弓形虫SAG1成熟蛋白编码区基因在甲醇酵母中的初步表达

目的：分析弓形虫主要表膜蛋白SAG1在甲醇酵母高效表达系统表达的可行性。方法：在5′端和3′端引物分别引入EcoRI和SpeI酶切位点，PCR扩增SAG1成熟肽编码区基因，定向克隆到甲醇酵母分泌型表达质粒pMETαA中，构建不带6个组氨酸尾序列的重组质粒。重组质粒被PacI酶切下表达盒，氯化锂化学法转化腺嘌呤营养缺陷型毕赤甲醇酵母株PMD11和PMD16，通过腺嘌呤营养缺陷型选择培养基YPD筛选酵母重组子，并利用MM／MD选择培养板分析外源基因表达盒整合到重组酵母染色体中的方式。筛选甲醇利用野生型的重组酵母，用甲醇诱导表达，并分析SAG1的表达水平，从中筛选高表达转化子。结果：获得了经非同源重组整合到酵母染色体上的能有效利用甲醇作为唯一碳源的PMD11和PMD16转化株。在甲醇诱导后第3天，细胞裂解液SDS－PAGE检测开始出现分子量与目的蛋白预测分子量相同的蛋白带，但PMD11重组株中的该蛋白随培养时间延长而减少，而PMD16重组株中的目的蛋白量未见减少。上清中有40kDa和27kDa的两种蛋白，后的量大于前，并与SAG1成熟肽的大小一致，PMD16株的表达量大于PMD11株，总蛋白量约35μg/ml。结论：弓形虫SAG1基因可在甲醇酵母表达系统中表达，但PMD11宿主菌会降解外源蛋白，而缺失了蛋白酶的PMD16宿主菌能比较高效地表达、分泌SAG1成熟蛋白。     

弓形虫SAG1基因在大肠杆菌中的高效表达及重组抗原对弓形虫感染的检测

目的 在原核系统中高效表达弓形虫表面抗原SAG1并利用重组抗原检测弓形虫感染。方法 将截短的SAG1基因经PCR扩增后,定向亚克隆入原核表达载体pET-30a( ),酶切鉴定出阳性重组子并经序列测定证实读码框正确,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导表达,对融合的表达产物进行纯化和复性,通过免疫印迹和ELISA实验检测其特异的免疫反应性。结果 成功构建截短型SAG1在原核系统中的重组表达质粒,并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的31．58％。经过简易的纯化和复性过程,该重组抗原（rSAG1）能被弓形虫感染的人血清所识别。用rSAG1构建的ELISA试剂盒对弓形虫病的检测具有高度的敏感性和特异性。结论 截短型SAG1在大肠杆菌中得到了高效表达,重组抗原经纯化和复性后,能有效检测弓形虫的感染,可用于构建弓形虫病检测试剂盒。     

截短形式弓形虫SAG1抗原在大肠杆菌中的可溶性高效表达、纯化及免疫反应性鉴定

目的 在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫SAG1基因的截短片段，并进行纯化及免疫反应性鉴定。方法 利用，VcoI、HindⅢ双酶切，从本室建立的pET-30a( )-SAG1重组质粒中获取SAG1基因的截短片段，并将目的片段连接到经同样双酶切的质粒pET32a中，构建表达重组质粒pET-32a( )-trSAG1。将重组质粒转入E．coli BL21中并进行诱导表达。表达蛋白经Ni—NTA agarose纯化后，Western—blotting分析其免疫反应性。结果 成功构建重组质粒pET-32a( )-trSAG1，通过IPTG诱导得到了以可溶性形式表达的重组SAG1蛋白，相对分子质量40000，Western—blotting结果显示纯化的重组蛋白具有良好的免疫反应性，ELISA试验表明重组SAG1蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别。结论 在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达了弓形虫SAG1基因的截短片段，表达蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别，有望成为一种有价值的诊断抗原。     

弓形虫SAG1、SAG3基因的克隆和复合基因SAG1/SAG3真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫表面抗原SAG1、SAG3复合基因的真核表达重组质粒,为弓形虫疫苗的研制作准备。方法提取弓形虫基因组DNA;用PCR技术扩增出表面抗原SAG1、SAG3的基因,再分别重组入pGEM-T克隆载体;将pGEM-SAG1和pGEM-SAG3重组质粒分别经酶切、纯化后定向亚克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体,经PCR、酶切及测序等方法对重组子进行鉴定。结果从弓形虫基因组DNA中扩增出SAG1、SAG3基因;构建了pGEM-SAG1、pGEM-SAG3克隆质粒;成功构建pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3真核表达复合基因质粒,测序表明目的基因定向正确连接。结论构建了pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3复合基因表达质粒,为今后研制弓形虫复合多价疫苗提供候选抗原奠定了实验基础。     

弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆表达、纯化与鉴定

目的：构建弓形虫SAG1基因原核表达质粒,诱导表达重组蛋白SAG1,分离纯化并检测其免疫反应性。方法：设计一对特异引物,体外扩增SAG1目的基因（双酶切纯化后）定向克隆至质粒pET29a（＋）中,转化到大肠埃希菌（Escherichia coli）BL21,采用PCR、双酶切和测序等方法鉴定,并以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组蛋白的表达情况,经镍离子柱纯化重组蛋白后,用蛋白质印迹（Western blotting）分析与小鼠弓形虫阳性血清的免疫反应性。结果：重组质粒经PCR、双酶切反应和测序鉴定,产物的大小与结构均与预期值相符,经IPTG诱导后,稳定表达相对分子量（Mr）为28950的蛋白,纯化后的重组蛋白经Western blotting分析显示,与小鼠弓形虫感染血清有特异性反应条带。结论：成功构建重组表达质粒pET29a（＋）-SAG1,使弓形虫表面抗原SAG1在体外获得表达,分离纯化的SAG1重组蛋白有免疫反应性。     

弓形虫SAG1 ROP1基因及其复合抗原基因的核酸免疫研究

1　前　言刚地弓形虫是一种机会性致病原虫 ,寄生于宿主的细胞内 ,在机体免疫力下降的情况下 ,弓形虫大量增殖 ,可导致组织器官的损伤 ,引起弓形虫病。该病呈世界性分布 ,是严重危害人畜健康的寄生虫病之一。孕妇感染弓形虫后可导致早产、流产、胎儿发育畸形。此外 ,弓形虫病也是免疫功能严重低下患者 (如ＡＩＤＳ病人等 )的主要死亡原因。弓形虫病疫苗的研制一直是国内外专家关注的热点。已有研究表明 :采用死的弓形虫疫苗可以诱导体液免疫及Ｔｈ细胞的免疫应答 ,免疫原性低 ;减毒的弓形虫活疫苗存在虫株毒力恢复的潜在危险 ;基因工程疫苗…     

弓形虫复合基因SAG1-BAG1的构建、表达及重组抗原的免疫反应性分析

目的构建并表达弓形虫复合基因SAG1-BAG1及分析重组抗原的免疫反应性。方法利用PCR扩增弓形虫SAG1基因,利用RT-PCR扩增弓形虫BAG1基因,通过酶切连接分别将SAG1、BAG1基因克隆到pET28a表达载体中构建复合基因SAG1-BAG1。将质粒pET28a-SAG1-BAG1转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,Western-blot分析该重组蛋白的免疫反应性。结果复合基因SAG1-BAG1全长约1 407 bp,重组蛋白相对分子质量约为50 000,表达量约占菌体总蛋白的10%,Western-blot分析显示重组蛋白具有良好的免疫反应性。结论成功构建并表达弓形虫复合基因SAG1-BAG1。     

弓形虫表面抗原SAG2重组蛋白的表达及纯化

目的在大肠埃希氏菌（E．coli）中表达弓形虫表面抗原2（SAG2）,纯化制备重组蛋白rSAG2。方法采用聚合酶链反应（PCR）技术从弓形虫基因组中扩增出SAG2编码基因片段,以pMD-18T质粒作TA克隆,序列测定后亚克隆入表达载体pGEX-4T-2,并转化E．coliJMl09感受态菌,IPTG诱导表达rSAG2蛋白,重组rSAG2蛋白采用B—PER谷胱甘肽巯基转移酶（GsT）融合蛋白纯化试剂盒纯化并进行SDS—PAGE与免疫印迹（Western—blot）鉴定。结果SAG2编码基因扩增片段大小为469bp;测序结果显示,克隆的SAG2基因序列与GenBank中弓形虫RH株的同源序列（序列号GI：161925）完全一致;所诱导表达的含GST的融合rSAG2蛋白大小约43kDa,纯化后的rSAG2经SDS—PAGE电泳显示一条纯化条带;蛋白免疫印迹结果显示rSAG2能够被兔弓形虫感染血清所识别。结论在大肠埃希氏菌中融合表达了弓形虫SAG2重组蛋白,纯化的rSAG2蛋白具有一定的免疫活性。     

