不同的固定及渗透方法对小鼠卵母细胞免疫荧光染色的影响

目的探索有效的染色前固定及渗透卵母细胞的方法,以提高小鼠卵母细胞免疫荧光染色的效率。方法采用4种不同的固定及渗透方法处理小鼠卵母细胞:①方案A:先用4%多聚甲醛(PFA)固定1 h,再用0.5%Triton X-100穿透10 min;②方案B:先用0.5%Triton X-100穿透10 min,再用4%PFA固定1 h;③方案C:用1%PFA 0.5%Triton X-100同时固定与穿透1 h;④方案D:用-20℃预冷甲醇固定15 min。分析10种核蛋白(TFⅡA、TFⅡB、TAF1、TAF4、polⅡ、BRF1、MeCP2、MBD2ab、HP1α及HP1β)在小鼠卵母细胞中的免疫荧光染色效果。结果只有方案C能够完全检测出这10种蛋白质。结论用1%PFA 0.5%Triton X-100同时固定与穿透1 h,可以在小鼠卵母细胞形态保持良好的同时检测出更多的蛋白质。     

不同固定方法对细胞免疫荧光染色结果的影响

目的 比较不同的固定方法对细胞内胞浆蛋白Vigilin和核蛋白CTCF的免疫荧光染色结果的影响.方法 在免疫染色前,分别采用四种方法对HepG2细胞进行固定及通透：①纯甲醇-20℃处理8min后,再用80％丙酮—20℃处理1min.②甲醇;丙酮的1∶1混合溶剂-20℃处理10min.③在方案2的基础上,再用0.1％ Triton-X-100冰上通透10min.④4％多聚甲醛室温固定10min后,用0.1％％Triton-X-100冰上通透10min.结果 采用方案①、②、③、④得到的胞浆蛋白vigilin在细胞内的大致分布无明显差异,但用方案④处理后,染色效果更为清晰而能更好地观察到细胞的细微结构;另外,采用方案①和方案②处理细胞后,对核蛋白CTCF进行免疫染色,可见CTCF分布于胞浆;方案③中,在纯甲醇固定后,若用0.1 ％Triton-X-100通透,则CTCF显示主要分布于细胞核内,胞质内亦有阳性染色;方案④的通透条件下,CTCF特异性分布于细胞核,胞质内几乎无阳性染色.结论 不同的固定及通透方法对免疫染色的结果影响很大,应针对抗原特点,采用适宜的固定方法,以得到正确的实验结果.     

不同固定液对细胞骨架荧光染色标记效果的影响

目的 比较不同固定液对细胞骨架荧光染色的差异,选择最佳固定方法.方法 分别采用4%甲醛、2%戊二醛、95%乙醇和4%多聚甲醛/MES 4种固定液,对人肺腺癌细胞H1299进行固定,对其微管和微丝荧光标记后,在共聚焦显微镜下观察其形态结构.结果 4%多聚甲醛/MES对细胞的微管和微丝都有很好的固定作用.4%甲醛、2%戊二醛、95%乙醇对细胞的微丝基本能起到固定作用,而4%甲醛对微管的固定效果略差,2%戊二醛、95%乙醇固定的细胞看不到微管的具体形态结构.结论 细胞骨架的固定中需加入骨架稳定剂,且根据实验目的,选择适当的固定液获得最佳标记效果.     

不同固定剂对鼻息肉上皮细胞免疫荧光染色的影响

目的 通过激光共聚焦技术,观察鼻息肉体外培养上皮细胞在3种不同固定剂作用下的免疫荧光染色效果,探讨不同固定剂对免疫荧光染色结果的影响,从而选择最佳固定方法。方法 用酶消化法分离培养鼻息肉上皮细胞,接种培养7 d后,分别用4%（质量分数）多聚甲醛（paraformaldehyde,PFA）、等体积甲醇丙酮混合液及甲醇室温固定,1%（体积分数）Triton X-100透膜,山羊血清封闭,滴加一抗4 ℃过夜,滴加相应荧光二抗,含DAPI封片剂封片,激光共聚焦显微镜观察。结果 等量甲醇丙酮混合液及甲醇对标记的4个标记蛋白均有较好的固定作用;4%（质量分数）PFA对跨膜蛋白16A（transmembrane protein 16A,TMEM16A）固定效果差,对紧密连接蛋白（zonular occludens-1,ZO-1）的固定效果不理想。结论 甲醇丙酮混合液及甲醇对标记的4个标记蛋白的固定作用均较好,为体外培养细胞免疫荧光染色最佳固定剂的选择提供参考。     

