fat-1转基因小鼠的构建与鉴定

目的构建和鉴定携带有外源fat-1基因的转基因小鼠。方法将fat-1基因的cDNA与动物表达载体pEF—neo连接,构建pEF-fat-1重组质粒,酶切、测序鉴定正确后,以显微注射法把线性化重组质粒注射到小鼠受精卵的雄原核中,并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中产出转基因小鼠,通过PCR、Southern blot杂交等方法确立阳性整合有目的基因的G0代小鼠。结果成功构建了pEF-fat-1重组质粒,将其显微注射到小鼠受精卵中,得到G0代小鼠,PCR、Southern blot杂交确立了4只整合有fat-1基因的首建鼠。结论fat-1基因可整合到小鼠体内,得到的转基因小鼠为研究fat-1基因的生物学功能提供了动物模型。     

逆转录病毒介导IL-2cDNA治疗小鼠淋巴瘤的研究

目的 :研究人白细胞介素 2 (hIL 2 )转基因小鼠淋巴瘤体内成瘤性。方法 :体外将hIL 2基因转入小鼠淋巴瘤p3 88细胞。用PCR、RT PCR、dotblot法检测hIL 2基因在细胞内的整合及表达 ,四甲基偶氮唑盐比色 (MTT)法检测转导细胞hIL 2分泌。体内试验将动物分为A9组、对照组和体内转染治疗组 3组。 17d后处死所有动物 ,观察肿瘤生长状况。结果 :hIL 2基因已成功地整合到小鼠p3 88细胞基因组内。p3 88/IL 2细胞分泌的hIL 2量为 3 7.4U·ml-1。A9组和体内转染治疗组动物肿瘤体积明显减小 ,与对照组肿瘤体积有显著性差异 (P <0 .0 5 )。结论 :hIL 2基因经体内或体外法转入p3 88/IL 2细胞后减弱了在小鼠体内的致瘤性     

乙型肝炎病毒纯合子转基因小鼠(adr 1.2)的培育

目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。 目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。 目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。     

基因打靶技术在转基因动物中的进展

80年代初发展起来的基因定位整合技术(gene targeting)以及同期建立的小鼠胚胎多潜能千细胞系(Es，emgbryonic stem cell)的体外培养方法，使转基因技术更加前进了一步，为人们在动物体内分析某一特定基因提供了有力的手段。转基因技术是将外源基因导入动物生殖细胞或ES细胞，也就是将动物原来没有的基因或不占主导地位的基因导入该动物的基因组中并使之表达，观察其表达后对动物产生的影响。而基因打靶技术则是应用外源DNA与染色体上一段与其具有高度同源性序列进行同源重组(homologous recombination)的原理使动物体内某种正常基因失活，     

转基因动物在医学及生物制药方面的应用

转基因动物(transgene animal)是指用实验的方法将外源基因导入某种动物的染色体基因组内进行稳定整合,其外源基因所决定的性状能够遗传给下一代的动物. 1974年, Jaenisch等将猿猴空泡病毒(Simian vacnolating virus 40, SV40)的 DNA注入小鼠的胚泡,发现 40%子代鼠的器官中整合有外源基因,从而首次成功地培育了转基因动物. 2000年 10月 2日,首只转基因猴"安迪"在美国诞生,这是世界上首次培育成功的转基因灵长类动物.近年来,随着分子遗传学和转基因技术的不断发展和完善,转基因动物与医学及生物制药研究的关系越来越密切,各种人类疾病转基因动物模型的不断建立,已经为许多疑难性疾病的发病机制研究提供了十分有用的材料.     

血管内皮细胞组织特异性表达人CD59基因转基因小鼠传代及表达检测

探讨外源基因在转基因动物中的遗传规律。方法：将血管内皮细胞组织特异性表达人CD59基因转基因昆明种雄性小鼠，与普通昆明种雌性小鼠交配。Southern-blot杂交确定子一代外源基因整合阳性转基因小鼠。RT-PCR方法用于子一代转基因小鼠人CD59转录水平筛选。以流式细胞术检测人CD59基因在子一代转基因小鼠蛋白质水平表达。结果：产子14只。7只外源基因整合阳性，其中雄性4只，雌性3只。转录水平检测发现3只出现所需的条带。继而对上述3只转录水平阳性的F1代小鼠白细胞行流式细胞术检测，白细胞膜表面人CD59表达均阳性。结论：转基因动物的遗传规律复杂，基因沉默可能是导致子代转基因动物不表达的重要因素。     

