大鼠Uqcrfs1重组质粒的构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的:构建大鼠Uqcrfs1的重组质粒并检测其在人胚胎肾293T细胞中的表达。方法:应用RT-PCR方法从大鼠肾脏组织总RNA中扩增出编码Uqcrfs1的cDNA,克隆至pUM-T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,酶切鉴定及测序正确后以磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK 293T细胞,使用RT-PCR、Western Blot方法检测重组质粒在转录及蛋白水平的表达。结果:测序结果证实PCR扩增得到编码Uqcrfs1的cDNA序列正确;磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,在基因转录与蛋白表达水平,结果达到预期。结论:成功构建大鼠Uqcrfs1的重组质粒,该重组质粒可在HEK293T中过表达。     

EPHX2基因过表达质粒的构建及意义探讨

目的：构建LETO、OLETF大鼠EPHX2基因过表达重组质粒,观察其在人胚肾细胞（human embryonic kidney 293T,HEK293T）中的表达,及对HEK293T细胞NF-κBp65 mRNA表达的影响.方法：提取LETO、OLETF大鼠肾脏组织总RNA,RT-PCR方法扩增编码EPHX2基因的cDNA,克隆至T-载体并测序,经亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,构建两型大鼠EPHX2过表达重组质粒,酶切鉴定并测序,采用磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞系.Western Blot方法检测EPHX2融合蛋白的表达,RT-PCR方法检测EPHX2基因过表达对HEK293T细胞NF-κBp65表达水平的影响.结果：（1）两个重组质粒均含有完整EPHX2 cDNA,测序证实OLETF型大鼠较LETO型大鼠EPHX2重组质粒有五个核苷酸位点的改变.（2）转染HEK293T细胞后,Western Blot证实融合蛋白成功表达;（3）TNF-α刺激增加HEK293T细胞中NF-κBp65 mRNA表达;（4）EPHX2基因过表达促进TNF-α刺激后的HEK293T细胞中NF-κBp65 mRNA表达升高（P〈0.05）.结论：成功构建LETO型及OLETF型大鼠EPHX2过表达重组质粒（L-EPHX2/V5、O-EPHX2/V5）,可在HEK293T细胞中过表达.为进一步探讨EPHX2基因在糖尿病肾病发生发展中的作用奠定了基础.     

大鼠ETFβ基因过表达对NADPH氧化酶基因表达的影响

目的:构建大鼠ETFβ的重组质粒并检测其在人胚胎肾293T细胞中的表达和对NADPH氧化酶的影响。方法:应用RT-PCR方法从大鼠肾脏组织总RNA中扩增出编码ETFβ的cDNA,克隆至pUM-T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,酶切鉴定后测序,测序正确后用磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK293T细胞,使用RT-PCR方法检测空载体组和重组质粒转染组的NADPH氧化酶各亚基mRNA水平的表达变化。结果:(1)测序结果证实PCR扩增得到编码ETFβ的cDNA序列正确;(2)磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,ETFβ融合蛋白成功表达;(3)RT-PCR结果显示重组质粒转染组的NADPH氧化酶5个亚基中的NOX3,NOX4的mRNA表达降低(P<0.05),空载体组和重组质粒转染组之间比较NOX1,NOX2,NOX5的mRNA表达差异无统计学意义。结论:成功构建大鼠ETFβ的重组质粒,该重组质粒可在HEK293T中过表达,并且降低了NADPH氧化酶NOX3,NOX4的mRNA表达水平。     

人FasL全长cDNA的克隆及其真核表达载体的构建

目的：克隆人FasL全长cDNA并构建其真核表达载体。方法：采用RT-PCR法从健康人外周血单核细胞中扩增包含全部阅读框架的FasI。全长cDNA，将之与pGEM-T：Easy质粒连接、测序。构建pcDNA3．1-FasL真核表达载体，用脂质体介导方法转染人直肠癌8348细胞，检测FasL表达情况。结果：RT-PCR扩增的FasL产物经限制性内切酶酶切后生成的片段符合预期大小。克隆测序证实所得的FasL cDNA序列与Gene Bank序列完全一致。pcDNA3．1-FasL重组质粒经：EcoRI XhoI双酶切后，电泳显示898bp目的片段和pcDNA3．1载体片段，证明重组质粒正确。转染直肠癌8348细胞后。用RT-PCR方法检测FasL表达阳性。结论：采用RT-PCR方法成功克隆了人FasL全长cDNA并构建了其真核表达载体．为进一步研究FasL功能奠定了基础。     

野生型DPP Ⅳ真核表达质粒的构建和鉴定

目的 构建野生型DPP Ⅳ真核表达质粒.方法 将野生型DPP Ⅳ基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1（＋）,构建成重组质粒pcDNA3 DPP Ⅳ;然后用限制性内切酶消化和DNA序列测定鉴定.结果 经酶切和DNA序列测定鉴定证实重组质粒构建正确.结论 真核表达质粒pcDNA3DPP Ⅳ构建成功,为进一步研究DPP Ⅳ基因在卵巢癌细胞中的表达和生物学作用奠定了基础.     