不同固定剂在激光共聚焦荧光技术中的效果评价

【目的】 探讨3种不同的固定剂在激光共聚焦免疫荧光技术中对信号表达的影响。 【方法】 对培养的NRK-52E细胞分成胞浆,胞膜及胞核抗原3组,每组用4 g/L PFA,甲醇及丙酮分别固定后,完成免疫荧光实验;原代滑膜成纤维样细胞分两组用4 g/L PFA 固定后分别用TritonX-100 和预冷的甲醇进行打孔,完成免疫荧光实验之后,使用Confocal显微镜在条件同等的情况下观察并拍摄荧光图像,以证实不同的固定剂对信号表达的影响。【结果】 胞浆蛋白α-SMA用丙酮固定时信号清晰锐利,将Actin蛋白的丝状结构表达得非常充分;胞膜蛋白ZO-1用甲醇固定处理的信号最清晰;胞核蛋白磷酸化的Smad3用4 g/L PFA固定时p-Smad3信号与细胞核具有很好的共定位关系;原代滑膜成纤维样细胞用预冷甲醇打孔处理的细胞,其磷酸化的骨架相关蛋白(P-ERM)蛋白信号明显优于用TritonX-100打孔处理的细胞。 【结论】 针对不同抗原结构特点选用固定剂;有机溶剂固定剂用于细胞支架成分的固定,交联剂固定剂用于膜相关成分的固定,同时使用交联剂固定剂及有机溶剂打孔可较好的保存抗原而获得高质量的荧光图片。     

不同固定液对胃癌细胞骨架及连接蛋白荧光染色标记效果的比较

目的 通过激光共聚焦技术,观察SGC-7901胃癌细胞系在不同固定液作用下的细胞骨架及连接蛋白荧光染色.方法 接种SGC-7901细胞24 h后,分别用4％多聚甲醛、2.5％戊二醛及95％乙醇室温固定20 min,5％ BSA(含0.2％ Triton X-100)封闭透膜1h,直标荧光一抗避光37℃孵育1h,DAPI室温染核15 min,激光共聚焦扫描显微镜扫描.结果 4％多聚甲醛对细胞骨架微丝结构及连接蛋白Zo-1细胞膜定位均有较好的固定作用,2.5％戊二醛对微丝结构基本起到固定作用,而95％乙醇对于微丝的固定效果略差.后两种固定液固定细胞均出现连接蛋白胞质表达的非特异染色现象.结论 4％多聚甲醛对细胞骨架及细胞间连接蛋白的固定效果较优,荧光染色标记结果为后续研究提供依据.     

利用优化的显微技术观察和定位Merm1/Wbscr22在人肺癌细胞NCI-H1299中的表达

目的 优化细胞免疫荧光染色技术结合激光扫描共聚焦显微镜技术的实验步骤,观察并定位Merm 1/Wbscr22在人肺癌细胞NCI-H1299中的表达,以期对后续深入研究Merm1/Wbscr22的分子功能提供技术支持.方法 采用Western blot 及细胞免疫荧光染色结合激光扫描共聚焦显微镜技术观察Merm1/Wbscr22在NCI-H1299细胞的表达与定位,改进并优化免疫荧光染色实验步骤.结果 Merml/Wbscr22蛋白在NCI-H1299细胞内过量表达,并定位于细胞核内.细胞免疫染色步骤显著地影响Texas Red-鬼笔环肽的非特异性染色及F-actin、Merm1/Wbscr22、细胞核DNA染色荧光的强度.结论 结合细胞免疫荧光染色技术与激光扫描共聚焦显微镜技术可以清楚地观察Merm1/Wbscr22在人肺癌细胞NCI-H1299的表达与定位,该技术的最优实验步骤是细胞固定、透膜、封闭、Texas Red-鬼笔环肽标记F-actin、一抗结合、二抗结合、DAPI标记细胞核DNA,最后共聚焦显微镜成像,这样既能减少Texas Red-鬼笔环肽的非特异性染色,各组分荧光强度又足够清晰利于观察.     