人β2m转基因小鼠的制备、筛选及鉴定

目的:制备人β2m转基因小鼠,研究HLA-B2704的表达.方法:应用显微注射将人β2m基因注入C57BL/6×昆明鼠和昆明鼠×昆明鼠F1代受精卵,出生动物及其后代经PCR筛选,采用斑点杂交和Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本行进一步鉴定和测定整合拷贝数,利用RT-PCR检测阳性鼠中人β2m转基因的表达.结果:6只原代仔鼠及7只它们的下一代(F1)带有人β2m基因.由微注射基因后移卵出生的86只小鼠中,C57BL/6×昆明鼠杂交仔鼠35只,其中4只阳性(11.4%),昆明鼠×昆明鼠杂交仔鼠51只,其中2只阳性(3.9%),含有人β2m基因的原代鼠×昆明鼠杂交仔鼠20只,其中7只阳性.整合的转基因均为单拷贝.Southern杂交证实上述阳性鼠确有转基因整合.阳性鼠的皮肤、结肠、睾丸和脾脏组织中均有人β2m转基因mRNA的表达.结论:在转基因动物制备中,C57BL/6×昆明鼠F1代明显优于昆明鼠×昆明鼠F1代.与人HLA-B2704基因相比,人β2m基因不易整合,其整合率与整合拷贝数均较低.得到的人β2m转基因小鼠能够将人β2m基因传给下一代并可与人HLA-B2704转基因鼠交配.     

1994年度卫生部医药卫生科学技术进步奖一等奖项目简介

1.珠蛋白基因小片段红系增强子及关键部位的发现与转β~E-珠蛋白基因鼠模型的建立(中国医学科学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室刘德培等)自1987年开始,以转基因动物为主要实验方法,从分子水平设计实验,将较大片段增强子及其关键作用部位的核心序列与β-基因构建多种重组体,检测其在转基因动物中的整合与人β-珠蛋白基因的表达,并从四维时空观察转基因动物的整体动态效应。课题组采用转珠蛋白基因鼠,从β-     

逆转录病毒介导IL—2cDNA治疗小鼠淋巴瘤的研究

研究人白细胞介素－２转基因小鼠淋巴瘤体内成瘤性。方法：体外将ｈＩＬ－２基因转入小鼠淋巴瘤ｐ３８８细胞。用ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ｄｏｔｂｌｏｔ法检测ｈＩＬ－２基因在细胞内的整合及表达,四甲基偶氮唑盐比色法检测转导细胞ｈＩＬ－２分泌。体内试验将动物分为Ａ９组,对照组和体内转当治疗组３组。１７ｄ后处死所有动物,观察肿瘤生长状况。结果：ｈＩＬ－２基因已成功地整合到小鼠ｐ３８８细胞基因组内。Ｐ３８８／ＩＬ－     

转基因表达的四环素调控系统

上世纪70年代．Jaenich等将SV40的DNA导入小鼠囊胚，并在子代小鼠组织中检测到了SV40 DNA，证明了外源性基因导入胚胎细胞并实现整合是可能的；80年代，Gordon等又建立了显微注射转基因动物技术。此后，该技术迅速发展，先后出现了多种建立转基因动物的方法，其应用渗透到多个研究领域，成为人们深入了解生物的遗传物质、研究基因功能、建立人类疾病的动物模型以研究疾病的诊断与治疗的一个有力工具。     

应用精原干细胞转染法建立HBV（adr型）转基因鼠

目前转基因动物的研究已在农业和医学等领域显示广阔的应用前景 ,但其研究进展缓慢 ,转基因技术仍是主要的制约因素之一。探讨新的简便而有效的转基因方法 ,提高转基因效率 ,是转基因动物研究中的重要课题之一。Brinster等 [1]( 1994 )率先进行通过精原干细胞转染建立转基因动物技术的研究。其原理是将外源基因转染到曲细精管内的精原干细胞 ,使其整合到干细胞染色体上 ,干细胞将可能长期保留有外源基因 ,因此该雄性动物所产生的精子 (精子由精原干细胞分化而成熟 )就有可能携带外源基因 ,由该精子受精而获得的子代动物就会携带外源基因。…     

基因小鼠在肿瘤研究中的应用

随着分子生物学研究的进展,特别是对癌基因表达、调控研究的深入,人们对人类肿瘤的认识已经从细胞水平深入到分子水平。转基因小鼠可以从不同时间、不同水平、多阶段、整体研究肿瘤的发生发展和治疗。１　转基因小鼠转基因小鼠是利用基因工程技术将外源基因导入受精卵雄原核或早期胚胎中,使之与小鼠染色体稳定融合并能传递给后一代的小鼠［１］。转基因动物研究始于７０年代未。１９７９年Ｍｉｎｔｚ将ＳＶ４０病毒基因导入小鼠早期胚胎,首次获得了携带有外源性基因小鼠。１９８０年,Ｇｏｒｄｏｎ将克隆的基因导入小鼠受精卵雄原核中,…     

