β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌对乳糖细胞毒性的缓解作用

目的体外评价β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌缓解乳糖对细胞毒性作用的效果。方法建立乳糖细胞毒性作用Caco-2细胞模型,采用形态学观察及细胞增殖活性等指标检测该菌对乳糖细胞毒性的作用效果。结果成功建立乳糖细胞毒性作用Caco-2体外模型,所构建的β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌能够保护细胞耐受乳糖毒性而呈现正常形态,并能提高乳糖作用下的细胞活性（P〈0．01）。结论β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌在体外可显著的降低乳糖的细胞毒性作用,为进行其食品级改造奠定了基础。     

应用AdEasy腺病毒改良载体系统构建携带β-半乳糖苷酶基因重组腺病毒的实验研究

组腺病毒Ad-B-gal,病毒滴度达(2.5～4.0)×1011EFU/ml;感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10时对HEK293细胞48 h转染率达70%,并在X-gaJ试剂作用下,细胞旱现蓝色.结论 成功构建了携带β-gal基因的重组腺病毒,能高效感染293细胞.并功能性表达β-半乳糖苷酶.     

德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的非融合表达

目的在大肠杆菌中非融合表达德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶,为构建能高效表达β-半乳糖苷酶的食品级益生菌株奠定基础。方法选择德氏乳杆菌保加利亚亚种(1.1480和wch9901)β-半乳糖苷酶基因(lacZ)起始密码ATG上游-18bp到ATG下游1bp的一段包含SD位点和ATGA位点的序列为上游引物,PCR扩增lacZ,插入表达质粒pMG36e构建重组表达质粒。转化大肠杆菌,筛选阳性克隆,提取重组质粒进行酶切鉴定和测序,并测定转化菌β-半乳糖苷酶活性。结果重组质粒酶切鉴定合格;其中插入的外源片段序列与德氏乳杆菌保加利亚亚种lacZ标准序列符合率达99%以上;携带重组质粒pMG36e-lacZ1.1480的大肠杆菌DH5α酶活性为3.074U/mL,酶比活性为6.939U/mgpro;携带重组质粒pMG36e-lacZwch9901的大肠杆菌DH5α酶活性为4.755U/mL,酶比活性为8.537U/mgpro。结论成功在大肠杆菌中非融合表达了德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶;本研究选择的SD位点和ATGA位点能在大肠杆菌中有效地引导蛋白的非融合表达。     

细菌内同源重组快速构建和制备表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒

目的 :利用细菌内同源重组快速构建重组腺病毒质粒和制备重组腺病毒。方法 :制备感受态BJ5 183,将pAdEasy - 1转化BJ5 183,制备含 pAdEasy - 1的BJ5 183感受态 ,将线性化的 pShuttle -CMV -LacZ转化含 pAdEasy- 1的BJ5 183感受态菌。采用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒 pAdEasy - 1-LacZ。pAdEasy - 1-LacZ用PacⅠ线性化后 ,再用LipoVec介导其转染至AD2 93细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒 ,采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。采用X - gal染色观察LipoVec介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况。将纯化的AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC ,X -gal染色观察基因转染效率及基因表达情况。 结果 :pShuttle -CMV -LacZ成功地转化了含 pAdEasy - 1的BJ5 183,并在其内发生了同源重组。X - gal染色证实了 pAdEasy - 1-LacZ转染AD2 93后 ,产生了重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。病毒滴度为 3.9× 10 12 pfu/ml。AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC后 ,β -gal在HVSMC中得到了有效表达。 结论 :细菌内同源重组法是一种快速构建重组腺病毒质粒的方法 ,AdEasy - 1-LacZ的制备为基因治疗研究提供了一良好对照载体。     

