人视网膜母细胞瘤细胞系SO—Rb50克隆株染色体畸变的观察

目的:研究SO-Rb_(50)细胞系三个克隆株MC_2、MC_3、MC_4染色体畸变的差异。方法:对MC_2、MC_3、MC_4的第11代进行G-显带核型分析。结果:三个克隆株细胞的染色体数目和结构均有异常,出现不同类型的染色体畸变。细胞染色体核型分析见假二倍体核型,13号染色体畸变仅见于个别核型且在三个克隆株中畸变情况不同。发现5个标记染色体,其中标记染色体M_1出现频率最高,几乎见于每个细胞,是由1号染色体长臂部分重复构成(t(1;1)qter-p35::q24-ter);另外还有几个异常标记染色体M_2,M_3,M_4和M_5分别见于各个克隆株细胞。标记染色体M_4和M_5为2号染色体的变化,是在该细胞系染色体变化动态研究中首次发现。结论:SO-Rb(50)在体外培养连续传代后仍存在不同的克隆株,结合以往对该细胞系染色体畸变的动态研究,不同代数的瘤细胞染色体结构畸变有差异,进一步证明体外培养连续传代过程中染色体结构畸变呈动态变化。我们认为13号染色体的畸变不是Rb发生的唯一原因;1号染色体的变化与本细胞系的永生关系密切,其与Rb发生、发展的关系值得深入研究;其它染色体变化为继发改变。眼科学报1998;14:220～223。     

视网膜母细胞瘤细胞系SO—Rb50瘤细胞Rb基因突变动态变化研究

目的：研究SO－Rb50细胞系瘤细胞Rb基因突变的动态变化。方法：1．用Southern blot杂交法分析SO－Rb50细胞系第327代瘤细胞DNA。2．用PCR－SSCP法对SO－Rb50细胞系第415代及第713代瘤细胞的Rb基因27个外显子和1个启动子逐个筛查。3．将SO－Rb50细胞系的第775代克隆出3个细胞株：MC2、MC3及MC4。用PCR－SSCP－HA法对MC2、MC3及MC4第11代细胞和MC3第138代细胞的Rb基因的27个外显子逐个筛查。结果：SO－Rb50细胞系第327代细胞DNA缺失3．5Kb、2.9Kb及1.0Kb的三条带,证明SO－Rb50细胞系瘤细胞Rb基因缺失。第415代瘤细胞Rb基因第23外显子少一条单链;第713代第25外显子发生新的突变。SO－Rb50细胞系第775代的3个克隆株MC2、MC3及MC4的第11代细胞,只有MC4第24外显子突变;而MC3第138代第24外显子突变,提示MC3经多次传代后第24外显子发生新突变。结论：SO－Rb50细胞系在长期培养传代过程中,瘤细胞的Rb基因突变有动态变化。     

视网膜母细胞瘤中MGMT启动子区甲基化状态及其产物表达

目的 检测视网膜母细胞瘤（RB）中,O⁶-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（MGMT）基因启动子区甲基化状态及mRNA、蛋白产物的表达情况,并探讨其与RB临床、组织病理学特征的可能关系。设计 实验研究。研究对象 石蜡包埋RB组织20例,RB细胞系4株（Y79、SO-Rb50、SO-Rb50/VCR、WERI-RB1）。方法 采用甲基化特异性聚合酶链式反应（MSP）检测20例石蜡包埋RB组织及4株RB细胞系MGMT启动子区甲基化状态,并进一步以实时荧光定量PCR及蛋白印迹确认MGMT mRNA、蛋白的表达。收集患者临床资料（如性别、发病年龄等）,并对RB组织标本HE、免疫组织化学染色切片进行组织病理学诊断,判断组织病理学特征（如肿瘤侵犯范围、虹膜新生血管等）。主要指标 MGMT启动子区甲基化状态,MGMT mRNA及蛋白表达水平,患者临床及组织病理学特征。结果 20例石蜡包埋RB组织标本中,12例（60%）MGMT启动子区为部分/完全甲基化,余8例（40%）未甲基化,甲基化与未甲基化组的临床及组织病理学指标不具有统计学差异（P>0.05）。Y79、SO-Rb50、SO-Rb50/VCR 3株RB细胞系MGMT启动子区为部分甲基化;WERI-RB1细胞系MGMT启动子区为未甲基化。4株RB细胞系均有不同程度MGMT mRNA及蛋白的表达,WERI-RB1 MGMT mRNA表达水平（1.000±0.040）高于其他3株细胞系（Y79,0.617±0.026;SO-Rb50,0.356±0.020;SO-Rb50/VCR,0.389±0.017）,差异具有统计学意义（P＜0.05）,WERI-RB1 MGMT蛋白表达水平（1.506±0.493）略高于其他3株细胞系（Y79,1.388±0.304;SO-Rb50,1.495±0.212; SO-Rb50/VCR,1.406±0.547）,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 在RB组织及细胞系中,存在较高的MGMT启动子区甲基化率,MGMT甲基化状态可影响其产物表达水平。（眼科, 2012, 21： 121-126）     

