人视网膜色素上皮细胞条件培养液对视网膜干细胞生物学特性的影响

目的观察人胚视网膜色素上皮细胞条件培养液(HRPE-CM)对人胚视网膜干细胞(HRSCs)体外生物学特性的影响。方法利用HRPE-CM模拟体内环境,分为对照组、表皮生长因子(EGF) 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)组和HRPE-CM组。体外培养HRSCs,通过细胞计数方法比较不同环境条件对HRSCs体外生物学特性的影响,并进一步鉴定其神经干细胞特性。结果与对照组比较,HRPE-CM对HRSCs有明显的促增殖作用(P<0.01);与EGF bFGF组相比较,HRPE-CM的促增殖作用也更为强大(P<0.01)。在HRPE-CM中培养的原代和子代HRSCs均表达Nestin,具有自我更新能力和多向分化潜能。结论HRPE-CM对HRSCs的增殖能力具有明显的促进作用,并且能很好地维持其神经干细胞特性。     

EGF与bFGF单独及联合应用对原代培养的兔角膜缘干细胞克隆形成率的影响

目的了解单独及联合应用表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(b-fibroblast growth factor, bFGF)对原代培养的兔角膜缘干细胞体外增殖的促进作用.方法进行兔角膜缘干细胞原代培养,用克隆形成率和蛋白质免疫印迹方法检测单独及联合应用不同质量浓度EGF与bFGF对干细胞增殖力的影响.结果角膜缘干细胞在本培养条件下能够正常生长.单独应用时,质量浓度为10 ng/ml的EGF和20 ng/ml的bFGF对干细胞的促增殖作用最强(P<0.01),10 ng/ml的EGF与20 ng/ml的bFGF联合应用可达到最佳的促干细胞增殖作用.蛋白质免疫印迹检测也得到了相符的结果.结论体外单独及联合应用EGF与bFGF对原代培养的兔角膜缘干细胞的增殖能力有明显的促进作用,为提供大量的角膜缘干细胞以治疗眼表疾病提供了实验基础.     

大鼠胚胎大脑皮层源性神经干细胞体外培养及增殖分化特点

目的 建立大鼠胚脑皮层神经干细胞体外培养及鉴定技术,探讨其增殖分化特性,为应用神经干细胞移植治疗神经疾病提供基础。方法 采用含有丝分裂源表皮生长因子(EGF)的无血清培养基培养SD大鼠孕14．5d的胚胎大脑皮层神经干细胞,应用免疫细胞化学方法了解其增殖分化特性;以单细胞克隆实验及BrdU免疫标记证实神经干细胞自我增殖能力。结果 培养细胞在EGF作用下可分裂增殖,并表达神经干细胞特异性抗原nestin,分化细胞MAP2及GFAP抗原表达阳性。结论 SD大鼠胚脑皮层可分离培养出神经干细胞;并具有增殖、自我更新能力和多向分化潜能特性。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

目的:探索大鼠胚胎神经干细胞的体外分离培养条件,并观察神经干细胞增殖、分化的特点.方法:从孕14 d SD胎鼠前脑组织分离神经干细胞,用DMEM/F12无血清培养液,加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),进行体外扩增、培养和传代.传3～4代的神经细胞球在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中贴壁诱导分化培养.采用免疫荧光法鉴定神经干细胞和分化的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞.结果:从孕14 d SD胎鼠前脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养液中能形成大量的神经细胞球,这些神经细胞球可在体外增殖及传代培养,经nestin染色鉴定,大部分为阳性细胞.神经细胞球在血清培养液贴壁培养后可分化出神经纤维细丝(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Gal-C)表达阳性的细胞.结论:从孕14 d SD胎鼠前脑分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,属于神经干细胞;在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,神经干细胞能在体外大量扩增.     

人胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

目的探索人胚胎神经干细胞的体外分离培养条件,并观察神经干细胞增殖、分化的特点.方法采用机械方法从流产的10～18周胎龄的人胚胎前脑分离神经干细胞,用无血清培养液,加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激细胞增殖,进行体外扩增、传代培养.传3～4代的神经细胞球在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液贴壁诱导分化培养.采用免疫荧光法鉴定神经干细胞和分化的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞.结果从人胚胎前脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养液中能形成大量的神经细胞球,这些神经细胞球可在体外增殖及传代培养.神经细胞球用特异性的鼠抗人巢蛋白(nestin)抗体鉴定,大部分为阳性细胞.神经细胞球在血清培养液贴壁培养后可分化出神经纤维细丝(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Gal-C)表达阳性的细胞.结论从人胚胎前脑分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,属于神经干细胞;在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,神经干细胞能在体外大量扩增.     