-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌对乳糖细胞毒性的缓解作用

目的体外评价Β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌缓解乳糖对细胞毒性作用的效果。方法建立乳糖细胞毒性作用CACO-2细胞模型,采用形态学观察及细胞增殖活性等指标检测该菌对乳糖细胞毒性的作用效果。结果成功建立乳糖细胞毒性作用CACO-2体外模型,所构建的Β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌能够保护细胞耐受乳糖毒性而呈现正常形态,并能提高乳糖作用下的细胞活性(P<0.01)。结论Β-半乳糖苷酶基因工程乳酸菌在体外可显著的降低乳糖的细胞毒性作用,为进行其食品级改造奠定了基础。     

体外连接法快速高效构建表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒载体

目的:采用体外连接法构建和制备重组腺病毒Adeno-X-LacZ,为构建具有治疗价值的重组腺病毒载体奠定基础。方法:PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切pShuttle2-LacZ穿梭质粒,回收4.6 kb的LacZ基因表达盒,与经过相同酶切的Adeno-X病毒DNA连接,连接产物用SwaⅠ酶切,最终产物转化DH5α。重组质粒用PCR法和PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切鉴定。pAdeno-X-LacZ用PacⅠ线性化后,用脂质体介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒,采用CsC l密度梯度离心法纯化重组腺病毒Adeno-X-LacZ。采用X-gal染色观察Adeno-X-LacZ在AD293细胞内包装和HVSMC表达情况。结果:PCR扩增可见312 bp特异性条带,PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切重组质粒后释放出4.6 kb LacZ基因表达盒。X-gal染色证实了在AD293细胞内成功扩增包装出重组腺病毒Ad-eno-X-LacZ和LacZ基因在HVSMC中得到有效表达。结论:体外连接法是一种快速、简便、高效的构建重组腺病毒质粒的方法,本研究为构建具有治疗价值的重组腺病毒奠定了基础,Adeno-X-LacZ为研究腺病毒介导的基因转移提供了一良好的对照载体。     

大肠杆菌β-半乳糖苷酶ED和EA的克隆、表达及活性测定

目的：制备大肠杆菌β-半乳糖苷酶（β- galactosidae）酶供体(ED)和酶受体(EA)片段,获得具有全酶活性的β-半乳糖苷酶。方法：以pSV-β- galactosidase control vector为模板设计引物,用PCR方法获得ED和EA片段DNA序列,插入克隆载体pGEM-T-easy中,获得重组质粒,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将酶切目的片段分别插入原核表达载体pET20b+,并转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导表达出ED、EA融合蛋白,以亲和层析纯化蛋白,通过ED与EA蛋白形成β-半乳糖苷酶、全酶活性试验来判断ED、EA的功能。结果：获得与pSV-β- galactosidase control vector一致的ED、EA碱基序列,构建了重组表达质粒pET20b-ED及pET20b-EA,并分别转化入大肠杆菌DE3,以IPTG诱导行SDS-PAGE电泳,在相对分子质量为14 000及116 000处分别可见ED蛋白和EA蛋白条带,应用镍凝胶亲和层析纯化获得目的蛋白。结论：成功地制备了ED、EA蛋白,形成全酶活性的β-半乳糖苷酶。     

保加利亚乳杆菌β-半乳糖苷酶基因的扩增及其影响因素

目的 通过扩增得到保加利亚乳杆菌编码高效β-半乳糖苷酶的基因,并探讨影响扩增的因素。方法 采用溶菌酶加冻融法提取细菌DNA;选取不同的模板浓度、退火温度分别进行扩增。结果 模板浓度60ng／μl、退火温度66℃是保加利亚乳杆菌β-乳糖苷酶基因的较优扩增条件。结论 优化了扩增保加利亚乳杆菌β-半乳糖苷酶所需的退火温度、模板浓度等条件,提高了扩增产物的产量。     

