基于视网膜Müller细胞的地黄调节AGEs干预下HIF-1α表达的谱效关系研究

目的建立不同来源地黄的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱并研究其与糖基化终末产物(AGEs)干预下视网膜Müller细胞中低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达之间的谱效关系,初步阐明地黄防治糖尿病性视网膜病变(DR)的药效物质。方法采用HPLC法建立10批不同来源地黄指纹图谱;采用ELISA法测定地黄对AGEs干预下视网膜Müller细胞中HIF-1α表达的影响;采用偏最小二乘法分析特征峰峰面积与药效值之间的谱效关系。结果 10批样品HPLC指纹图谱共标定了17个特征共有峰,其中4、14、15号峰分别为梓醇、肉苁蓉苷A、毛蕊花糖苷。ELISA结果显示10批样品对AGEs干预下视网膜Müller细胞中HIF-1α的表达均有不同程度的抑制作用。偏最小二乘法分析结果显示,肉苁蓉苷A、毛蕊花糖苷及4个尚未确定结构的成分(峰13、5、16、17)可能是地黄防治DR的药效物质。结论谱效关系为初步阐明地黄防治DR药效物质提供了一个有效途径。     

人参皂苷对糖基化终末产物条件下视网膜Müller细胞活力的影响

目的：探讨人参皂苷对糖基化终末产物（advanced glycation end products,AGEs）条件下视网膜Müller细胞活力的影响。方法：以改良酶消化法培养SD大鼠视网膜Müller细胞,将纯化培养的视网膜Müller细胞分别置于低剂量AGEs（终质量浓度为75 mg·L^-1）及高剂量AGEs（终质量浓度为150 mg·L^-1）下进行培养,并分别以人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁及人参皂苷提取物干预。在干预24,48,72 h后以酶联免疫吸附法测定各组细胞外液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）的漏出量,以推测Müller细胞活力。结果：低AGEs组24,48 h的LDH漏出量较正常对照组均无明显差异,但72 h的LDH漏出量较正常对照组增多（P<0.05）;高AGEs组各时段LDH漏出量均较正常对照组以及低AGEs组增多（P<0.05）;人参皂苷Rg₁,Re,Rb₁及人参皂苷提取物均能减少低AGEs组48,72 h的LDH漏出量（P<0.05）,减少高AGEs组各时段的LDH漏出量（P<0.05）。结论：AGEs能明显增加视网膜Müller细胞膜的通透性,降低细胞活力,并且与干预的时间、浓度有关;人参皂苷Rg₁,Re,Rb₁及人参皂苷提取物能降低本实验中AGEs条件下Müller细胞膜的通透性、提高Müller细胞膜稳定性,增强细胞活力,尤其以人参皂苷提取物效果显著。     

人参皂苷提取物对大鼠视网膜Müller细胞的影响

目的研究人参皂苷对体外纯化培养大鼠视网膜Müller细胞的影响,为人参治疗糖尿病性视网膜病变(DR)的物质基础研究筛选合适的浓度。方法用不同浓度的人参皂苷提取物及人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1对照品分别干预体外纯化培养的大鼠视网膜Müller细胞48 h,MTT法检测细胞增殖抑制率。结果测得人参皂苷提取物及人参皂苷Re、Rg1、Rb1对照品的IC50分别为0.618,0.489,0.653,0.553 mg/ml,给药浓度为1 mg/ml时,测得最高细胞增殖抑制率分别为56.8%,71.0%,59.4%,68.0%。结论人参皂苷提取物及人参皂苷Re、Rg1、Rb1对照品对大鼠视网膜Müller细胞均有一定抑制作用,且具有剂量依赖性,所测IC50值为进一步研究人参皂苷提取物治疗DR作用机制的有效浓度提供依据。     