生长因子(EGF和PDGF-BB)对小鼠骨髓基质干细胞增殖的作用及其意义

目的探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和血小板源生长因子(platet-derived growth factor,PDGF-BB)对体外培养的小鼠骨髓基质干细胞(murine bone marrow stromal stem cells,mMSCs)增殖的作用,探索小鼠骨髓基质干细胞体外快速增殖的条件和方法.方法将小鼠骨髓基质干细胞进行分离和纯化培养后,加入EGF和PDGF-BB,利用3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入反映细胞增殖效果,倒置显微镜下观察细胞增殖及分化状态.结果EGF和PDGF-BB干预后,3H-TdR掺入(11456.14±968.86)dpm较对照组(3271.88±420.91)dpm明显增高,说明EGF和PDGF-BB可促进小鼠骨髓基质干细胞的增殖;倒置显微镜下观察可见EGF和PDGF-BB处理组mMSCs具有增殖优势,分化相对延迟,而对照组提前显示出自然分化现象.结论生长因子(EGF和PDGF-BB)可促进小鼠骨髓基质干细胞的增殖,是小鼠骨髓基质干细胞体外大量培养和快速增殖的有效刺激因子.     

EGF,bFGF单独及联合应用对原代培养的兔角膜缘干细胞增殖的影响

目的探讨EGF,bFGF及二者共同作用对培养的兔角膜缘干细胞增殖的影响。方法用DMEM和F12(1:1)培养基,20%胎牛血清,加入不同浓度EGF,bFGF和二者的混合液,采用MTT法检测细胞的OD值。结果EGF的5~160ng/mL各浓度组增殖效应均明显大于对照组(P<0.05),10ng/mL组明显大于其它各浓度组(P<0.01),bFGF各浓度组从5~80ng/mL各组均明显大于对照组(P<0.025),20ng/mL各组明显大于与其它各组(P<0.025);EGF与bFGF混合液各浓度组从5~80ng/mL各组增殖效应均明显大于对照组及单独使用EGF或bFGF组(P<0.05),EGF10ng/mL+bFGF20ng/mL组促增殖效果最强(P<0.025)。结论EGF,bFGF对培养的兔角膜缘干细胞有促增殖作用,此作用均呈剂量依赖性,EGF和bFGF共同表现为明显的促增殖作用。     

不同条件对胎鼠海马神经干细胞增殖分化的影响

目的:探讨不同条件对胎鼠海马神经干细胞的增殖与分化的影响.方法:从胎鼠海马获取神经干细胞;新生鼠坐骨神经获取雪旺细胞.培养成功后对细胞进行鉴定.将提取的神经干细胞放在不同的培养条件下:雪旺细胞与神经干细胞共培养、DMEM/F12 bFGF EGF及DMEM/F12进行比较,观察其增殖和分化的情况.结果:含雪旺细胞的共培养组神经干细胞生长分化得最好,bFGF EGF组次之,DMEM/F12组生长的最差;共培养组细胞团之间建立了良好的突触联系,尤其是远距离的细胞间更为明显.此现象在bFGF EGF组及DMEM/F12组则没有出现,且该两组生长速度也较共培养组差.结论:雪旺细胞能更好的促进神经干细胞的生长、增殖和分化,它为神经干细胞提供了与活体内相似的环境 .     

表皮生长因子与碱性成纤维生长因子对人牙髓干细胞增殖的影响

目的：探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)增殖能力的影响。方法：采用噻唑蓝（MTT）比色法分别测定不同浓度EGF和bFGF在不同时间,单独或联合应用对hDPSCs增殖能力的影响。结果：50 ng/ml EGF和20 ng/ml bFGF促hDPSCs增殖能力最强。以50ng/ml EGF、20ng/ml bFGF单独或联合作用,其促hDPSCs增殖能力均具有时间依赖性,第3 d、5 d、7 d, EGF、bFGF促hDPSCs增殖作用显著增强,二种生长因子联合作用,促增殖作用显著高于其单独作用效果,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：生长因子EGF和bFGF最大效应浓度分别为：50 ng/ml、20 ng/ml。EGF和bFGF单独作用均能显著促进hDPSCs的增殖,二者联合作用对hDPSCs的增殖有一定的协同作用。     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及其鉴定