阴道毛滴虫衰老生物学标志分子β-半乳糖苷酶基因克隆和蛋白表达

目的:克隆并分析阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis,Tv)衰老生物学标志分子β-半乳糖苷酶(β-gal)同源基因,表达β-GAL重组蛋白。方法:从Tv cDNA表达文库中分离获得Tv β-gal同源基因的cDNA克隆,测序和序列分析。将cDNA部分片段亚克隆到原核表达载体(pQE-80L),转化宿主菌E.coli SG13009,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鉴定。结果:在Tv cDNA文库中获得1株2445 bp的cDNA克隆。序列分析表明,该序列开放读码框有2415 bp,推测肽链具有804个氨基酸,等电点为5.4;该肽链与多种来源的β-GAL同源蛋白均具有较高同源性。用PCR扩增了该cDNA序列中的2277 bp片段,构建了pQE-80L/Tv β-gal,所表达重组蛋白产物的相对分子质量为82 ku。结论:推测该克隆是Tv β-gal的同源基因,Tv β-gal基因可以在E.coli中得到表达,为进一步研究其细胞内定位和蛋白功能奠定了基础。     

嗜酸乳杆菌推定的β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的功能性表达

目的在大肠杆菌中诱导表达以嗜酸乳杆菌克隆β-半乳糖苷酶基因lacZ,为研究其酶学特性做准备。方法从嗜酸乳杆菌ATCC4356中克隆lacZ基因,并构建表达载体pET22b—lacZ-H、pQE31-H-lacZ和pQE31-lacZ,然后在大肠杆菌中诱导表达,并测定表达产物的β-半乳糖苷酶活性。结果无标签的重组嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶LacZ获得了功能性表达,表达量可达2．28kU／L．而融合His-Tag的重组嗜酸乳杆菌LacZ却失去了β-半乳糖苷酶活性,即使复性也不能恢复。结论克隆表达的成功为该酶的酶学性质研究和可能的应用打下了基础。     

何首乌饮对Leydig细胞衰老模型β-半乳糖苷酶表达的影响

目的:探讨何首乌饮对eydig细胞衰老模型β-半乳糖苷酶表达的影响.方法:采用3 β-HSD特异性染色鉴定体外培养的大鼠睾丸Leydig细胞,分为正常组、Leydig细胞衰老损伤组、何首乌饮预防组和何首乌饮治疗组,用50 μ mol/L的H2O2和100μmol/L的FeSO4处理Leydig细胞建立Leydig细胞衰老模型.观察各组Leydig细胞β-半乳糖苷酶表达的变化.结果:正常组Leydig细胞无β-半乳糖苷酶表达.与正常组比较,衰老组Leydig细胞β-半乳糖苷酶的表达明显升高(P＜0.05);何首乌饮预防组、治疗组Leydig细胞β-半乳糖苷酶的表达明显低于衰老组(P＜0.05),何首乌饮治疗组、预防组Leydig细胞β-半乳糖苷酶的表达比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:何首乌饮可通过降低β-半乳糖苷酶的表达保护睾丸Leydig细胞衰老损伤.     

不同年龄大鼠VSMCs培养及衰老相关β-半乳糖苷酶的表达

目的：培养出不同年龄组SD大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）,探讨VSMCs复制衰老过程。方法：取出主动脉,0．2％Ⅱ型胶原酶溶液消化分离细胞,培养,按比例1：3传代。免疫细胞化学鉴定平滑肌细胞β-actin。制备老年组、年轻组的第2．6、11代细胞爬片,用SA-β-gal工作液染色,显微镜下计数蓝染细胞阳性,计算衰老细胞率。结果：免疫细胞化学染色显示细胞纯度在95％以上。细胞衰老β-半乳糖苷酶染色显示随代龄增加,衰老细胞数量增加（P〈0．05）;第6、11代龄,老年组衰老细胞率较年轻组高。结论：1．单纯Ⅱ型胶原酶消化法可以成功培养出不同年龄组大鼠主动脉VSMCs。2．培养的SD大鼠VSMCs表现出复制衰老过程,这可能为探讨细胞衰老及其与年龄相关的疾病机制提供新的视角。     