真核表达载体pcDNA3.1-β淀粉样前体蛋白裂解酶的构建及其在COS-7细胞中瞬时表达

目的 构建β淀粉样前体蛋白裂解酶（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme，BACE）基因的真核表达载体，为修复阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）损伤神经元奠定基础。方法采用RT-PCR方法，从人的成神经细胞瘤的总cDNA中，扩增出1．5kb的BACE cDNA片段，再用BamHI和XhoI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒；以免疫细胞化学法检测BACE基因的表达情况。结果人BACE基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1质粒中；经脂质体转染COS-7细胞后，并由潮霉素进行筛选，可见转染细胞胞浆中和胞膜上有较高量的BACE蛋白表达。结论成功构建了pcDNA3．1-BACE的真核表达载体，为研究BACE基因在AD发病机制中的作用及抑制BACE，为治疗AD奠定一定的实验基础。     

人血栓调节蛋白基因编码片段的克隆及在真核细胞中的表达

目的 构建人血栓调节蛋白（hTM）基因真核表达质粒，并导人两种真核细胞[非洲绿猴肾母细胞（COS-7细胞）和脐静脉内皮细胞（HUVECs）]中表达，为临床血栓病的基因治疗提供实验依据和物质基础。方法采用PCR法扩增hTM基因的表达片段，HindⅢ＋EcoR Ⅰ酶切后与pcDNA3．1（＋）／neo质粒连接成pcDNA3．1／hTM。经鉴定确认后，由阳离子脂质体包裹转染COS-7细胞及HUVECs，RT-PCR和免疫组化法分别检测转染后细胞hTM的mRNA及蛋白的表达。结果双酶切及测序鉴定均证实hTM基因表达片段被成功克隆，pcDNA3．1／hTM经脂质体介导能有效地转染COS-7细胞和HUVECVs。结论成功构建pcDNA3．1／hTM重组质粒，并且能在两种真核细胞中高效表达，为进一步的基因治疗和对TM抗凝机理研究提供了物质基础。     

HSPb1真核表达载体的构建及其在乳腺癌细胞中表达的研究

目的:构建重组人HSPb1真核表达载体质粒,为研究HSPb1与乳腺癌发生和化疗耐药的关系做准备。方法:从人乳腺癌细胞MCF-7中提取总RNA,RT-PCR法反转录合成cDNA。设计引物调取目的基因片段,与T载体连接后转化大肠埃希菌DH-5α,筛选菌落并抽提质粒。测序正确后双酶切克隆进入真核表达载体pcDNA3.1中,得到重组质粒pcDNA3.1-HSPb1。用pcDNA3.1-HSPb1转染人乳腺癌细胞MDA-MA-231,RT-PCR法和Western blot法鉴定重组质粒在其中的表达。结果:经酶切证实重组质粒pcDNA3.1-HSPb1含有目的基因HSPb1。RT-PCR和Western blot检测表明,mRNA和蛋白水平,转染细胞HSPb1的表达均明显增强。结论:pcDNA3.1-HSPb1真核表达载体构建成功,它在乳腺癌细胞中可高表达目的基因,为进一步研究HSPb1在乳腺癌发生及化疗耐药中的作用奠定了基础。     

表达人骨形成蛋白4的非复制型腺病毒的构建与鉴定

目的构建含有人骨形成蛋白4（human bone morphogenetic protein4,hBMP-4）的非复制型腺病毒表达载体pAdE/hBMP-4并检测其表达。方法酶切质粒pCS2（＋）/hBMP-4获得目的基因片段,克隆至真核表达载体pcDNA3.1（＋）,再亚克隆至pShuttle-CMV,电转化至含有pAdEasy-1骨架质粒的E.coliBJ5183/p中进行同源重组,重组质粒转染HEK293细胞包装成含有hBMP-4基因的非复制型腺病毒。病毒颗粒感染HEK293和HeLa细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western-blot检测。结果获得了含有目的基因hBMP-4的非复制型腺病毒表达载体pAdE/hBMP-4,酶切鉴定提示构建正确,RT-PCR检测到hBMP-4基因的转录,Western-blot检测到hBMP-4蛋白表达。结论将目的基因hBMP-4克隆至非复制型腺病毒表达载体中,为进一步研究其在基因治疗骨缺损中的应用奠定基础。     