目的:通过培养了解神经干细胞(neural stem cell,NSC)生物学特性,为深入研究其体内外分化奠定基础.方法:分离培养大鼠胎脑NSC.通过单细胞克隆实验检测其自我更新能力、增殖能力和生物学特性;免疫细胞化学检测NSC特征性标志nestin表达和分化能力;BrdU掺入实验检测细胞增殖状态;并比较EGF、bFGF对鼠NSC增殖刺激作用.结果:体外传代培养获得的NSC具有多向分化能力、很强的自我更新能力、表达nestin;NSC扩增迅速;传代培养的NSC性能稳定;联合运用EGF、bFGF对NSC增殖作用较单用强.结论:成功培养扩增了大鼠NSC;EGF、FGF联合作用能促进大鼠NSC增殖.     

Histological measurement of human retinal thickness

Ｍａｎｙｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａｌｄｉｓｅａｓｅｓａｒｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｒｅｔｉｎａｌｔｈｉｃｋｎｅｓｓ．Ｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ,ｒｅｔｉｎａｌｔｈｉｃｋｎｅｓｓａｎａｌｙｚｅｒ（ＲＴＡ）ｈａｓｂｅｅｎｄｅｖｅｌｏｐｅｄｔｏｂｅｕｓｅｄｉｎｖｉｖｏｔｏｍｅａｓｕｒｅｔｈｅｐｏｓｔｅｒｉｏｒｐｏｌｅｒｅｔｉｎａｌｔｈｉｃｋｎｅｓｓａｎｄｔｏｄｉａｇｎｏｓｅｉｎｓｕｃｈｄｉｓｅａｓｅｓａｓｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ,ｇｌａｕｃｏｍａ,ｍａｃｕｌａｈｏｌｅ,ｅｔｃ［１］．Ｔｈｅｓ…     

人视网膜色素上皮细胞培养方法的改进

目的:建立一种简单有效的人视网膜色素上皮细胞培养的改进方法。方法:先采用机械分离法将晶状体、玻璃体及视网膜神经上皮层剥离干净,去除前眼杯,然后用胰蛋白酶消化后眼杯,后再用机械分离法分离RPE层,将分离下的RPE层分散置入培养瓶中。结果:组织块1d后贴壁,7d后可见有黑色、圆形的RPE细胞缓慢爬出,10d后细胞变成扁平不规则多角形,约13d后细胞基本单层融合长满瓶底,形成典型的鹅卵石样。传代细胞生长活跃5～6d后达融合状态,细胞呈梭形及不规则形。Keratin免疫组化鉴定显示,所获细胞的纯度接近100%。结论:用此改良的方法,可以有效提高RPE细胞培养的数量和纯度。     

Immunocytochemical characteristics of cultured human retinal pigment epithelial cells

Rehnal Pigment epithelial cells (RPEC), as one ofthe most ~t cell layers in the eye, po~ a nof fUnctions cmcial in PreServing the integhty Of the visualsystem. The hantenance of healthy RPEC is critical fornOImal retinal funCtion, and the etiologies Of many retinaldisolders may have their Prifnaly origins in the pigment epitheliam. The PIDlilbmtion of RPEC in foe yi~s and onthe surfaCe Of retina is the pathological cause Of Pmlifelative yi~whnOPathy (PVR). On the other hand the a…     

大剂量葡萄糖诱导人视网膜内皮细胞凋亡的实验研究

目的检验大剂量葡萄糖水平对培养的原代人视网膜毛细血管内皮细胞(humanretinalcapillaryendothelialcells,HRCEC)的直接影响。方法HRCEC细胞从捐赠人眼中分离得到。细胞在含有5mmol/L或25mmol/L葡萄糖的培养基中培养6d。应用锥虫蓝染色测定细胞活力、流式细胞计数分析细胞周期、TUNEL分析细胞凋亡。结果HRCEC细胞在25mmol/L葡萄糖中培养6d,细胞活力显著下降。通过流式细胞计数和TUNEL测定,凋亡细胞的数目在大剂量葡萄糖培养基中显著升高。结论大剂量葡萄糖可诱导人视网膜毛细血管内皮细胞凋亡,这有可能是促进糖尿病性视网膜病发展的原因。     

