猪外周血内皮祖细胞的分离培养及生物学特性

目的从小型猪外周血中分离、培养内皮祖细胞(EPCs),并进行相关鉴定,分析其生物学特性。方法采用密度梯度离心法获得小型猪外周血单个核细胞并进行体外传代培养,分别采用倒置相差显微镜观察、免疫荧光染色、流式细胞仪分析及Matrigel实验和DiI-acLDL摄取实验,对其细胞表型及功能进行相关鉴定。结果外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样形态;培养第14天,约80%的细胞DiI-acLDL吞噬实验阳性,且CD133、CD34、flk-1、CD31、CD144的表达阳性率分别达到25.1%、55.9%、97.7%、82.0%和95.4%;细胞培养于凝固的Matrigel表面7 d后,形成特征性的网格状结构。结论该实验成功从小型猪外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增诱导的过程中,表达EPCs和成熟内皮细胞的特征性标志。     

兔外周血内皮祖细胞的分离、培养和鉴定

目的研究兔外周血内皮祖细胞（endothelial progenitor cell,EPCs）的分离、培养方法,并鉴定其功能。方法从兔耳中央动脉采集兔外周血30ml,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,接种于人纤维连接蛋白包被的培养板上,分别予含20％胎牛血清低糖的DMEM培养基诱导培养,培养2周后通过免疫荧光、免疫组化、体外血管成形实验鉴定内皮祖细胞。结果兔外周血单个核细胞体外培养可成功获得内皮祖细胞,稳定表达内皮祖细胞相关抗原,并能在matrigel凝胶上形成稳定的血管腔样结构。结论兔外周血单个核细胞采用密度梯度离心及一定的培养条件能成功诱导、分化为内皮祖细胞。     

兔外周血内皮祖细胞的分离、培养和鉴定

目的:研究新西兰大白兔外周血内皮祖细胞(EOCs)的分离、培养和鉴定方法,为后续实验研究做好准备.方法:通过耳中央动脉采集兔外周血,密度梯度离心法分离单个核细胞(MNCs),在EGM-2培养基的诱导分化下,获得EOCs.通过标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)摄取试验、荆豆凝集素(FITC-UEA-1)结合实验、CD34与Ⅷ因子免疫组化染色、flk-1免疫荧光染色、体外血管形成实验以及细胞NO分泌功能测定,从细胞表面标记和细胞功能两方面对细胞进行鉴定.结果:新西兰大白兔外周血MNCs在体外培养可成功获得EOCs,EOCs能稳定摄取ac-LDL并与UEA-1结合,一致表达CD34、flk-1和Ⅷ因子相关抗原.EOCs能分泌NO,并能在matrigel凝胶上形成稳定的血管腔样结构.结论:密度梯度离心法分离的兔外周MNCs在一定的培养条件下能诱导分化成为EOCs.     

内皮祖细胞的生物学特性研究进展

内皮祖细胞在体内外能分化为成熟内皮细胞。目前,内皮祖细胞已被证实存在于成年人外周血,骨髓和人脐带血中。本综述总结了近年来内皮祖细胞的生物学研究进展,并讨论了其在心血管疾病中的潜在的治疗作用。     

外周血内皮祖细胞体外培养分化研究

目的从人外周血中分离、培养和鉴定内皮祖细胞(EPCs),并观察其在体外增殖分化过程中各种细胞表型的变化。方法采用密度梯度离心方法获得外周血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,于培养第7天选择免疫荧光(DiI-acLDL/FITC-UEA-Ⅰ)鉴定EPCs,并且用流式细胞仪和RT-PCR方法观察上述细胞在第0、4、10和21天的CD34、CD31、KDR和eNOS的表达变化。结果外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;第7天免疫荧光染色表明,约70%的细胞呈双荧光阳性;流式细胞仪分析显示,CD31和KDR表达在体外培养过程中逐渐升高,至第21天分别达到(72.1±11.2)%和(81.0±12.5)%,而CD34在第10天达到高峰(38.0±13.4)%后,第21天下降为(28.3%±12.2)%;RT-PCR结果表明,第4、10和21天eNOS的表达逐渐增强。结论本试验成功从外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增分化为成熟内皮细胞的过程中,CD31、KDR和eNOS等内皮细胞标志表达逐渐增强,而CD34的表达在内皮祖细胞的成熟分化过程中略有下降。     