活血通络利水方含药血清在高浓度谷氨酸环境下 对Müller细胞谷氨酸-天冬氨酸转运体、谷氨酰胺合成酶蛋白表达及活性的影响

目的 研究活血通络利水方含药血清在高浓度谷氨酸(GLU)环境下对Müller细胞谷氨酸-天冬氨酸转运体(GLAST)、谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白表达及活性的影响。方法 将40只健康SD大鼠按照随机数字表法分为正常组、银杏叶组、活血通络利水方低剂量组和活血通络利水方高剂量组,每组10只。银杏叶组予银杏叶片水溶剂5. 2 mg/kg灌胃,活血通络利水方低剂量组予活血通络利水方合剂20 g/kg灌胃,活血通络利水方高剂量组予活血通络利水方合剂40 g/kg灌胃,正常组予等容积0. 9%氯化钠注射液灌胃,每日1次,连续灌胃7 d后,腹主动脉取血后离心收集血清备用。培养Müller细胞,分别用不同浓度的GLU(0、0. 1、0. 5、1、10、20、25、30 mmol/L)干预24 h,采用噻唑蓝(MTT)法检测Müller细胞存活率。Müller细胞分为正常组、模型组、银杏叶组、活血通络利水方低剂量组和活血通络利水方高剂量组,正常组和模型组每孔加入正常血清0. 5 m L、培养基2 m L,银杏叶组每孔加入银杏叶含药血清0. 5 m L、培养基2 m L,活血通络利水方低、高剂量组每孔分别加入活血通络利水方20、40 g/kg含药血清0. 5 m L、培养基2 m L。除正常组外,其余4组均加入GLU 25 mmol/L。相同条件下培养24 h后提取总蛋白,采用免疫印迹法(Western Blot)检测各组Müller细胞中GLAST、GS蛋白表达水平;用高效液相色谱法(HPLC)检测各组细胞培养液中GLU含量。结果 MTT实验结果显示,GLU干预24 h后,与0 mmol/L浓度GLU比较,10 mmol/L及以下低浓度GLU细胞存活率升高(P 0. 05); 20、25、30 mmol/L浓度GLU细胞存活率逐渐降低(P 0. 05),其中25 mmol/L浓度GLU细胞存活率下降至约0. 67。Western Blot检测结果显示,与正常组比较,模型组GLAST、GS蛋白表达水平均降低(P 0. 05);与模型组比较,银杏叶组和活血通络利水方低、高剂量组GLAST、GS蛋白表达水平均升高(P 0. 05),且活血通络利水方高剂量组的上调高于银杏叶组(P 0. 05),与正常组比较差异无统计学意义(P0. 05)。高效液相色谱(HPLC)检测结果显示,与模型组比较,银杏叶组和活血通络利水方低、高剂量组的胞外GLU含量均降低(P 0. 05);与银杏叶组比较,活血通络利水方低、高剂量组Müller细胞胞外GLU含量比较差异无统计学意义(P0. 05)。结论 在25 mmol/L GLU浓度环境下,活血通络利水方能够上调Müller细胞GLAST、GS蛋白表达和活性,促进细胞摄取胞外GLU,以维持GLU代谢平衡。     