重组弓形虫SAG1蛋白免疫小鼠抗弓形虫攻击保护作用

目的 评价重组弓形虫表面抗原1(rTgSAG1)蛋白皮下免疫小鼠诱导的免疫应答及抗弓形虫攻击的保护作用. 方法 6周龄BALB/c小鼠60只,随机分为5组,分别以100 μl PBS、20 μg、40 μg、60 μg或80 μg rTgSAG1(溶于100 μl PBS)/只皮下注射免疫小鼠3次,间隔14 d.末次免疫后14 d,以RH株弓形虫速殖子1×104个/只灌胃攻击所有小鼠,每日观察小鼠健康状况.攻虫后第28天,处死小鼠.分离并计数肝和脑组织内速殖子,分离并计数脾淋巴细胞和小肠上皮内淋巴细胞(IEL),ELISA法检测血清IgG和小肠冲洗液IgA抗体水平. 结果攻虫后6-14 d,小鼠出现不同程度的被毛粗糙、采食饮水减少,PBS组存活率最低(33.3%),40 μg组最高(75%).40 μg组肝(79.60)和脑组织内荷虫数(16.88)低于PBS组(分别为94.43和19.48)(均P<0.05),脾淋巴细胞数(10.31)和IEL数(4.25)高于PBS组(6.24,1.64)(均P<0.01);40 μg组(P<0.01)、20 μg组和60 μg组(P<0.05)血清IgG抗体水平显著高于PBS组;各组肠液IgA抗体水平无明显变化. 结论 rTgSAG1蛋白皮下免疫小鼠能诱导产生抗弓形虫感染保护性免疫,40 μg为免疫的最适剂量.     

截短形式弓形虫SAG1抗原在大肠杆菌中的可溶性高效表达、纯化及免疫反应性鉴定

目的在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫SAG1基因的截短片段,并进行纯化及免疫反应性鉴定。方法利用NcoⅠ、HindⅢ双酶切,从本室建立的pET-30a( )-SAG1重组质粒中获取SAG1基因的截短片段,并将目的片段连接到经同样双酶切的质粒pET32a中,构建表达重组质粒pET-32a( )-trSAG1。将重组质粒转入E.coliBL21中并进行诱导表达。表达蛋白经Ni-NTA agarose纯化后, Western-blotting分析其免疫反应性。结果成功构建重组质粒pET-32a( )-trSAG1 ,通过IPTG诱导得到了以可溶性形式表达的重组SAG1蛋白,相对分子质量40 000,Western-blotting结果显示纯化的重组蛋白具有良好的免疫反应性,ELISA试验表明重组SAG1蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别。结论在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达了弓形虫SAG1基因的截短片段,表达蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别,有望成为一种有价值的诊断抗原。     

弓形虫 SAG1基因的表达及其诱导的细胞免疫应答

目的分析弓形虫 SAG1基因真核表达质粒的体外表达及其诱导小鼠的细胞免疫应答.方法重组表达质粒 pVAX1-SAG1瞬时转染 vero细胞, Western blot法检测在细胞中的表达.将重组真核表达质粒 pVAX1-SAG1及空质粒 pVAX1于 0、 4周分别经肌注免疫 BALB/c小鼠;第 8周杀鼠,取脾,分离淋巴细胞,分别经 ConA和抗原刺激,用 MTT法测定免疫鼠脾脏 T淋巴细胞转化率 ;使用直接免疫荧光法 ,用流式细胞仪对 CD4+、 CD8+ T细胞亚群进行测定;两组小鼠经弓形虫速殖子攻击感染,计算存活期.结果 Western blot法分析转染细胞,发现存在弓形虫感染血清识别的 26 000u的特异带,与理论值相符 ;抗原刺激小鼠脾 T淋巴细胞发生增殖反应 , 免疫组与空质粒对照组间差异有显著性 (P< 0.05),但 ConA刺激小鼠后,两组间差异无显著性 (P >0.05); T细胞亚群 CD4+、 CD8+动态分析 ,CD4+、 CD8+ T细胞数量均升高,免疫组与空质粒对照组差异均有显著性 (P1< 0.05, P2< 0.05).弓形虫攻击感染,免疫组鼠的平均存活时间较空质粒对照组延长.结论 真核表达质粒 pVAX1-SAG1在 vero细胞中获得表达 ,且能诱导 BALB/c小鼠产生细胞免疫应答.     