外周血内皮祖细胞体外培养分化研究

目的从人外周血中分离、培养和鉴定内皮祖细胞(EPCs),并观察其在体外增殖分化过程中各种细胞表型的变化.方法采用密度梯度离心方法获得外周血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,于培养第7天选择免疫荧光(DiI-acLDL/ FITC-UEA-Ⅰ)鉴定EPCs,并且用流式细胞仪和RT-PCR方法观察上述细胞在第0、4、10和21天的CD34、CD31、KDR和eNOS的表达变化.结果外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;第7天免疫荧光染色表明,约70%的细胞呈双荧光阳性;流式细胞仪分析显示,CD31和KDR表达在体外培养过程中逐渐升高,至第21天分别达到(72.1±11.2)%和(81.0±12.5)%,而CD34在第10天达到高峰(38.0±13.4)%后,第21天下降为(28.3%±12.2)%;RT-PCR结果表明,第4、10和21天eNOS的表达逐渐增强.结论本试验成功从外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增分化为成熟内皮细胞的过程中,CD31、KDR和eNOS等内皮细胞标志表达逐渐增强,而CD34的表达在内皮祖细胞的成熟分化过程中略有下降.     

大鼠外周血内皮祖细胞分离培养与鉴定

目的 获得大鼠外周血内皮祖细胞(EPCs)并进行鉴定.方法 首先采用密度梯度离心法获得大鼠外周血单个核细胞,然后用EGM-2完全培养基体外培养条件下诱导单个核细胞分化为靶标细胞,最后分别用EPCs特异性标记物CD133和Flk-1检测及内吞乙酰低密度脂蛋白(ac-LDL)和荆豆凝集素-1(UEA-1)的能力,识别和鉴定靶标细胞.结果 靶标细胞培养至第6天呈纺锤形,梭状排列,具有与典型EPCs形态一致的生物学特征,CD133及FLK-1双抗体荧光检测结果阳性,内吞ac-LDL及UEA-1的能力实验结果阳性,证明该纺锤形细胞为EPCs.结论 通过密度梯度离心法及多细胞因子诱导大鼠外周血单个核细胞获得EPCs的方法可行,该方法可为EPCs的基础研究及临床应用提供理论与实验方法学基础.     

大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养及其生物学特性

目的：探讨大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养方法及其生物学特性。方法：采用二次贴壁法体外扩增培养大鼠骨髓内皮祖细胞,观测细胞增殖能力;免疫化学检测细胞CD133、CD34、Flk1、CD31的表达;三维培养细胞并观察其体外成血管能力。结果：细胞培养第4天集落样生长,呈圆形或梭形;第10天细胞长满瓶底,呈鹅卵石样外观。原代血管内皮祖细胞CD133、CD34、Flk1均表达阳性;第2代细胞CD34、CD31、Flk1均表达阳性,CD133表达阴性。三维培养第2代血管内皮祖细胞在胶原内有＂出芽式＂生长现象及管腔样结构形成。结论：体外扩增法可以从骨髓中分离培养出内皮祖细胞,三维培养发现其具有体外成血管能力。     

内皮祖细胞的分离培养及生物学特性的鉴定

目的 探讨大鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPC)体外诱导、培养和扩增的方法.方法 梯度离心法采集大鼠骨髓单个核细胞,分为血管内皮生长因子(VEGF)诱导组和非诱导组进行体外培养,应用免疫细胞化学和流式细胞术分别进行鉴定.结果 大鼠骨髓单个核细胞(MNC)经过培养,形成线样结构和类血管样结构,表达EPC特异性抗原CD133和内皮细胞(EC)的特异性抗原Ⅷ因子、Flk-1、和CD34,培养细胞同时具有EPC和EC的表面蛋白特性,且诱导组阳性细胞数多于非诱导组,形成特殊结构的时间早于非诱导组.结论 ①通过分离骨髓MNC进行诱导培养可以提高EPC的纯度.②VEGF可促进EPC的增殖和血管样结构的形成.③体外培养1周左右是EPC增殖的高峰期.     

