基于PNO基因序列分析隐孢子虫种系发育关系

本文以核基因组的功能蛋白丙酮酸∶NADP^＋氧化还原酶（pyruvate∶NADP^＋ oxidoreductase,PNO）编码基因作为研究对象,对本实验室分离保存的隐孢子虫虫株进行扩增测序,用ClustalX 1.81对扩增序列与GenBank相关参考序列进行比对,用Paup4.0程序中邻接法（Neighbor-joining method,NJ）、最大简约法（Parsimony,MP）和最大似然法（Maximum Likelihood,ML）进行聚类分析,以确定不同隐孢子虫分离株之间的遗传进化关系,并以18S rRNA和HSP70基因构僵的基因树作参照,进而评价PNO这一基因座是否适合作为隐孢子虫基因分型和进化关系分析的基因座。结果表明通过PNO构建的进化树将隐孢子虫分为2大类：Cryptosporidium bailey和C.meleagridis处于一个分枝,C.hominis、C.parvum牛基因型和C.parvum鼠基因型处于另一个分枝上。不同隐孢子虫之间的同源性介于95.0%-100%,能有效区分隐孢子虫不同基因型。因此,PNO基因序列也适合作为隐孢子虫分离株种系发育的遗传标记。     

兔源肺孢子虫种系发育的研究进展

肺孢子虫属（Pneumocystis）含多种具宿主种特异性的肺孢子虫，它们可以诱导严重免疫功能低下宿主产生肺孢子虫肺炎。断乳兔可自发发生肺孢子虫肺炎，引起典型的肺部病理组织学改变。本文就兔源肺孢子虫光镜与电镜结构、基因和种系发育学特点进行综述，并与其他种肺孢子虫进行比较，从生物学与种系发育学上证据表明兔源肺孢子虫应是一新种肺孢子虫，同时也证实了肺孢子虫具有遗传多样性。     

五株隐孢子虫18S rRNA部分基因克隆和序列分析

设计Nested PCR引物扩增牛源微小隐孢子虫Cryptospordium parvum、羊源微小隐孢子虫C. parvum、牛源安氏隐孢子虫C. andersoni、鸡源贝氏隐孢子虫C. baileyi及猪源隐孢子虫C. suis 18S rRNA基因突变区,PCR产物经克隆测序,其片段大小分别为212、213、213、213和210 bp.将测得的序列用DNAStar软件分析并与NCBI数据库中相同与相近种株序列进行相似性比较, 进行相似性分析并用TREECON软件绘制系统发育进化树.结果表明测得的5株隐孢子虫与各自相同种相似性为98.1%～100%,与其他种相似性为90.1%～98.6%.分析显示在此突变区设置特异酶切位点能区分开C. parvum, C. andersoni, C. baileyi与C. suis,位点分别是TaqI、BstUI、MseI.本研究为我国隐孢子虫分类、分子流行病学研究提供了新的方法.     

犬隐孢子虫和隐孢子虫病的研究进展

隐孢子虫病（Cryptosporidiosis）是由隐孢子虫（Cryptosporidium）起的一种重要的人畜共患病。近年来，隐孢子虫病的检出率逐年增高，已被列为世界最常见的6种腹泻病之一。犬隐孢子虫病世界各地均有报道，严重威胁着人类和动物的健康。本文对犬隐孢子虫病的病原分类、虫体形态和寄生部位、流行病学特点、诊断、防治等方面研究状况进行了综述，为犬隐孢子虫病的有效防制提供参考。     

隐孢子虫和隐孢子虫病研究进展

190 7年著名寄生虫学家Ｔｙｚｚｅｒ在作小鼠粘膜组织切片时发现大量虫体 ,并定名为小鼠隐孢子虫 (Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｍｕｒｉｓ) ,1 91 2年Ｔｙｚｚｅｒ在小鼠小肠中查到相似虫体 ,但认为是另一种虫种 (Ｃ .ｐａｒｖｕｍ) ,因为该虫种比Ｃ .ｍｕｒｉｓ小而且内生发育阶段局限于小肠上皮。1 95 5年Ｓｌａｖｉｎ报道Ｃ .ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ感染火鸡小肠出现急性临床症状 ,其特征是严重腹泻 ,但死亡率低 ,首次证明隐孢子虫的强致病性。在腹泻犊牛小肠中检测到隐孢子虫后更进一步引起兽医的兴趣 (Ｐａｎｃｉｅｒａｅｔａｌ.,1…     