β-半乳糖苷酶供体片段定点突变、表达、纯化与活性分析

目的构建含ε-NH2标记位点的克隆酶供体免疫分析（CEDIA）系统供体片段。方法从大肠杆菌基因组克隆β-半乳糖苷酶（β-gal）的α片段基因,通过定点突变在原精氨酸位点处引入赖氨酸突变,与硫氧环蛋白（Trx）融合表达后与Δα片段进行酶学互补活性分析。结果克隆的α片段为β-galN端1-56多肽片段,定点突变得R14K、R53K和R14K/R53K等3种突变体。融合表达产物经亲和层析后纯度达到90%以上,且4种α片段的纯度基本一致。各纯化产物显示了不同的酶学互补活性,其中R53K突变体的活性远高于R14K和R14K/R53K的,且与野生型α片段的基本一致。结论α片段R53K突变体具有作为CEDIA系统含内部标记位点供体的潜力。     

嗜热芽孢杆菌β-半乳糖苷酶发酵条件研究

以嗜热芽孢杆菌为菌种,研究发酵生产β－半乳糖苷酶的条件。应用均匀设计法优化发酵培养基组成,结果为（ｇ／Ｌ）：乳糖０．５、蛋白胨２．０、牛肉浸膏２．０、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０１。在温度５５℃、初始ｐＨ７．０、摇床转速２００ｒ／ｍ ｉｎ 和１０％ 接种量条件下,发酵２４ｈ,β－半乳糖苷酶酶活力达１３．２Ｕ／ｍ Ｌ。在乳糖水解反应中,证实该酶能催化转半乳糖苷反应,合成半乳糖低聚糖。     

四环素基因表达调控系统调控β-半乳糖苷酶基因在肝癌细胞中的表达

目的：构建调控β-半乳糖苷酶（β-gal）基因表达的四环素基因表达调控载体,验证其在肝癌细胞内调控β-半乳糖苷酶基因的表达,为进一步利用该调控系统调控治疗基因治疗肝癌奠定实验基础。方法：根据2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因与pcDNA3.1载体的基因核苷酸序列,设计引物,以pcDNA3.1载体为模板进行PCR。将具有串联2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因的PCR产物连接入pcDNA3.1载体CMV启动子下游,构建成pcDNA3.1-TetO2载体,应用ABI 3130 测序仪利用pcDNA3.1-TetO2载体对TetO2 PCR产物进行测序分析。再将β-gal克隆入pcDNA3.1-TetO2载体,构建成受四环素调控表达的β-半乳糖苷酶基因的表达载体pcDNA3.1-TetO2-β-gal。利用脂质体将携带四环素调控子基因（TR）的pcDNA6/TR载体转染到肝癌细胞HepG2中,利用杀稻瘟菌素进行细胞转染的稳定筛选,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TR基因在HepG2细胞内的表达。将pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体转染到稳定表达pcDNA6/TR的HepG2细胞中,转染3～4 d后,给予强力霉素（4 mg•L^-1）,利用β半乳糖苷酶原位染色试剂盒染色,检测β-半乳糖苷酶基因的表达。结果：构建的pcDNA3.1-TetO2载体测序结果表明,串联2个四环素调控子结合位点（TetO2）基因片段插入到pcDNA3.1载体CMV启动子基因下游。pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体酶切鉴定结果表明,β-gal成功地克隆入pcDNA3.1-TetO2载体。RT-PCR结果显示,TR基因在pcDNA6/TR转染的经杀稻瘟菌素筛选的HepG2细胞内得到稳定表达。给予强力霉素后,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞 内得以表达;而未给予强力霉素,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞内表达受到抑制。结论：成功地构建了调控β-半乳糖苷酶基因表达的四环素基因表达调控载体,利用该载体成功地调控了β-半乳糖苷酶基因在HepG2细胞内的表达。     