人源性空回肠粘膜防御素-5基因的克隆

目的 克隆人防御素-5基因(HD-5 cDNA)，构建其真核表达质粒载体。方法 从人小肠粘膜中提取总RNA，并分离mRNA，经过逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出HD-5 cDNA，并将其插入经BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切的真核表达质粒载体pcDNA3．1( )中，构建重组质粒载体pcDNA3．1( )-HD5 cDNA。结果 经过限制性酶切鉴定和测序确定，HD-5 cDNA全长282bp，编码94个氨基酸，由编码信号肽、前片段和成熟肽的3部分序列组成。理论推导的氨基酸序列中，决定HD-5活性的6个半胱氨酸残基和2个保守的精氨酸残基处于正确的位置。结论 成功获得了HD-5 cDNA，构建了含HD-5 cDNA的真核表达质粒载体，为研究重组HD-5的抗菌功能奠定了基础．     

RECK基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的构建RECK(reversion-induc ing-cyste ine-rich prote in w ith Kazal motifs)基因的真核表达载体,通过脂质体介导法转染人肝癌细胞株HepG2并获得高表达RECK蛋白的细胞克隆。方法用RT-PCR方法扩增出人RECK基因,构建真核表达载体pcDNA3-RECK,采用脂质体介导法将重组质粒导入体外培养的HepG2细胞,RT-PCR和W estern b lot检测转染细胞和未转染细胞中RECK基因mRNA及蛋白质的表达。结果本实验成功构建了真核表达载体pcDNA3-RECK,并用脂质体介导的方法获得了高稳定表达RECK的细胞克隆;W estern b lot显示转染前的细胞未检测到RECK基因mRNA及蛋白质表达,但转染后表达量明显增高。结论重组质粒pcDNA3-RECK经转染能在HepG2细胞中高效表达,为进一步研究RECK对肝癌细胞的生物学影响奠定了基础。     

人β神经生长因子基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建人NGF-β基因真核表达载体并观察其在子鼠脊髓神经干细胞内的表达.方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从人脑肿瘤旁组织总RNA中扩增出750 bp片段,将其克隆至真核表达载体pcDNA3中经酶切鉴定产生750 bp和5.2 kd)的片段,完成序列分析.分离培养E14子鼠脊髓神经干细胞,以非脂质体转染试剂FuGENE HD介导质粒peDNA3-hNGFb转染培养第3代的细胞,应用免疫细胞化学和Western blot鉴定NGF-β在细胞内的表达.结果 RT-PCR产物为750 bp的片段,重组质粒peDNA3-hNGFb经双酶切产生750 bp和5.2kd)的片段,测序结果与文献报道结果完全一致.免疫细胞化学、Western blot结果表明NGF-β能在细胞中正确表达.结论 成功构建了peDNA3-hNGFb真核表达载体,其转染的子鼠脊髓神经干细胞能正确表达NGF-β.     

SD大鼠MSX-2基因真核表达载体的构建与功能鉴定

目的 构建SD大鼠颅颌面发育相关基因MSX-2与PcDNA 3.1融合的高效真核表达载体,为研究MSX-2基因的功能奠定基础.方法 根据SD大鼠MSX-2基因的核苷酸序列,设计并合成引物,采用PCR技术,扩增编码MSX-2基因,TA克隆到PMD18-T载体上,再亚克隆到真核表达载体PcDNA 3.1的BamHI和Xhol位点.对该重组体进行酶切鉴定,以及测序验证.重组体转染HEK293细胞,RT-PCR和Western blot检测重组MSX-2基因的RNA和蛋白表达情况.结果 重组真核表达载体PcDNA3.1-MSX-2经PCR扩增、酶切鉴定均显示有476bp左右的特异性基因片断,证明MSX-2基因正向插入真核表达载体中;碱基序列的测定证明重组质粒中含有SD大鼠的MSX-2基因序列.重组体转染HEK293细胞,RT-PCR和Western blot可检测到重组MSX-2基因的mRNA和蛋白的特异表达.结论 成功构建SD大鼠MSX-2基因的高效真核表达载体,为进一步研究MSX-2基因的功能及基因治疗奠定了基础.     

MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞株SMMC7721的作用

目的 观察MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞株增殖及侵袭能力的影响.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从肝癌组织中制备出含NheI和KpnI酶切位点的MAGE-A3目的 基因,克隆到pcDNA3.1(-)真核表达载体,并通过酶切鉴定、测序验证.经脂质体法正义瞬时转染肝癌细胞株SMMC7721,通过RT-PCR、Western blot分别检测MAGE-A3 mRNA和蛋白表达产量.以噻唑蓝(MTT)比色法、Boy-den小室实验观察MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞增殖及侵袭的影响.结果成功扩增出目的 基因;得到重组质粒pcDNA3.1-MAGE-A3,经过酶切鉴定与测序,结果正确;RT-PCR和Western blot检测显示,MAGE-A3基因mRNA及蛋白产物的表达水平明显高于未转染组和空载体组(3组MAGE-A3 mRNA量分别为7838、2847、1557,蛋白量分别为30938、24 088、29 654);转染组细胞数量增多,穿透Matrigel膜的细胞数显著增加,与未转染组和空载体组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建pcDNA3.1-MAGE-A3真核表达载体,转染人肝癌细胞株SMMC7721后可促进细胞增殖和侵袭能力,提示MAGE-A3基因在肝癌复发和转移中起到重要作用.     