微小隐孢子虫18S rRNA部分基因克隆和序列分析

分别从长春小白鼠、徐州人和南京黄牛的粪便中分离纯化了3株微小隐孢子虫(C.parvum)卵囊,根据C.parvum 18S rRNA基因序列设计合成引物,用PCR扩增卵囊基因组DNA,其大小为586bp的片段,PCR产物用试剂盒回收纯化后直接测序.将测得的序列用DNASTAR软件分析并与国外已发表的相应序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树.结果表明,徐州人源株与长春鼠源株及徐州人源株与南京黄牛源株同源性均为97.6%;长春鼠源株与南京黄牛源株相应序列同源性为99.6%.此3株C.parvum与国外株相应序列同源性为81.4%～100.0%.限制性内切酶酶切位点分析仅发现徐州株有1个特殊的Dde Ⅰ位点.本研究为人源及动物源微小隐孢子虫病诊断及人隐孢子虫感染来源和该病分子流行病学研究提供重要依据.     

人源肺孢子虫纯培养株的建立及基因鉴定

目的建立人源肺孢子虫（PneUmOCySaSj／rovec／，Pj）纯培养株。方法从肺孢子虫肺炎（PCP）患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）中分离巧，用改良IMDM培养基做原代、传代和冻存复苏培养；以四胺银染色计数法观察虫体增殖情况；以线粒体rRNA大亚基特异引物扩增培养物中的目的基因，与基因库中的鼠源和人源肺孢子虫基因做序列比较。结果用添加S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等辅助剂的IMDM培养基从2例PCP患者的BALF中分离出2个巧纯培养株。分离培养的巧可进行冷冻保存和复苏培养。培养120h的巧包囊可增殖3．2倍。基因序列分析证实分离出的巧株与鼠源性肺孢子虫的线粒体rRNA大亚基同源性为67．8％，与GenBank中巧的同源性为93．2％。结论用本法建立了2个Pj纯培养株。     

贝氏隐孢子虫在珍珠鸡体内发育的透射电镜观察

采用透射电镜观察了贝氏隐孢子虫在珍珠鸡气管和法氏囊的发育。贝氏隐孢子虫各期虫体均在上皮细胞微绒毛所形成的带虫空泡内发育，虫体基部有一营养器。滋养体呈圆形，有一个细胞核。胞质中有发达的粗面内质网。裂殖体经２或３次核分裂，以出芽方式形成４或８个裂殖子。成熟的裂殖子呈香蕉形，大小为２．８５×０．７０μｍ，被双层膜。小配子体由滋养体发育而来，内含多个缺少核仁的细胞核，细胞核移向胞质浅层，并进入胞质突起成为小配子的细胞核。大配子内可观察到二种成囊体和大量多糖颗粒，并在其胞质的空泡内发现小配子类似物。孢子生殖也在带虫空泡内进行，最终形成一个大残体和４个子孢子。子孢子有一个细胞核，富含微线和多糖颗粒。     

隐孢子虫体外培养研究进展

隐孢子虫是一种重要的人兽共患寄生性原虫,可引起儿童和免疫低下人群以及幼龄动物发生严重胃肠道疾病.长期以来围绕建立隐孢子虫体外培养模型国外学者做了大量探索,国内则在该领域尝试不多.为了研究隐孢子虫详细的内生发育过程,快速筛选抗隐孢子虫的有效药物、研究功能基因表达和外源基因的有效表达等,需要建立有效的体外培养模型.本文就20多年来国内外隐孢子虫培养概况进行了综述.     

