW7845)及TGF-β1序贯作用后,通过半定量RT-PCR及Western-blotting分析CTGF表达状况,透射电镜观察HSC形态学变化.结果 15-d-PGJ2和GW7845可显著抑制HSC中TGF-β1诱导的CTGF表达(同时在转录和转录后水平),且PPARγ配体对CTGF表达的抑制作用可被GW9662部分或完全逆转,说明此种抑制效应确由PPARγ所介导;电镜观察亦显示HSC由活化态向静息态的形态学转变.结论 PPARγ活化可显著抑制HSC中TGF-β1诱导的CTGF表达,提示PPARγ可作为逆转肝纤维化治疗的新的有效靶点.

Abstract：

Objective To investigate the effect of peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARγ)activation on transforming growth factor betal(TGF-β1)-induced connective tissue growth factor(CTGF)expression in rat hepatic stellate cells(HSCs).Methods Cultured HSCs with or without PPARγ-specific antagonist GW9662 treatment prior to the addition of an increasing amount of PPARγ natural ligand(15-d-PGJ2)or synthetic ligand(GW7845)were stimulated with TGF-β1.The mRNA and protein levels of CTGF expression were detected by semi-quantitative RT-PCR and Western blotting,respectively.The morphological changes of the HSC were obgerved by electron microscope.Results 15-d-PGJ2 and GW7845 significantly inhibited TGF-β1-induced CTGF expression at both mRNA and protein levels in HSCs, and the inhibitory effect was dramatically,if not completely,abolished by pretreatment with GW9662,suggesting that the inhibition was mediated by PPARγ. Morphological observation revealed that PPARγactivation caused obvious changes of HSCs from activated to quiescent phenotypes.Conclusion PPARγ ligand shows potent inhibitory effect on TGF-β1-induced CTGF expression in rat HSCs,suggesting its potential as a candidate agent for treatment and prevention of hepatic fibrosis.     

Smad7和uPA基因共表达对大鼠肝星状细胞生物学特性的影响

目的观察Smad7和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)基因共表达对体外培养肝星状细胞(HSC)活化、分泌胶原特性的影响。方法采用胶原酶原位灌注、密度梯度离心法分离大鼠HSC,将AdSmad7/uPA或AdSmad7体外感染HSC后,Western blot-ting法检测细胞总蛋白中Smad7、抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原α2链(ColⅠA2)的表达;ELISA法检测培养上清中uPA蛋白的分泌量;放射免疫法测定HSC培养上清中Ⅲ型前胶原(PⅢP)和层黏连蛋白(LN)的分泌量。结果AdSmad7/uPA感染体外培养HSC,3 d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,转染效率>90%,Smad7和uPA蛋白的表达量明显高于AdGFP对照;AdSmad7/uPA或AdSmad7转染HSC均可使α-SMA、ColⅠA2、PⅢP和LN水平较AdGFP对照组显著下降(P<0.05)。与转染AdSmad7相比,转染AdSmad7/uPA后的HSC中ColⅠA2、PⅢP和LN表达降低更明显,分别较前者降低44.5%、30.4%和28.4%(P<0.05)。结论Smad7和uPA基因共表达可协同抑制体外培养的大鼠HSC分泌细胞外基质成分。     

Smad7和uPA基因共表达对大鼠肝星状细胞生物学特性的影响

目的 观察Smad7和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)基因共表达对体外培养肝星状细胞(HSC)活化,分泌胶原特性的影响.方法 采用胶原酶原位灌注、密度梯度离心法分离大鼠HSC,将AdSmad7/uPA或AdSmad7体外感染HSC后,Western blotting法检测细胞总蛋白中Smad7、抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原α2链(Col Ⅰ A2)的表达;ELISA法检测培养上清中uPA蛋白的分泌量;放射免疫法测定HSC培养上清中Ⅲ型前胶原(PⅢP)和层黏连蛋白(LN)的分泌量.结果 AdSmad7/uPA感染体外培养HSC,3 d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,转染效率＞90%,Smad7和uPA蛋白的表达量明显高于AdGFP对照;AdSmad7/uPA或AdSmad7转染HSC均可使α-SMA、Col Ⅰ A2、PⅢP和LN水平较AdGFP对照组显著下降(P＜0.05).与转染AdSmad7相比,转染AdSmad7/uPA后的HSC中Col Ⅰ A2、PⅢP和LN表达降低更明显,分别较前者降低44.5%、30.4%和28.4%(P＜0.05).结论 Smad7和uPA基因共表达可协同抑制体外培养的大鼠HSC分泌细胞外基质成分.     