高血黏度对小鼠脑细胞内游离钙浓度及脑组织丙二醛含量的影响

目的:探讨慢性脑供血不足对脑细胞内[Ca2 ]i, 脑组织丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)含量的影响. 方法:采用高分子右旋糖酐法建立小鼠高血黏度动物模型,以Fluo-3/AM为细胞内游离钙离子的荧光指示剂,用激光扫描共聚焦显微镜测定脑细胞内[Ca2 ]i的变化;用硫代巴比妥酸法及黄嘌呤氧化酶发光法分别测定脑组织匀浆MDA,SOD含量. 结果:高血黏度小鼠脑细胞内[Ca2 ]i明显升高(P<0.01),脑组织匀浆中MDA含量明显升高(P<0.05),SOD含量明显降低(P<0.05). 相关分析显示小鼠全血高、低切黏度与脑细胞内[Ca2 ]i均呈显著正相关关系(Spearman等级相关系数分别为0.769,0.821,P＜0.01);全血低切黏度与脑组织MDA含量也呈显著正相关关系(Pearson相关系数为0.720,P＜0.01). 结论:高血黏度可导致脑细胞内钙超载及脑组织中自由基反应增强.     

不同固定方法对冰冻切片间接免疫荧光结果的影响

目的：寻找一种冰冻切片间接免疫荧光染色以及HE染色过程中最佳的组织固定方法。方法：取健康成年小鼠双侧睾丸冰冻切片,分别采用3种方法进行固定：①丙酮4℃固定15分钟,-20℃保存24h;②95％酒精4℃固定15分钟,-20℃保存24h;③切片-20℃保存24h后,再用4℃丙酮固定15分钟。然后做间接免疫荧光和HE染色,观察组织结构及染色情况。结果：4℃丙酮固定的组织切片HE染色以及间接免疫荧光效果良好。-20℃保存24h后,4℃丙酮固定15分钟的冰冻切片HE染色和间接免疫荧光结果最差。结论：酒精和丙酮都可以固定组织,但是4℃丙酮固定效果最好。     

应用共聚焦激光扫描显微镜对体外培养的骨骼肌细胞的研究

目的研究骨骼肌细胞内的Ca2+.方法应用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)研究体外培养骨骼肌细胞(SMC)胞浆内游离Ca2+变化.结果 50 μmol/L Fluo-3/AM恒温(37℃)孵育体外培养SMC 30 min即可达到最佳负载效果,孵育时间的再延长或荧光染料浓度的提高均可能对细胞造成毒性,导致荧光淬灭.结论胞浆内游离Ca2+的标记需要适宜的条件,并尽早检测.     

去氧肾上腺素对肝细胞内游离钙分布的影响

目的：探讨去氧肾上腺素对肝细胞内游离钙分布的影响。方法：应用激光扫描共聚焦显微镜观察去氧肾上腺素单独或在酚妥拉明预处理后肝细胞作用所引起的细胞内荧光强度的变化。结果：去氧肾上腺素对肝细胞作用后引起细胞内荧光强度的迅速增强。而在酚妥拉明预处理肝细胞后细胞内灾光强度的变化不显著。同时肝细胞内荧光强度的不均匀分布亦表明游离钙的分布存在着亚分区现象。结论：去氧肾上腺素可通过α受体介质肝细胞内钙信号的变化,同时细胞内的钙分布及其动态变化存在一定的特征性。     