补肾活血中药对TGF-β_2及高糖状态下体外培养的视网膜Müller细胞活力的影响

目的探讨高糖及转化生长因子-β2（Transforming growth factor,TGF-β2）和高糖同时存在条件对体外培养的Müller细胞活力的影响,以及补肾活血中药的干预作用。方法以改良酶消化法体外培养大鼠Müller细胞,将P3细胞分别置于模拟正常、高糖、TGF-β2及TGF-β2和高糖同时存在条件下进行培养,并以补肾活血中药复方含药血清进行干预。实验分为正常对照组、TGF-β2组、高糖组、TGF-β2＋高糖组、正常中药干预组、TGF-β2＋高糖中药干预组;分别在试验干预12h、24h及48h后,以490型酶标仪测定各组细胞外液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）的漏出量。结果 TGF-β2组和高糖组12h和24h的LDH漏出量与正常对照组比较均无明显差异（P〉0.05）,但48h的LDH漏出量均较正常对照组增多（P〈0.05）;TGF-β2组24h的LDH漏出量较高糖组增多（P〈0.05）;TGF-β2＋高糖组24h和48h的LDH漏出量均较TGF-β2组减少（P〈0.05）;TGF-β2＋高糖组48h的LDH漏出量较高糖组减少（P〈0.05）;补肾活血中药血清能降低24h时TGF-β2和高糖同时存在条件下LDH的漏出量,降低各时段正常条件下的LDH漏出量（P〈0.05）。结论 Müller细胞对短期高糖状态以及浓度为150pg/ml的TGF-β2短期干预可能有一定的耐受性,但当高糖（50mol/l）以及TGF-β2（150pg/ml）干预48h后Müller细胞活力明显降低;补肾活血中药复方含药血清能提高正常及高糖和TGF-β2同时存在条件下视网膜Müller细胞膜的稳定性、增强Müller细胞活力可能是补肾活血中药复方防治糖尿病性视网膜病变的另一药物干预途径。     

丹参提取物对糖基化终末产物/缺氧条件下视网膜Müller细胞低氧诱导因子-1α作用的谱效关系研究

目的探讨丹参提取物对糖基化终末产物(AGEs)/缺氧条件下视网膜Müller细胞低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达的药理作用与化学成分之间的关系,并以丹参酮IIA为对照,初步探索丹参治疗糖尿病性视网膜病变(DR)的药效物质基础。方法采用HPLC法建立10批丹参提取物的指纹图谱,获得各特征峰的峰面积。在AGEs/缺氧条件下培养视网膜Müller细胞,并测定丹参提取物给药组及丹参酮IIA对照组HIF-1α的表达量。结合灰色关联分析法与偏最小二乘法回归分析成分与药效之间的谱效相关性。结果根据10批样品指纹图谱共标示出17个特征峰。与模型组相比,10批样品及丹参酮IIA对照组均能降低视网膜Müller细胞HIF-1α的表达量。谱效相关性研究显示峰1、5、6、9、10、11、12、14、15、16代表的化学成分对抑制HIF-1α表达具有较大的贡献。结论初步确定15,16-二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA及6个尚未确定结构的成分(峰1、5、6、9、14、15)为丹参治疗DR的可能药效物质。     

Müller细胞在高糖状态下的变化

糖尿病性视网膜病变(diabetic retionopathy,DR)是糖尿病严重的并发症之一,也是常见的致盲性眼病。近年来随着DR的研究进展,视网膜神经细胞的损伤也倍受关注。本文就视网膜高糖状态下Müller细胞的变化等内容进行综述。     

丹参对视网膜色素变性病理过程Müller细胞特征性基因变化及关键蛋白表达的影响

目的基于网络药理学和生物信息学方法探讨丹参(SM)通过干预Müller细胞(MC)特征性基因和关键蛋白表达治疗视网膜色素变性(RP)的分子机制。方法运用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)检索、筛选SM的入血活性成分和作用靶点;通过GEO数据库获取正常和RP小鼠MC差异表达基因;通过疾病数据库检索RP相关的基因靶点;采用Cytoscape构建MC差异表达基因和疾病靶点、成分靶点的蛋白质-蛋白质交互作用网络并提取交集;运用DAVID数据库对特征性基因进行基因本体和KEGG通路分析;采用cytoHubba分析筛选关键蛋白靶点。结果检索得到与SM相关的化学成分202个,依据ADME参数筛得活性成分65个,其中入血活性成分13个,进一步检索配对得到这些成分可能作用的靶点117个;从芯片数据中分析得到正常和RP小鼠MC中差异表达基因242个;从疾病数据库获得与RP密切相关的靶点206个;提取交集得到85个SM影响RP病理过程MC的特征性基因;这些基因主要涉及转录调控、凋亡信号通路调控、DNA核内复制调节等生物学过程,分子功能主要包括转录辅激活子活性、蛋白激酶活性、核心启动子结合等,富集于细胞核、核质、转录因子复合物、Rb-E2F复合体等区域,主要与剪接体信号通路、肌动蛋白细胞骨架调控信号途径、细胞周期调控通路等有关;分析筛选出SM干预RP病理过程MC中的8个关键蛋白靶点。结论 SM药效作用的物质基础为隐丹参酮、木犀草素、丹参酮ⅡA等13个化学成分;其所干预的RP病理过程MC特征性基因与剪接体信号通路、肌动蛋白细胞骨架调控信号途径、细胞周期调控通路等机制相关,关键靶点包括RB1、E2F1、TFDP1等8个蛋白。     