猪隐孢子虫内生发育虫体超微结构观察

用扫描电镜和透射电镜技术观察了猪隐孢子虫(Cryptosporidium suis)sucp分离株在5日龄仔猪体内内生发育虫体形态结构和寄生特点。结果发现,感染前期和高峰期,在盲肠、结肠和直肠有虫体寄生,而感染后期仅在直肠上发现虫体,并且多集中在肠腺区域。实验观察到滋养体、裂殖体、大配子体、合子和孢子化卵囊等不同阶段的虫体。虫体周围一定区域的微绒毛融合、萎缩或倒伏,肠粘膜上的微绒毛明显脱落。中期滋养体营养器和致密带之间有一层较宽的特殊结构,并且该结构到后期滋养体和裂殖体阶段消失,这层特殊结构尚未见文献报道。在带虫空泡内膜与虫体外膜形成的致密带上方存在典型的呈竖向或斜向排列的纤维塞状结构(microfilament plug)营养器。     

人重组巨噬细胞移动抑制因子在大肠杆菌的高效表达与鉴定

利用ＰＣＲ技术，从人Ｔ细胞ｃＤＮＡ文库中扩增巨噬细胞移动抑制因子的ｃＤＮＡ经与大肠杆菌表达载体重组，构建成不同表达克隆，在大肠杆菌高效表达成功ＭＩＦ融合蛋白，占细菌总蛋白的３２％－６０％，经纯化的ＭＩＦ产物纯度可达９８％，其氨基酸组成分析与理论值一致。     

ENPP1基因在人卵巢的定位表达及其与多囊卵巢综合征的关系

目的胰岛素抵抗及其伴随的高胰岛素血症是多囊卵巢综合征(PCOS)重要的病理生理改变,核苷酸内焦磷酸酶/磷酸二酯酶1(ENPP1)表达异常与胰岛素抵抗有关,本研究拟了解ENPP1基因在卵巢颗粒细胞中的表达及其与PCOS的关系,为进一步研究ENPP1在卵巢中的生理功能及PCOS的发病机制打下基础。方法收集PCOS患者(PCOS组)12例,以及排卵功能正常的单纯输卵管因素不育及男性不育的正常体重妇女(非PCOS组)22例患者的卵巢颗粒细胞。利用mRNA RT-PCR、原位杂交和实时荧光定量PCR的方法检测ENPP1在育龄期妇女及PCOS妇女颗粒细胞中的表达。结果RT-PCR的方法及原位杂交结果均显示,ENPP1在颗粒细胞胞浆中表达。ENPP1在PCOS组的2-ΔCt值为1.67±0.89,高于非PCOS组的2-ΔCt值0.94±0.76,两组间差异有统计学意义(P=0.017)。结论ENPP1在卵巢颗粒细胞中的表达差异提示,ENPP1参与了颗粒细胞的生理功能及卵巢中PCOS发病的病理机制。     

用PCR－RFLP方法研究江浙沪籍汉族人HLA－DQA1基因多态性

用ＰＣＲ技术扩增了９８例江浙沪籍汉族人ＨＬＡⅡ类ＤＱＡ１基因的第二个外显子，扩增产物经ＡｐａＬＩ，ＢｓａＪＩ，ＦｏｋＩ，ＨｐｈＩ，ＭｂｏⅡ和ＭｎｌＩ酶切分型，测定了江浙沪籍汉族人群８个ＤＱＡ１等位基因的分布频率，ＤＱＡ１＊０３０１为最常见等位基因。     

高活性人重组双体GM—CSF在大肠杆菌的表达和鉴定

利用基因融合与基因工程技术,将两个粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)基因经白细胞介素—3(IL—3)的N端亲水序列串联起来,插入表达质粒载体,在大肠杆菌中高效表达出含凝血酶识别序列的MS2—双体GM—CSF融合蛋白。表达蛋白经凝血酶消化后,可去除MS2细菌蛋白,获高活性的双体GM—CSF分子(G2)。利用GM—CSF依赖性细胞株TF—1检测活性表明,G2的比活性高于单体GM—CSF的10倍以上,为研制新一代GM—CSF提供了新的途径。     

野外采集标本中人埃立克体16S rRNA基因扩增方法及应用

本文应用特异引物,通过多对半巢式PCR从采自内蒙古大兴安岭的蜱标本中扩增出人粒细胞埃立克体和查菲埃立克体的16SrRNA全基因,一方面提供了这2种埃立克体存在于中国的证据,另一方面为今后进行埃立克体病的病原、媒介和宿主的调查研究提供了一个可行的方法.并从一只大林姬鼠的脏器中检测到EC16SrRNA基因片段.     