新鲜的和福尔马林固定的食管胃黏膜标本：激光扫描共聚焦显微镜的组织学成像质量判定

背景与研究目的：作曾报道过在体外对未经处理的新鲜标本采用激光扫描共聚焦显微镜（LCM）获得仿真组织学图像。该研究旨在比较新鲜和福尔马林固定而未进一步处理的标本的LCM图像质量。方法：通过内镜活检或手术得到11例患的18份标本。首先由具有LCM的Fluroview娩微镜观察浸于盐水中的新鲜标本。此后用福尔马林固定标本，并进一步获得幽定1h、3h和24h的图像。3名独立的检查观察图像并判定标本来源、处理方法、福尔马林固定时间及病变的良恶性。采用κ分析比较3名观察在．卜述四个内容上的一致性。结果：2003年1月至3月，得到18份标本的191幅LCM图像。随机选取30张图像片观察，区分食管和胃标本总的准确率为96．6％，区分正常和癌变组织的准确率为92．2％，区分盐水浸泡和福尔马林固定标本的准确率为59．7%，而估计福尔马林固定时间的准确率仪为37．3％。分析发现不同观察区分标本组织的来源以及区分良恶性方面有很高的一致性，     

免疫荧光技术中不同固定剂对RhoA蛋白定位的影响

目的：观察免疫荧光技术中不同固定剂对SGC7901细胞中RhoA蛋白定位的影响,找出最适合观察RhoA蛋白细胞内定位的固定方法。方法：采用免疫荧光的方法观察在使用不同固定剂（2％多聚甲醛,4％甲醛,甲醇,丙酮,10％三氯醋酸）及0．3％TritonX-100穿孔的条件下,RhoA蛋白在SGC7901细胞中的定位。结果：用2％多聚甲醛固定,不用0．3％TritonX-100时,染色显示胞质内可见少量RhoA蛋白散在分布,核内则有RhoA蛋白浓聚;用0．3％TritonX-100后,质内只能见极少量阳性染色,核内蛋白染色变得清晰。甲醛固定后染色显示RhoA蛋白主要在核内分布,使用TritonX-100后染色更为清楚。甲醇和丙酮固定后染色显示RhoA蛋白主要在胞质内分布,核内基本未见阳性分布,加TritonX-100后核内染色增强,胞质染色减弱。另外,使用10％三氯醋酸固定未加TritonX-100时染色较淡,胞质胞核都可见,加TritonX-100后核内可见蛋白浓聚,胞质染色减少。结论：用免疫荧光法观察RhoA定位时,固定剂的不同以及是否加TritonX-100对观察RhoA蛋白细胞内定位具有较大的影响。     

不同固定液及固定时间对小鼠肝组织结构的影响

目的: 研究小鼠肝组织的最佳固定液及切片制作方法.方法:健康雄性成年昆明鼠,腹腔麻醉下取小鼠的肝脏中叶,分别入10%福尔马林、4%多聚甲醛、Bouin液及AAF液固定,固定时间为12、24及48 h.常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片,HE染色,观察比较不同固定液、不同固定时间下小鼠肝组织的光镜结构.结果: 10%福尔马林、4%多聚甲醛固定的肝组织小叶结构完整、清晰,肝细胞界限清楚,着色好,以固定24 h最为理想, 随固定时间延长,细胞出现过度收缩,细胞间隙有轻度增大,胞浆减少且部分细胞出现小空泡.Bouin液及AAF液固定的肝组织各时间点的肝细胞结构均不够完整,界限不清,胞浆中出现空泡,自溶现象明显.结论:肝组织固定剂首选10%福尔马林及4%多聚甲醛,固定时间以24h效果最佳.     

脑脊液中脑膜癌细胞CEA表达的研究

目的联合应用免疫荧光细胞化学技术和激光扫描共聚焦显微镜技术（LSCM）检测脑脊液中脑膜癌细胞CEA的表达部位并定量测定其荧光含量,探讨该技术在脑膜癌病诊断中的价值。方法应用免疫荧光细胞化学法以CEA标记脑膜癌细胞及对照组脑脊液细胞,采用LSCM技术获得脑膜癌细胞扫描图像并定量测定CEA荧光强度值。结果脑脊液中脑膜癌细胞的CEA表达为阳性,且部位在细胞浆中;CEA平均荧光值（36.80±17.17）,与对照组（4.87±1.86）相比差异有统计学意义（P〈0.01）。结论联合应用免疫荧光细胞化学法和LSCM检测脑脊液细胞中CEA的表达可为脑膜癌病的诊断提供可靠依据。     