BIGH3基因的Arg555Trp突变引起颗粒状角膜营养不良

目的　阐明颗粒状角膜营养不良(CDGGⅠ )的发病机制。 方法　采用聚合酶链式反应 -单链构象多态性(PCR SSCP)分析,对 1个CDGGⅠ病例进行BIGH3基因第 12号外显子的突变筛查,并对发现的异常泳动带进行DNA测序,以确定突变位点。 结果　CDGGⅠ患者在 12号外显子有Arg555Trp突变。 结论　BIGH3基因突变Arg555Trp是导致CDGG1的原因。     

四联重复肽包含基因4基因在正常人眼及其他组织中的表达

1999年，苏冠方等克隆出人类四联重复肽包含基因4（TTC4）基因，并于2000年发现该基因在基因组中的结构，共有10个外显子，其mRNA长度为2．1kh。该基因存在于人类染色体1p31。由于人类1号染色体长臂经常于多种恶性肿瘤发生时呈现缺失性改变，极有可能有一个或几个肿瘤抑癌基因存在于此区域。因此，TTC4基因可能为一抑癌基因。[第一段]     

散发性视网膜色素变性视紫红质基因突变筛查

目的研究中国人散发性视网膜色素变性（sporadic retinitis pigmentosa，SRP）患者视紫红质（rhodopsin，RHO）基因突变频率及特征，揭示其在SRP发病机制中的潜在作用。方法运用聚合酶链反应一单链构象多态性（polymerase chain reaction—single—strand conformation polymorphism，PCR—SSCP）结合DNA测序技术，对80例SRP患者和80例健康对照者进行RHO基因5个外显子的突变筛查。结果SRP患者RHO基因5个外显子PCR扩增产物经SSCP分析后，发现其电泳带型与对照组一致，均包括2条单链带和1条双链带，且电泳迁移率相同，即在患者和对照组中均未检测到RHO基因突变。结论中国人SRP患者RHO基因外显子的突变率较低；PCR—SSCP分子遗传学方法快速、简单、灵敏，适用于大批量RP患者的基因变异筛查。（中国眼耳鼻喉科杂志，2008，8：351—353）     

视网膜母细胞瘤相关基因研究进展

视网膜母细胞瘤(RB)是婴幼儿常见的眼内恶性肿瘤,严重危害患儿的视力、眼球,甚至生命.RB起源于视网膜胚胎发育阶段,其发生和发展与人类第1个分离克隆的抑癌基因RB1密切相关.RB12个等位基因的失活是RB发生和发展的基础.近年来,随着分子生物以及基因工程技术的迅猛发展,RB相关基因研究取得了一定进展.研究发现,RB的发生和发展除了存在RB1基因突变外,还存在许多染色体层面的改变,癌基因MYCN、鼠双微体4(MDM4,又称MDMX)、驱动蛋白家族成员14(KIF14)、DEK、E2F3,以及抑癌基因钙粘连素11(CDH11)等也在RB的发生和发展中发挥驱动作用.现就RB相关基因的研究进展进行综述,从DNA分子水平认识RB的发生和发展规律,为基因治疗RB以及临床医师制定治疗方案提供科学依据.     

常染色体隐性遗传视网膜色素变性CNGA1基因突变检测

目的检测常染色体隐性遗传视网膜色素变性患者杆体α—cGMP门离子通道基因（α—cGMP—gated cation channel，CNGA1）基因突变。设计对照性实验研究。研究对象35名常染色体隐性遗传视网膜色素变性（autosomal recessive retinitis pigmentosa，ARRP）家系的先证者和55名散发病例。随机收集100名正常人作为对照。方法采集患者外周血，应用DNA分离试剂盒提取DNA，应用11对CNGA1基因引物进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），扩增CNGA1基因的全部编码区及内含子外显子的拼接区。利用单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）技术，将PCR产物进行10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用硝酸银染色，观察有无变异带。如果发现变异带，再将该PCR产物进行DNA测序。主要指标通过PCR，SSCP和DNA测序技术，发现CNGA1基因突变。结果未发现CNGA1基因突变。结论CNGA1基因突变在国人RP患者中的致病情况有待进一步研究。     