原代人视网膜色素上皮细胞的冻存和复苏培养

目的 :观察对原代人视网膜色素上皮 (retinalpig mentepithelium ,RPE )细胞进行冻存和复苏培养的效果 .方法 :将 6只尸供眼 ,常规酶消化法分离、纯化的人原代RPE细胞 ,分为两组 ,实验组为即刻进行常规梯度降温液氮冷冻保存 ,1wk后行常规复苏培养 ;对照组为细胞直接进行后续实验 .台盼蓝拒染观察细胞存活率及生长状态 ;计算细胞贴壁率 ;初步计算克隆形成率 .结果 :RPE细胞存活率分别为试验组 (90± 7) % ,对照组 (87± 1 5 ) % ,两组相比无显著性差异(P >0 .0 5 ) ;两组接种细胞贴壁率从 2 4h开始分别为 (5 .0±3.1 ) %～ (6 1 .0± 7.3) %和 (1 5 .0± 6 .3) %～ (6 0 .0± 3.3) % ;培养 4 8h之前 ,两组之间存在统计学差异 (P <0 .0 5 ) ,4 8h之后组间无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;培养 5 ,7和 1 0d初步克隆形成率两组分别为 (1± 0 ) % ,(1± 1 ) % ,(3± 1 ) %和 (1±0 ) % ,(3± 1 ) % ,(2± 1 ) % ,组间无显著性差异 (P >0 .0 5 ,n=3) .冻存后复苏培养的RPE细胞生长状态良好 ,增生活跃 ,与对照组类似 .结论 :对原代人RPE细胞进行冻存 ,复苏培养的RPE细胞活性、存活能力、单细胞分裂增生能力不受影响 .     

人胎视网膜色素上皮细胞的冻存和复苏

目的：冻存和复苏人胎视网膜色素上皮细胞，为视网膜色素上皮移植治疗视网膜色素变性提供组织来源。 方法：取第3代胰酶消化法获取的人胎儿视网膜色素上皮细胞进行冻存，复苏后经台盼蓝染色测定细胞存活率，角蛋白抗体免疫细胞化学染色鉴定细胞。 结果：复苏后的视网膜色素上皮细胞在体外生长良好，抗角蛋白反应阳性，细胞具有较高的存活率［(84.9%±3.2)%］。 结论：冻存和培养RPE细胞为细胞移植提供了一个良好的来源。     

大剂量葡萄糖诱导人视网膜内皮细胞凋亡

目的 检验大剂量葡萄糖水平对培养的原代人视网膜毛细血管内皮细胞(human retinal capillary endothelial cells，HRCEC)的直接影响。方法 HRCEC细胞从捐赠人眼中分离得到。细胞在含有5mmol／L或25mmol／L葡萄糖的培养基中培养6d。应用锥虫蓝染色测定细胞活力、流式细胞计数分析细胞周期、TUNEL分析细胞凋亡。结果 HRCEC细胞在25mmol／L葡萄糖中培养6d，细胞活力显著下降。通过流式细胞计数和TUNEL测定，凋亡细胞的数目在大剂量葡萄糖培养基中显著升高。结论 大剂量葡萄糖可诱导人视网膜毛细血管内皮细胞凋亡，这有可能是促进糖尿病性视网膜病发展的原因。     

金雀异黄素诱导培养人视网膜色素上皮细胞凋亡

目的 :探讨金雀异黄素对培养人视网膜色素上皮细胞 (hRPE)的促凋亡作用 .方法 :将不同浓度的金雀异黄素作用于培养人视网膜色素上皮细胞 ,通过TUNEL染色和光、电镜的形态学观察 ,观察金雀异黄素对培养hRPE凋亡的诱导作用 .结果 :不同浓度的金雀异黄素可以诱导RPE凋亡 ,5 0mg·L-1 金雀异黄素作用 2 4h即有TUNEL阳性的凋亡细胞出现 ,作用时间在 2 4 ,4 8和 72h ,其凋亡细胞百分数的中位数分别为 7.6 % ,9.8%和 1 3.7% ;当金雀异黄素浓度为 75和1 0 0mg·L-1 时 ,以上 3个时间点凋亡细胞百分数的中位数分别为 1 0 .3% ,1 6 .4 %和 2 3.4 % ;1 5 .4 % ,2 1 .2 %和 35 .8% .透射电镜观察 ,5 0mg·L-1 浓度作用于细胞 ,胞核内染色体出现边集 ,表现凋亡的早期征象 ;75mg·L-1 作用呈现典型的凋亡特征 ;1 0 0mg·L-1 作用于细胞 ,除凋亡细胞外 ,部分细胞出现胞质的进行性溶解 ,有胞膜破坏现象 ,坏死细胞比例增多 .结论 :金雀异黄素可诱导RPE凋亡的发生 ,并有剂量和时间效应关系 .1 0 0mg·L-1 金雀异黄素使RPE坏死