HIVgp120对胎鼠背根神经节神经元突起生长的影响

探讨人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）gp120对体外培养的背根神经节神经元胞体和突起生长的影响。方法：分散培养的胎鼠背根神经节神经元用不同浓度的HIV gp120 (125、250、500?pmol/L和1?nmol/L) 处理,对分散培养的背根神经节神经元用MAP2免疫荧光标记后,用共聚焦激光扫描显微镜观察神经元胞体和突起的改变。结果：应用gp120后7?d,神经元突起的数目减少,长度变短,而神经元的胞体则没有明显变化。结论：HIV gp120可直接影响分散培养的背根神经节神经元突起的生长。     

甘草黄酮对S180和H22荷瘤小鼠肿瘤细胞DNA和RNA的影响

目的观察甘草黄酮对S180和H22荷瘤小鼠肿瘤细胞DNA及RNA的影响.方法Si8o和H2z荷瘤小鼠随机分为甘草黄酮高、中、低剂量(25、11.25、5.58 mg/kg)组,阳性对照(环磷酰胺25 mg/kg)组和阴性对照(生理盐水)组,各组均sc给药.运用激光扫描共聚焦显微镜技术与吖啶橙(AO)荧光探针技术结合检测单一肿瘤细胞DNA和RNA的变化情况.结果不同剂量甘草黄酮组和环磷酰胺组的DNA及RNA荧光强度较生理盐水组有不同程度的减弱;甘草黄酮高、低剂量组RNA/DAN值与生理盐水组比较差异无显著性;甘草黄酮中剂量组、环磷酰胺组RNA/DNA值较生理盐水组有非常显著提高(P＜0.01).结论甘草黄酮与肿瘤细胞DNA和RNA结合后抑制其进一步复制与合成,可能是其抗肿瘤作用的途径之一.     

二价锰和三价锰对神经瘤细胞线粒体膜电位的影响

采用 0 .2 5、0 .5 0、0 .75mmol/L的二价锰和三价锰分别对神经瘤细胞 (SH SY5Y)染毒 2 4h ,通过线粒体特异性染料罗丹明 1 2 3进行荧光标记 ,利用激光扫描共聚焦显微镜观察染毒细胞的膜电位变化 ,并与未染毒的细胞对照组进行比较。结果表明二价锰和三价锰均可引起线粒体膜电位的改变 (P <0 .0 5 ) ,且随剂量增高 ,有降低趋势。此外 ,在 0 .5 0mmol/L和 0 .75mmol/L剂量下 ,三价锰引起的线粒体膜电位改变比二价锰更为明显。提示线粒体膜电位的改变是锰神经细胞毒性作用的重要环节。     

凉膈散药物血清对脂多糖诱导体外培养巨噬细胞核转录因子-κB的影响

目的观察凉膈散药物血清对脂多糖(LPS)诱导的体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞核转录因子-κB(NF-κB)变化的影响．探讨凉膈散解毒作用的细胞信号转导调控机制。方法制备凉膈散药物血清；提取并体外培养小鼠腹腔巨噬细胞；以凉膈散药物血清及LPS共同刺激已培养细胞，免疫荧光法检测巨噬细胞NF-κB亚基p65，用激光扫描共聚焦显微镜观察并测定各组小鼠腹腔巨噬细胞核的p65的荧光表达情况。结果小鼠巨噬细胞经LPS刺激1h后，其核内的荧光强度(代表p65的表达量)显增强。与LPS刺激组相比：抑制剂TLCK组、凉膈散药物血清不同剂量组的荧光强度值均较低．有显性差异，以TLCK及凉膈散大剂量组强度值最低，中、小剂量组次之；空白血清不同剂量组则均无显差异。药物血清不同剂量组之间有显差异，呈剂量依赖性关系；空白血清不同剂量组之间无显性差异。结论不同剂量凉膈散药物血清均能抑制LPS所致的细胞核内p65升高，且呈剂量依赖性，这可能是凉膈散解毒作用的细胞信号转导机制之一。