庚型肝炎病毒全基因转基因小鼠的制备与遗传

目的：利用显微注射方法产生整合庚型肝火病毒（HGV）全基因的转基因小鼠，并研究HGV基因的遗传特性。方法：将含有HGV全长基因的载体线性化后，将目的基因DNA溶于显微注射用缓冲液，依常规方法进行显微注射，得到仔鼠后用PCR及基因组DNA Southern印迹法鉴定。阳性小鼠即为建立者（founder)上鼠，将founder小鼠与正常小鼠交配得到1代小鼠，随后将F1代阳性鼠与正常小鼠交配得到F2代小鼠。结果：共得到5只founder小鼠，其中4只与正常小鼠交配，得到F1代小鼠共41只，其中29只为阳性，阳性率为71％。F2代小鼠共21只，其中16只为阳性，阳性率为76％。结论：得到了整合有HGV全长基因的转基因小鼠，并证明HGV基因可以在转基因小鼠体内稳定传递。     

转基因小鼠模型与生命科学研究

转基因小鼠模型与生命科学研究成国祥，徐少甫（扬州大学农学院生物技术研究所）用实验手段将特定外源基因导入早期胚胎的细胞，由此整合到染色体上，并通过生殖细胞系传递给子代，这类整合外源基因的“新动物”被称为转基因动物。转基因动物体系打破了自然情况下的种间隔...     

慢病毒载体法制备红色荧光蛋白转基因小鼠

目的利用慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白(mRFP)转基因小鼠,并建立转基因小鼠的技术平台。方法将携带mRFP基因的慢病毒注入ICR鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,胚胎移植进假孕母鼠以获得仔代鼠,然后应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等鉴定并获得mRFP转基因鼠。结果移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎40枚给2只假孕母鼠,共获得仔鼠6只;利用体视荧光显微镜检测mRFP表达,在蛋白水平证实6只F0代中,2只(R3和R4)鼠耳高表达mRFP,其余的弱表达mRFP(R1、R2和R5)或荧光强度(R6)与野生型ICR鼠无明显差别,而DNA水平检测证实,6只F0代中,5只(R1、R2、R3、R4和R5)基因组中整合有外源转基因hUb-mRFP,预示基因型鉴定结果很好验证了体视荧光显微镜鉴定结果。此外,mRFP转基因首建鼠基因组中整合的mRFP基因可稳定遗传和表达。结论建立了慢病毒法快速制备转基因小鼠的技术平台,这为针对不同基因建立相应转基因小鼠以实现恒定或条件性的转基因过表达或RNA干涉(RNAi),并进而在体内解析相应基因功能和建立人类疾病模型等奠定了坚实基础。     

肝脏特异性可调控丙型肝炎病毒核心蛋白表达的转基因小鼠模型的建立

 【目的】制备TRE-HCV-C转基因小鼠，为四环素调控系统的体内研究提供了反应部分的转基因小鼠。以便与本实验室同时建立的调控部分的小鼠共同作用，为进一步建立双转基因小鼠模型奠定基础，更为丙型肝炎病毒核心蛋白（HCV-C）的发病机制的研究提供一个实用方便的模型。【方法】重组构建含有目的基因HCV-C、TRE序列和SV40polyA的转基因载体pTRE-HCV-C．以显微注射的方法将l_153kb的转基因片段注人BALB／C母鼠的受精卵．出生动物及其后代经PCR初步筛选出阳性．再经Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本行进一步鉴定。用转基因阳性小鼠和整合有肝脏特异性启动子ApoE和胛A基因的另一品系转基因小鼠杂交，得到子代F1小鼠，通过免疫组织化学来初步检测HCV-C在肝脏中特异性的可调控性的表达。【结果】产生了5只整合有TRE-HCV-C基因的首建鼠，以及它的子代也带有此基因。与基因组上整合有肝脏特异性启动子ApoE和rtTA基因的转基因小鼠杂交后，得到子代F1小鼠。特定时问与DOX作用后，小鼠肝脏的免疫组织化学结果表明，TRE-HCV-C小鼠为丙型肝炎病毒核心蛋白的发病机制研究提供了一个良好的动物模型工具。【结论】成功制备了HCV-C转基因小鼠，可利用四环素调控系统来研究HCV中的C基因对小鼠的作用，为进一步建立四环素调控系统调控下表达HCV-C基因双转基因小鼠模型奠定基础．也是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。     