三种表达形式的SAG1基因对小鼠的免疫效果观察

目的 构建了三种表达形式的弓形虫主要表面抗原（SAG1）基因-表膜型,分泌型和细胞内型,并分别用于免疫BALB/C小鼠。结果 SAG1基因免疫小鼠后,表膜型和分泌型较细胞内型体液免疫出现早且反应强;细胞因子水平测试显示免疫后小鼠免疫后应趋向Th1型。攻击感染结果证实;表膜型和分泌型免疫小鼠较细胞内型免疫小鼠所获保护力强。结论 三种表达形式的SAG1基因的小鼠模型中免疫效果不同。     

刚地弓形虫P30两个不同片段的克隆、表达及鉴定

目的：构建刚地弓形虫(简称弓形虫)主要表面抗原P30基因的2个不同片段的克隆并进行表达、鉴定。方法：根据已发表的弓形虫P30基因序列，参考有关文献设计合成两对引物，用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出P30基因的两个不同片段，分别构建T-A克隆，经PCR扩增及酶切鉴定后，进行测序，再亚克隆入pMAL—p2质粒并转化DH5α感受态细胞，于氨苄青霉素LB平板上初步筛选阳性克隆，再经酶切及PCR扩增鉴定重组子。将重组子转入表达菌BL21，用IPTG进行诱导表达，并对所表达的蛋白以western blot鉴定，结果：成功构建相应的T-A克隆及pMAL—p2亚克隆，经诱导、表达和鉴定，证实2个表达产物均为目的蛋白，其分子量分别为70和73Ku。结论：成功获得弓形虫主要表面抗原P30的2个表达产物，为其进一步的纯化及应用奠定了基础。     

弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建弓形虫微线体蛋白MIC3的真核表达质粒,为进一步研究MIC3蛋白功能奠定基础。方法PCR扩增弓形虫MIC3目的基因,将纯化的目的基因插入到真核表达质粒PCDNA3．0,并转入DH5ct宿主菌中,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切和PCR扩增方法对重组质粒进行鉴定。结果重组质粒PCDNA—MIC3经单双酶切及PCR扩增都得到以原插入片段MIC3基因1120bp大小相同的片段。结论成功构建弓形虫MIC3基因真核表达质粒PCDNA—MIC3．     

VB环境下刚地弓形虫多媒体课件的开发

目的 利用Visual Basic(VB）开发刚地弓形虫多媒体教学课件，探索VB环境下课件开发技术。方法 依据本科教学大纲的要求收集相关文本、图像、影音资料，撰写软件脚本。将所收集资料数据化并予以加工。在Windows98和B5.0(SP3）环境下进行软件的设计、编译与调试。结果 开发出了一套集文本、图像、动画、音频、视频于一体、符合教学需要的交互式多媒体课件。结论 VB可较好地应用于人体寄生虫学等基础医学课程多媒体课件的开发。     

风湿性疾病患者血清弓形虫抗体检测分析

目的：了解风湿性疾病患者弓形虫感染的情况。方法：采用ELISA法对346例风湿性疾病患者进行血清弓形虫IgG、IgM检测。结果：在被检患者中,IgG阳性率21.68%,其中男性阳性率17.00%,女性阳性率16.34%,两者比较无统计学意义（P〉0.05）;IgM阳性率20.52%,其中男性阳性率17.62%,女性阳性率17.10%,两者比较无统计学意义（P〉0.05）。类风湿性关节炎（RA）、系统性红斑狼疮（SLE）、风湿热（RF）患者IgG阳性率分别为23.83%、20.46%、20.59%,明显高于多发性肌炎（PM）、皮肌炎（DM）、干燥综合征（SS）患者的12.50%、10.00%、15.38%（P〈0.05）。RA,SLE,RF患者IgM阳性率分别为21.24%、21.59%、23.53%,明显高于PM,DM,SS患者的12.50%、10.00%、7.69%（P〈0.05）。结论：风湿性疾病患者弓形虫感染率较高,尤其是RA,SLE,RF患者。