转化生长因子β1对胰腺星状细胞中结缔组织生长因子基因的调控作用

目的 探讨转化生长因子β1(TGF-β1)对大鼠结缔组织生长因子(CTGF)基因启动子活性的调控作用。方法 将大鼠CTGF基因启动子片段与荧光素酶报告基因组成重组体pcTGF-luc。采用脂质体转染方法将该质粒转至原代分离并培养的2～5代大鼠胰腺星状细胞(PSCs)中,24h后分别在不同时间和不同浓度的体外CTGF-β1刺激下用Dual-luciferase报告系统检测相应荧光素酶的活性。结果 TGF-β1表现为以剂量和时间依赖的方式上调PSCs中CTGF基因启动子活性,TGF-β1在短时间内即可使CTGF基因启动子活性明显增高,并达到高峰,且能有效地保持至36h左右。结论 在PSCs中,TGF-β1主要在转录水平调节CTGF表达,较小浓度和较短时间即可使CTGF启动子活性增强。     

慢病毒介导HGF-ShRNA干扰肝细胞生长因子表达对肝星状细胞凋亡的影响

目的 观察慢病毒介导的HGF-ShRNA部分干扰大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)及肝星状细胞(HSCs)来源的肝细胞生长因子(HGF)表达,对BMSCs与HSCs共培养体系中HSCs凋亡的影响,探讨两种细胞来源的HGF对HSCs凋亡的促进作用.方法 应用6孔培养板,建立BMSCs及HSCs双层细胞共培养体系,实验分4组:(1)HSCs单独培养组:HSCs单独培养;(2) BMSCs+ HSCs共培养组:BMSCs与HSCs共培养;(3)BMSCs转染共培养组:使用慢病毒介导的HGF-ShRNA转染BMSCs后与HSCs共培养;(4)HSCs转染共培养组:使用慢病毒介导的HGF-ShRNA转染HSCs后与BMSCs共培养.分别于培养24、48、72 h后,采用Annexin V-FITC/PI双染法检测各组HSCs凋亡率,Western blot、荧光定量PCR分别检测各组DR5、Caspase-8蛋白及mRNA的表达.结果 BMSCs+ HSCs共培养组HSCs的凋亡率明显高于HSCs单独培养组和BMSCs转染共培养组,且呈时间依赖性(P＜0.01),而与HSCs转染共培养组比较差异无统计学意义(P＞0.05);BMSCs+ HSCs共培养组HSCs中DR5、Caspase-8蛋白及mRNA表达量均明显高于HSCs单独培养组及BMSCs转染共培养组(P＜0.01),而与HSCs转染共培养组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 BMSCs旁分泌HGF通过上调HSCs的DR5、Caspase-8的表达促进HSCs的凋亡.HSCs自分泌的HGF在共培养体系中促进其凋亡的作用甚少.     

脂质体转染TRPM7siRNA对肝星状细胞增殖的影响

目的 通过利用小干扰RNA(siRNA)下调瞬时受体电位通道7(TRPM7)基因的表达,研究TRPM7对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)活化、增殖的影响.方法 人工合成抑制TRPM7基因的siRNA片段,通过脂质体LipofectamineTM 2000转染到HSC-T6内,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测量细胞增殖变化;...     

醛固酮对大鼠肾小球系膜细胞结缔组织生长因子基因表达的影响

目的 探讨醛固酮(ALD)对大鼠肾小球系膜细胞结缔组织生长因子(CTGF)基因表达的影响.方法 ①以不同浓度的ALD (10-11、10-10、10-9、10-8、10-7mol/L)刺激肾小球系膜细胞72 h后,用半定量KT-PCR.法检测细胞中CTGF mRNA的表达.②以10-9 mol/L的ALD刺激肾小球系膜细胞不同时间(12、24、48、72 h)后,用半定量RT-PCR法检测细胞中CTGF mRNA的表达.结果 半定量RT-PCK结果显示,随着ALD浓度的升高,CTGF mKNA的表达量(以CTGF/GAPDH mRNA表示)明显增加.在10-7mol/L时达高峰,与对照组比较,差异有显著性(P＜0.01).表明ALD促进肾小球系膜细胞CTGF mRNA的表达,且具有一定的剂量-反应关系.以10-7mol/L的ALD作用于大鼠肾小球系膜细胞12～72h,随着作用时间的延长,CTGF mRNA的表达量明显增加,在72 h时达高峰,与对照组比较,差异有显著性(P＜0.01).表明ALD促进系膜细胞CTGF mRNA的表达,且具有一定的时间-效应关系.结论 ALD促进大鼠肾小球系膜细胞CTGF mRNA的表达,从而促进慢性肾脏病进展.