我国原发性开角型青光眼患者TIGR基因突变筛选、克隆及序列分析

目的　研究我国原发性开角型青光眼 (primaryopenangleglaucoma,POAG)患者小梁网糖皮质激素诱导反应蛋白 (trabecularmeshworkinducedglucocorticoidresponseprotein ,TIGR)基因的突变情况。方法　 (1)应用聚合酶链式反应 (polymerasechainreaction ,PCR)方法扩增 70例POAG患者、2 0例正常对照组的TIGR基因 3个外显子 (7对引物 )的各个片段 ,应用单链构像多态 (single strandedconformationpolymorphism ,SSCP)筛选可能突变的PCR产物。 (2 )将筛选出的样本 (PCR产物 ) ,克隆到PT Adv载体 ,以EcorI酶切鉴定重组质粒 ,然后用ABI 373自动测序仪行双向测序。结果　 (1)用SSCP方法筛选的 2例POAG患者在TIGR基因第 3外显子中部 (第 6对引物 )片段出现单链带型异常 ;正常对照组未见异常。 (2 )克隆测序的 2例样品 ,1例在 388密码子位置出现由GAT突变为AAT ,氨基酸由天冬氨酸替换为天冬酰胺 ,即Asp388Asn ;另 1例碱基序列无变化。提示我国POAG患者TIGR基因突变仅为 1 4% (1/ 70 ) ,远较国外为低。结论　我国POAG患者的发病机制可能与TIGR基因突变有关 ,但突变率较国外低 ,提示POAG发病存在地区或种族之间的差异。     

角膜格子状营养不良

角膜格子状营养不良(LCD)为常染色体遗传病，目前发现的基因突变除伴有全身病变的LCDⅡ为第9号染色体-geldin基因突变外，余均为第5号染色体长臂3区1带BIGH3基因不同外显子突变所致，包括外显子4、11、12、14等多个不同基因位点的突变。过去LCD通常分为4个不同类型-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、ⅢA型，目前随着对本病的分子遗传学的深入研究，不断有新的BIGH3基因突变位点被发现，一些突变类型不论在临床特点、组织病理学特征、超微结构上均与传统分型有所不同，有时表现界于两种类型之间，不能归属于任何一型，即中间型，因而向传统分类方法提出了挑战。     

人视网膜母细胞瘤SO-Rb_(50)细胞系单克隆方法探索

目的:为了使培养细胞的遗传性状、生物学特性相似,利于多种实验研究,而对视网膜母细胞瘤SO-Rb_(50)细胞系进行克隆。方法:用多孔塑料板克隆细胞法,对SO-Rb_(50)细胞进行克隆及分离培养。结果:没有菊花团形成的Rb细胞克隆成功,而有菊花团的Rb细胞、连续三次克隆均不能成功。结论:提示分化好的Rb细胞难以克隆成功。眼科学报 1996;12:79—82。     

视网膜母细胞瘤细胞株SO-Rb50及SO-Rb70对六种抗癌药物敏感性测定

目的 利用体外培养的视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,Rb）细胞株筛选对Rb敏感的化疗药物。方法 采用噻唑蓝（3,-4,5 Dimethyliazol tetrazolium bromide,MTT）法对SO-Rb50和SO-Rb70瘤细胞株进行更生霉素、长春新碱、鬼臼噻吩甙、柔红霉素、顺氯氧铂、平阳霉素6种药物体外敏感实验．结果 6种药物作用于SO-Rb5048小时50％抑制浓度（50％ inhibitory concenrtation,IC50）值（μg／ml）分别为0.0004、0.0016、0.0389、0.047、0.29、0.44．72小时分别为0.00025、0.00081、0.0151、0.0192、0.097、0.11,作用于SO-R5048小时IC50值分别为0.00065、0.00149、0.0282、0.043、0.37、0.215,72小时分别为0.00042、0.00082、0.0146、0.0176、0.035、0.084．结论 SO-Rb50和SO-RS70瘤细胞对于上述6种化疗药物均敏感,根据其IC50值．药物敏感性顺序依次为更生霉素、长春新碱、鬼臼噻吩甙、柔红霉素、顺氯氨铂、平阳霉素。     