健康人外周血单个核细胞体外诱导分化内皮祖细胞

[目的]将外周血单个核细胞诱导分化为内皮祖细胞,为冠心病缺血心肌血管新生提供理想的种子细胞来源.[方法]收集健康成人外周血,通过Ficoll离心法获得外周血单个核细胞,置于纤维连接蛋白预衬的EGM-2培养基中加以诱导,并通过相差显微镜和免疫荧光标记等方法对诱导分化后的细胞进行形态学观察和鉴定.[结果]在上述诱导分化条件下,外周血单个核细胞分化成为内皮祖细胞,倒置荧光微镜下呈典形的"纺锤样"梭形细胞,ac-LDL吞噬及lectin抗体荧光标记双阳性,FLK-1和VWF免疫荧光抗体染色均为阳性.[结论]成人外周血单个核细胞在特定培养条件下可诱导分化成为内皮祖细胞,内皮祖细胞可作为冠心病缺血心肌血管新生的种子细胞.     

人外周血来源的血管内皮祖细胞体外诱导分化

目的研究外周血来源内皮祖细胞的分离、培养、分化及鉴定方法。方法采集正常人外周血单个核细胞进行体外培养,通过免疫组化、免疫荧光和流式细胞术测定分化细胞表面特异性抗原的表达及其变化。结果培养7d后多数细胞贴壁生长,逐渐显示内皮细胞的形态特点,传代培养4周后呈典型铺路石样,并可继续稳定传代扩增;免疫组化和免疫荧光染色CD31、CD34、血管内皮细胞生长因子受体．2和vWF均呈阳性;流式细胞显示,经体外诱导培养后CD34^＋／AC133^＋细胞数明显增多。结论外周血来源的单个核细胞中含有能分化成血管内皮细胞的内皮祖细胞,其在一定条件下可稳定分化、扩增。     

脐带血中血管内皮前期细胞的分离

目的：从脐带血中分离单个核细胞以获得血管内皮前期细胞,并观察其生物学行为。方法：用密度为1.077的淋巴细胞分离液分离脐带血中单个核细胞,种植在铺有纤维连接素的培养板中,3 d后去除未附着细胞,观察附着细胞的生长情况,采用免疫组化法进行鉴定。结果：单个核细胞培养3 d后可见大量的附着细胞和少量梭形细胞,梭形细胞数量在第7天时达到高峰。附着细胞对第八因子相关抗原呈阳性反应。结论：在纤维连接素上培养来源于脐带血的单个核细胞可获得血管内皮前期细胞。     

人骨髓内皮前体细胞的体外培养和生物学特性

目的:体外分离纯化人骨髓内皮前体干细胞,研究其基本生物学特性.方法:利用密度梯度离心法分离成人骨髓得到单个核细胞,再用内皮细胞条件培养基培养得到内皮前体干细胞,观察细胞生长特性,通过检测细胞血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)、Ⅷ因子相关抗原抗体表达和透射电镜对培养细胞进行鉴定.结果:原代培养后细胞贴壁生长,7～10 d形成集落或融合呈卵石形,免疫组化荧光染色后结果显示VEGFR-2, Ⅷ/vWF 阳性,透射电镜显示细胞内具有特征性的W-P小体.结论:用密度梯度离心法和条件培养可以从骨髓得到高纯度内皮前体干细胞,该细胞具有与血管内皮细胞共同的特征,可以进一步分化为血管内皮细胞,是理想的组织工程种子细胞.     