抗人DAF单克隆抗体的制备及鉴定

以初步纯化的人红细胞膜ＤＡＦ免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,取免疫小鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合,成功地获得３株（ＤＧ３、ＤＧ９和ＤＡ１１）抗人ＤＡＦ单克隆抗体。经间接ＥＬＩＳＡ测定,３株杂交瘤细胞培养上清及腹水的抗体效价分别为１０－３～１０－４及１０－６～１０－７;３株单抗的重链为小鼠ＩｇＧ１亚类,轻链为κ型。结合还原条件下的免疫印迹实验及３株单抗对ＤＡＦ促衰变活性的抑制作用,推测ＤＧ９识别的抗原表位为ＳＣＲ１,而ＤＧ３和ＤＡ１１为ＳＣＲ２至ＳＣＲ４。     

人胃癌淋巴管密度和面积及其与淋巴结转移的关系

目的研究人胃癌淋巴管的密度和面积及其与淋巴结转移的关系。方法采用D2-40淋巴管内皮标记性抗体免疫组织化学染色方法,检测70例人胃癌中心区、癌旁区、正常区内的淋巴管,分析淋巴管的形态学特征与淋巴结转移及其他临床病理因素之间的关系。结果人胃癌癌旁区淋巴管密度高于正常区,平均面积、平均周径及总面积小于正常区,差异均有统计学意义。淋巴结转移组人胃癌癌旁区淋巴管密度及平均面积、平均周径均高于无淋巴结转移组。结论人胃癌淋巴管新生存在于胃癌癌旁区,新生淋巴管管腔小,不足以形成良好的淋巴回流;人胃癌癌旁区淋巴管密度、平均面积与淋巴结转移有关,有望成为预测淋巴结转移及决定手术方式的重要因素。     

中国登革2型病毒分离株乳鼠致病性差异与基因变化关系的研究

本文报道１９８７年从广西病人血清中分离的登革２型（Ｄ２）病毒Ｄ２－４３株和１９８５年从海南病人血清中分离的Ｄ２－０４株乳鼠致病性的差异与基因变化的关系。结果表明Ｄ２－４３株对乳鼠致病，Ｄ２－０４株不致病。Ｄ２－４３株和Ｄ２－０４株Ｃ到ＮＳ１基因的读码框架基本相同，均由３３８１核苷酸组成，编码氨基酸总数１１２７。包含三个结构蛋白Ｃ．ＰｒＭ（Ｍ）、Ｅ和一个非结构蛋白ＮＳ１。该两株病毒核苷酸序列同源性为９３．８％，氨基酸序列的类似性为９１．３％。Ｃ和Ｅ基因同源性为９５．０％～９５．８％，ＮＳ１基因为９２．２％，Ｍ基因为８６．７％，两株之间核苷酸序列的主要差异是在Ｍ基因。两株病毒的Ｃ－ＮＳ１基因与国际参考毒株比较，４３株与ＪＡＭ株类侧性最高，其次是ＮＧＣ株，与Ｓ１株类似性最小。而０４株只有Ｃ、Ｅ和ＮＳ１与ＪＡＭ株最高，ＰｒＭ（Ｍ）都与ＮＧＣ株最高。４３株与０４株的Ｍ基因相比较，０４株的ＰｒＭ（Ｍ）基因的同源性低于４３株，说明两株与国际参考毒株比较，主要差异也在Ｍ基因，乳鼠致病性差异可能与Ｍ基因变化有关。     

人循环纤维细胞的分离和鉴定

目的 建立分离、培养人循环纤维细胞的方法,并探讨其细胞生物学特征.方法 取成人外周血白细胞,经淋巴细胞分离液分离,接种于含20%胎牛血清的DMEM培养液中进行培养.对贴壁生长的成纤维样细胞进行免疫组织化学鉴定,流式细胞仪分析和电镜观察,并通过测定培养液中羟脯氨酸含量,研究其胶原合成能力.结果 细胞培养9d后CD34、CD45、Ⅰ型胶原分子阳性,其中Ⅰ型胶原分子阳性细胞含量为83.5%;电镜下观察具有典型的成纤维细胞特征;培养液中羟脯氨酸含量为11.17mg/L,明显高于空白对照组8.07mg/L (P＜0.01),表明培养细胞具有胶原合成能力.结论 成人外周血中存在成纤维细胞的前体细胞,经体外分离、培养可分化为循环纤维细胞.