抑制Akt通路提高视网膜母细胞瘤对卡铂敏感性的实验研究

目的 探讨抑制Akt信号通路活性能否提高视网膜母细胞瘤（RB）SO-Rb50细胞对卡铂的敏感性。设计 实验研究。研究对象 SO-Rb50细胞株。方法 CCK-8法检测卡铂作用于细胞的IC50值;蛋白印迹法检测Akt、p-Akt、caspase 3、bax、p21蛋白在药物作用前后表达量的改变;流式细胞仪法检测药物作用前后细胞周期的改变。主要指标 IC50值,蛋白表达量,细胞周期中各期细胞百分比。 结果 卡铂作用于SO-Rb50细胞48小时的IC50值为（30.1±5.9）mg/L;分别用5 μM和10 μM的LY294002抑制细胞Akt信号通路的活性后,卡铂作用于SO-Rb50细胞的IC50值分别为（16.3±0.83）mg/L和（8.64±0.11）mg/L。用卡铂（30 mg/L）、LY294002（5 μM和10 μM）单独或联合作用于SO-Rb50细胞48 h后,细胞Akt活性随LY294002浓度的增加而降低,caspase-3蛋白生成增加,bax蛋白生成增加,p21蛋白在卡铂作用下生成显著增加;LY294002对细胞周期的进程无明显影响,卡铂使G0/G1期细胞百分比从（57.89±2.16）%下降至（12.11±2.87）%,G2/M期细胞从（0.34±0.34）%增加至（43.62±11.01）%,S期细胞无明显变化;两种药物联合作用并未改变卡铂对细胞周期的影响。结论 抑制Akt信号通路可提高SO-Rb50细胞对卡铂的敏感性,抑制Akt信号通路可能是提高RB化疗疗效的一个靶点。     

小干扰RNA技术下调视网膜母细胞瘤细胞株SO-Rb50中Survivin基因表达的研究

目的 应用RNA干扰(RNAi)技术沉默视网膜母细胞瘤细胞株SO-Rb50中凋亡抑制因子Survivin的表达,观察其干扰效果及对细胞的影响.方法 实验研究.体外化学法合成针对人Survivin基因的特异性小干扰RNA(siRNA)和对Survivin基因无沉默效果的阴性对照siRNA,利用转染试剂分别将siRNA转入SO-Rb50细胞株,通过半定量RT-PCR和Western blot检测其对SO-Rb50细胞中Survivin基因和蛋白表达的抑制作用,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度siRNA对细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测转染后细胞凋亡率和细胞周期改变,荧光显微镜下观察细胞凋亡形态.对多组间数据比较采用单因素方差分析,处理组与对照组比较采用Dunnett-t检验.结果 Survivin特异性siRNA转染细胞24 h后Survivin mRNA和蛋白表达水平明显下调,对照组中其表达则无明显改变.MTT法结果显示Survivin特异性siRNA浓度为35、70、100 nmol/L时均对SO-Rb50细胞增殖具有抑制作用(P＜0.05),且具有剂茸依赖性.流式细胞仪检测发现Survivin特异性siRNA组出现凋亡亚二倍体峰,细胞被阻滞于G0/G1期,较对照组增加了8.11%,G2/M期细胞比例减少了5.75%,S期细胞仅减少了2.26%.荧光显微镜下可见部分细胞出现染色质浓缩和凋亡小体等典型的凋亡形态学变化.结论 针对Survivin的RNA干扰技术可有效地下调SO-Rb50细胞中Survivin基因表达,进而抑制SO-Rb50细胞增殖和诱导其凋亡,为视网膜母细胞瘤的基因治疗提供了重要的途径.     

改良Wies法治疗退行性下睑内翻的一年疗效

目的 探讨改良Wies法治疗退行性下睑内翻的疗效。设计 回顾性病例系列。研究对象 北京同仁医院眼科中心27例（31眼）退行性下睑内翻患者。方法 27例（31眼）均采用改良Wies法（横行切透下睑,将下睑缩肌前徙固定于皮肤及睑板）。观察术前术后患者眼睑形态、睑缘位置等,随访（14.6±3.5）个月（12~17个月）。主要指标 眼睑形态、睑缘位置、有无溢泪。结果 术前1例复发患者,在术后14个月,双眼再次内翻复发。其余26例患者,在随访期间均未见过矫或复发,睑缘位置形态好,无不适主诉。结论 改良Wies法简单快速易重复效果好,对于治疗退行性下睑内翻建议优先考虑。