胶质母细胞瘤干细胞的分离、培养及其生物学特性

目的：从人胶质母细胞瘤SC 326和SC 189细胞株分离培养干细胞,研究其自我更新、增殖和分化等生物学特性。方法：用无血清培养基培养人胶质母细胞瘤SC 326和SC 189细胞,检测细胞形成神经球的能力。对培养3代以上的细胞(GSC)进行神经球细胞单细胞克隆形成率实验;用第3代和第7代的细胞评价神经球单细胞克隆形成率;免疫荧光染色法检测神经球细胞的干细胞标记物表达及多向分化能力。结果：无血清培养基培养24 h时SC 326、SC 189
形成神经球样细胞团,1周时神经球内细胞可达数百个,3代内神经球细胞SC 326的增殖率为(2.10±4.33)%、(4.03±4.14)%和(6.91±5.12)%,SC 189为(12.79±2.32)%、(15.78±3.25)%和(37.91±4.58)%;单细胞克隆形成率GSC 326和GSC 189分别为5.56%和8.33%,次级单细胞克隆形成率分别为9.89%和14.58%;GSC 326 P3和P7神经球克隆形成率最大值为(12.67±2.86)%和(20.44±1.73)%,GSC 189 P3和P7神经球克隆形成率最大值为(32.00±1.00)%和(42.67±5.03)%。免疫荧光染色,干细胞表面标记物CD133和神经巢蛋白呈强阳性表达,分化标记物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性类β-微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ)表达极弱。分化诱导后分化标记物GFAP和β-TubulinⅢ的表达呈阳性。结论：早期原代胶质母细胞瘤细胞株中存在少量具有自我更新、增殖和多向分化能力的细胞,这些细胞具有明显的干细胞特性。
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人外周血来源内皮祖细胞与成熟血管内皮细胞生物学性状比较

目的:探讨成人外周血来源的内皮祖细胞(EPC)与成熟血管内皮细胞在抗原表达、细胞形态、增殖潜能和体内外血管生成方面的异同点.方法:密度梯度离心法获得单个核细胞,用含生长因子的内皮培养基接种于纤连蛋白包被的培养板中. 细胞在接种后每2 h去除1次未黏附细胞共2次,然后隔日换液1次,直到晚期克隆出现. 同期培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行比较. 流式细胞技术检测细胞表面抗原表达,直接荧光染色法测定细胞结合荆豆凝集素及摄取乙酰化低密度脂蛋白. 体外培养细胞的群体倍增次数确定细胞增殖潜能,胶原凝胶细胞体外种植及裸鼠体内移植实验分别测定体外及体内血管生成功能.结果:EPC在培养21～28 d出现,表现出典型的内皮细胞"铺路石"外貌. 与HUVEC相比,EPC表达高水平的CD36和KDR(EPC vs HUVEC, P<0.01),但表达CD146,结合植物凝集素和摄取乙酰化低密度脂蛋白在两种细胞间未存在统计学差异. 体外培养100 d,EPC和HUVEC分别传代46次和25次,只有EPC能在体外和裸鼠体内胶原凝胶中形成管腔样结构. 结论:人外周血来源的EPC虽然具备成熟内皮细胞的表型和形态特点,但仍保留干/祖细胞的完整生物学特征.     

兔外周血内皮祖细胞的培养与鉴定

目的研究兔外周血内皮祖细胞(EPCs)的分离和定向培养的方法,并对其功能进行鉴定。方法从兔股静脉插管抽取静脉血20 mL,采用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心法分离单个核细胞,接种于人纤连蛋白包被的培养板上,分别予含血管内皮生长因子(VEGF)20 ng／mL或内皮细胞生长添加剂(ECGS)30μg／mL的M199培养基培养。培养2周后进行免疫荧光染色鉴定内皮祖细胞。结果每毫升外周血可分离1×106～2×106个单个核细胞,两组均于接种后第2～3天细胞胞体增大,有的呈多边形或梭形;第4天出现条带或栅栏状分布;第7～8天梭形细胞增多;第14天左右出现细胞集落,其特点是中央为圆形细胞,外周是梭形细胞;添加VEGF的培养基组每接种5×105个单个核细胞出现5～10个细胞集落,而添加ECGS者出现8～15个。第4周,添加VEGF的培养基组的细胞开始脱落而死亡,而添加ECGS的细胞仍持续稳定生长,呈铺路石样分布。两组在荧光显微镜下均可见双阳性的EPCs,血管性假性血友病因子(vWF)染色阳性。结论采用VEGF和ECGS均可体外培养兔外周血内皮祖细胞,且均能使其诱导分化为内皮样细胞,而ECGS较VEGF诱导效果更佳。