异常黑胆质成熟剂对D-半乳糖致衰老模型大鼠p16蛋白、β-半乳糖苷酶表达的影响

目的探讨异常黑胆质成熟剂（ASMq）对D-半乳糖致衰老模型大鼠P16蛋白、β-半乳糖苷酶表达的影响,以此阐明异常黑胆质成熟剂延缓衰老作用的部分机制。方法选取3个月龄雄性 SD 大鼠60只,体质量180～220 g,采用 D-半乳糖制作亚急性衰老模型,随机分为衰老模型组及 ASMq高、中、低剂量组各15只（ASMq高、中、低剂量分别为6．0、3．0、1．5 g·kg-1·d-1）,连续给药21 d。另取15只正常雄性大鼠作为正常对照组。采用免疫组织化学方法检测各组大鼠心、脑、肝组织中 P16蛋白、β-半乳糖苷酶的表达。结果各组大鼠心、脑、肝脏组织中 p16蛋白、β-半乳糖苷酶表达阳性的细胞表现为细胞浆染成黄褐色。与正常对照组比较,衰老模型组心、脑、肝组织中的P16蛋白、β-半乳糖苷酶的表达明显升高,差异有统计学意义（P ＜0．05～0．01）;与衰老模型组比较, ASMq高、中、低剂量组心、脑、肝组织中 P16蛋白、β-半乳糖苷酶的表达明显下降,差异有统计学意义（P ＜0．05～0．01）。结论 ASMq可降低衰老大鼠P16蛋白、β-半乳糖苷酶的表达,从而发挥抗衰老作用。     

成纤维细胞体外培养过程中β-半乳糖苷酶的变化

目的 观察正常人成纤维细胞老化过程中β-半乳糖苷酶的变化规律。方法 取正常人二倍体成纤维细胞进行传代培养，以不同代次的细胞为实验对象，通过细胞生长曲线、群体倍增时间和β-半乳糖苷酶染色等一系列检测方法，对成纤维细胞老化过程进行了观察。结果 随着成纤维细胞的连续传代培养，SA-β-Gal表达呈现从弱(在年轻细胞中占4％)到强(在老化细胞中占60％)的趋势、结论 为建立成纤维细胞衰老模型提供了实验依据。     

大肠癌组织中β-半乳糖苷结合蛋白-3与β-葡萄糖醛酸苷酶表达的意义

目的:通过观察β-半乳糖苷结合蛋白-3(Galectin-3)与β-葡萄糖醛酸苷酶(β-G)在大肠癌组织中的表达,与大肠癌的生物学特征进行比较,以探讨其临床意义.方法:采用SP免疫组织化学方法检测98例临床新鲜标本,其中包括15例癌旁正常大肠黏膜组织及83例大肠癌组织中galectin-3和β-G的表达情况,并进行两种蛋白的表达相关性分析. 结果:Galectin-3和β-G蛋白在浸润程度深、分化程度低及Dukes分期较晚的大肠癌组织中的表达高于浸润程度浅(0.15±0.03 vs 0.16±0.05, P=0.02)、分化程度高(0.15±0.012 vs 0.16±0.03, P=0.03)及Dukes分期较早(0.18±0.06 vs 0.17±0.05)的大肠癌组织(P<0.05);在大肠癌组织中,galectin-3的表达和β-G的表达呈正相关(r=0.628,P<0.01). 结论:Galectin-3和β-G的异常表达在大肠癌的发生、发展中起着重要作用,具有一定的诊断价值.     

产冷活性β-半乳糖苷酶的菌株的筛选、鉴定及酶特性研究

目的 筛选新的产冷活性β-半乳糖苷酶的菌株,为解决目前工业用β-半乳糖苷酶耗能大、pH要求高的难题创造条件.方法 通过含X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的筛选培养基在油田附近土壤中分离纯化菌株并进行鉴定,以邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物测定酶特性.结果 获得了一株新的产冷活性β-...     

不同类型标本的衰老相关-β-半乳糖苷酶染色方法

目的：研究衰老相关-β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)组化染色在不同类型组织切片中的应用。方法：比较血涂片、冰冻切片及石蜡切片在不同条件下SA-β-Gal的显色效果。结果与结论：冰冻切片结果良好;石蜡切片经抗原修复后,结果不及未经抗原修复者;血涂片以g／L多聚甲醛固定min者效果最佳。SA-β-Gal可用于不同类型的组织标本。