用显微注射法制备携带Epstein-Barr病毒膜抗原基因--BLLF1的转基因小鼠

目的 :用显微注射法制备携带EB病毒 (Epstein Barrvirus,EBV)膜抗原 (membraneantigen ,MA)基因 BLLF1的转基因小鼠。方法 :对 38只昆明种小鼠进行超排卵 ,收集受精卵 ,将EBVMA基因 BLLF1显微注射到受精卵的原核内。将注射后成活且健康的受精卵移植到假孕母鼠的输卵管内使其发育直至分娩。PCR分析检测仔鼠基因组中转基因的整合。结果 :显微注射 6 77个受精卵 ,其中成活且健康的 32 0个 ,卵的成活率为 47.2 %。将其移植到 12只假孕母鼠的输卵管内 ,其中 2只鼠怀孕并产仔 12只 ,出生率为 3 .75 %。PCR分析 5只仔鼠基因组整合有BLLF1基因 ,整合率为 41.7%。结论 :携带EBVMA基因 BLLF1的转基因小鼠已制备成功     

肝脏特异性可调控丙型肝炎病毒核心蛋白表达的转基因小鼠模型的建立

【目的】制备TRE-HCV-C转基因小鼠，为四环素调控系统的体内研究提供了反应部分的转基因小鼠。以便与本实验室同时建立的调控部分的小鼠共同作用，为进一步建立双转基因小鼠模型奠定基础，更为丙型肝炎病毒核心蛋白（HCV-C）的发病机制的研究提供一个实用方便的模型。【方法】重组构建含有目的基因HCV-C、TRE序列和SV40polyA的转基因载体pTRE-HCV-C．以显微注射的方法将l_153kb的转基因片段注人BALB／C母鼠的受精卵．出生动物及其后代经PCR初步筛选出阳性．再经Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本行进一步鉴定。用转基因阳性小鼠和整合有肝脏特异性启动子ApoE和胛A基因的另一品系转基因小鼠杂交，得到子代F1小鼠，通过免疫组织化学来初步检测HCV-C在肝脏中特异性的可调控性的表达。【结果】产生了5只整合有TRE-HCV-C基因的首建鼠，以及它的子代也带有此基因。与基因组上整合有肝脏特异性启动子ApoE和rtTA基因的转基因小鼠杂交后，得到子代F1小鼠。特定时问与DOX作用后，小鼠肝脏的免疫组织化学结果表明，TRE-HCV-C小鼠为丙型肝炎病毒核心蛋白的发病机制研究提供了一个良好的动物模型工具。【结论】成功制备了HCV-C转基因小鼠，可利用四环素调控系统来研究HCV中的C基因对小鼠的作用，为进一步建立四环素调控系统调控下表达HCV-C基因双转基因小鼠模型奠定基础．也是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。     

转基因小鼠及其在免疫学研究中的应用

转基因小鼠(transgenic mice)是用注射等人工方法,将外源基因导入小鼠的受精卵中,再将它移植于假孕小鼠的输卵管内,使其历经正常的胚胎发育过程而培育成的携带外源基因的小鼠。这类小鼠不仅能表达外源基因,且可将其传给后代。1980年Gordon首次报道转基因小鼠后,迄今已有多种转基因小鼠问世,如:表达β-珠蛋白、人胰岛素、免疫球蛋白、细胞因子及其受体、乙型肝炎病毒以及小鼠和人类MHC抗原等基因的转基因小鼠。1989年10月在法国曾召开转基因小鼠在免疫学中应用的会议,讨论了许多关键问题,引起众多学者重视。目前,该类小鼠已成为现代免疫学研究中一类新型的实验动物。本文简述转基因小鼠的研究现状及其在免疫学研究中的应用。     

转基因小鼠与分子医学

１９８２年ＲｉｃｈａｒｄＤ．Ｐａｌｍｉｔｅｒ首先成功地建立了转基因“超级小鼠”，其方法是将大鼠生长激素的基因导入小鼠受精卵，所生小鼠不但生长速度加快而且体重增加。这一研究成果可以说是分子生物学的一个里程碑［１］。因为建立转基因小鼠涉及基因的克隆、拼接、向受精卵内的导入以及导入基因的检测等分子生物学技术，如果没有几十年来分子生物学技术的基础，建立转基因动物是不可能的。现在转基因动物技术已经被广泛用于医学研究的各个领域，其中应用最多的是转基因小鼠。用转基因小鼠的方法建立的人类疾病动物模型使医学研究进…