HBx基因大鼠卵圆细胞株的建立及鉴定

目的 构建带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达质粒pEGF-HBx,建市稳定、高效表达乙型肝炎病毒x基因(HBx)的大鼠卵圆细胞株,以便进一步研究HBx基因和卵圆细胞在肝癌发牛过程中的作用和机制.方法 用PCR方法从质粒pcDNA3.1-HBx中扩增含Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的HBx基因序列.对增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-NI)及扩增的HBx目的 基因片段进行双酶切,纯化后用连接酶连接得到重组体pEGFP-HBx,将其转化大肠杆菌DHSα,抗生素筛选培养得到阳性克降,提取质粒后用双酶切和基因测序进行鉴定.通过脂质体介导将质粒pEGFP-HBx转染到大鼠卵圆细胞株(LE/6)中,经G418筛选,尤限传代后得到稳定表达EGFP-HBx融合蛋白的细胞株.分别采用RT-PCR和免疫细胞化学技术检测细胞株中HBx基凶的表达情况.结果 双酶切及基因测序结果均显示构建的pEGFP-HBx质粒中含有完整的HBx基因片段.将得到的抗性细胞株培养传代20次后仍表达强的荧光;RT-PCR及免疫细胞化学检测均发现HBx基因在抗性细胞(LE/6)中得到了稳定转录和翻译.结论 已成功构建带HBx基因的真核表达质粒pEGFP-HBx,获得了稳定、高效表达EGFP-HBx融合蛋白的大鼠卵圆细胞株,为进一步研究HBx基凶和卵圆细胞在肝癌发生过程中的作用和机制奠定了实验基础.     

睾丸特异性新基因T490真核荧光表达载体的构建及其表达

目的 构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的睾丸特异性新基因T490超表达质粒pDT490-EGFP,检测其在Hela细胞中的表达情况.方法 采用RT-PCR的方法从成年Balb/c小鼠睾丸组织中扩增T490基冈,将该基凶连接克降到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,再将T490和EGFP融合基因酶切下来,克隆到pcDNA3.1(-)真核超表达载体上,以构建重组质粒pDT490EGFP.将该重组质粒通过阳性脂质体Lipofectamine 2000导入Hela细胞系中,在荧光显微镜F观察转染24h后融合基因的超表达情况,并用RT-PCR的方法进一步证实目的 基因mRNA的表达水平.结果 RT-PCR获取编码T490基因的全序列cDNA,大小为508bp;DNA测序和PCR方法证实T490和EGFP融合基因成功克隆到真核超表达载体L;在荧光显微镜下,转染24h后的Hela细胞具有很强的绿色荧光;RT.PCR显示转染后的Hela细胞T490基因mRNA的表达明显.结论 重组质粒pDT490-EGFP构建成功,并在细胞内明显表达,此质粒可应用于研究睾丸特异性新基因T490的功能,为T490的生物学研究奠定基础.     

人VEGF-C基因荧光真核表达载体的构建和表达

目的:构建含有绿色荧光蛋白基因的人血管内皮生长因子C基因的真核表达载体,检测该基因在真核细胞中的表达,研究VEGF-C基因在淋巴管生成中的作用.方法:含有绿色荧光蛋白基因的质粒pEGFP-1通过末端平滑化,酶切获得5'(粘端)BamHI-EGFP-XbaI(平端)3'片断,已经构建的VEGF-C表达载体pcDNA3.1/VEGF-C通过末端平滑化,酶切获得5'-(粘端)BamHI-pcDNA3.1-目的基因-KpnI(平端)3',两片段连接构建含有绿色荧光蛋白的真核表达载体,琼脂糖凝胶电泳并测序检测插入片段的正确性.将该载体通过脂质体转染到真核细胞CHO中,观察绿色荧光蛋白在CHO细胞中的表达情况.通过G418筛选阳性转染细胞,提取总RNA,行RT-PCR,PCR产物琼脂糖凝胶电泳观察VEGF-C基因在CHO细胞中的表达情况.结果:琼脂糖凝胶电泳证实了插入EGFP片段的大小,测序结果证实了插入片段的正确性,CHO细胞中看到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR产物中含有VEGF-C cDNA.结论:成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的VEGF-C真核表达载体并检测到在真核细胞CHO中的表达.