红景天对低氧条件下内皮细胞HIF-1α、HIF-1β和VEGF表达的影响

目的:观察红景天对低氧条件下人脐静脉内皮细胞表达低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、低氧诱导因子-1β(HIF-1β)和血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法:采用XTT比色法检测红景天不同干预时间、浓度对细胞增殖的影响,以确定最佳干预条件;采用SYBRGreenI荧光染料实时定量PCR法检测mRNA表达水平;WesternBlot法检测蛋白表达水平。细胞分3组:正常氧对照组,低氧对照组,红景天干预组。结果:红景天干预的最佳条件为24h、10μg/mL。与正常氧相比,低氧条件下内皮细胞HIF-1α、HIF-1β和VEGF蛋白表达均升高(P<0.01);红景天促进了低氧条件下内皮细胞HIF-1α和VEGF的基因和蛋白表达(P<0.01),而对HIF-1β的基因和蛋白表达没有影响。结论:红景天促进低氧条件下内皮细胞HIF-1α及VEGF的表达可能是红景天抗缺氧和促血管新生作用的机制之一。     

补肾活血法对Müller细胞谷氨酸摄取功能的影响

目的 探讨补肾活血中药含药血清对高糖条件下Müller细胞谷氨酸(Glutamate,Glu)摄取功能的影响.方法 以改良酶消化法体外培养大鼠Müller细胞;根据[3H]标记的D,L- Glu摄入量判断Müller细胞的Glu摄取功能.结果 在高糖条件下Müller细胞的Glu摄取功能一过性提高,随时间推移其对Glu的摄取功能又明显下降;中药含药血清对正常条件下Müller细胞Glu摄取功能的提高在用药后24小时时段最为明显,对高糖条件下Müller细胞Glu摄取功能的提高在用药后48小时时段最为明显.结论 高糖条件所引起的Müller细胞糖酵解在短时间内旺盛可能是Müller细胞Glu摄取功能一过性提高的原因之一;Müller细胞对短期高糖条件可能有一定耐受性,持续的高糖最终会导致Müller细胞的损伤;中药含药血清可减轻高糖条件下Müller细胞Glu摄取功能的下降,这可能是补肾活血法防治糖尿病视网膜病变的干预途径之一.     

桃红四物汤对糖尿病视网膜病变引起的细胞损伤及HIF-1α表达的影响

目的 探究桃红四物汤对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)的保护作用及潜在的分子机制。方法 (1)取hRMECs,设置5组：空白对照组加5 mmol/L葡萄糖培养,高糖模型组加30 mmol/L葡萄糖培养,桃红四物汤低、中、高剂量组分别加30 mmol/L葡萄糖和相应浓度桃红四物汤含药血清培养,通过Transwell和划痕实验检测细胞的侵袭和迁移能力,血管生成实验检测细胞的成管能力,ELISA试剂盒检测细胞中血管内皮生长因子(VEGF)水平,Western blot法检测细胞中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白表达情况。(2)另外设置4组：空白对照组加5 mmol/L葡萄糖培养,高糖模型组加30 mmol/L葡萄糖培养,桃红四物汤组加30 mmol/L葡萄糖和高剂量桃红四物汤含药血清培养,桃红四物汤+HIF-1α过表达组采用HIF-1α过表达的hRMECs细胞加30 mmol/L葡萄糖和高剂量桃红四物汤含药血清培养,考察HIF-1α过表达对桃红四物汤的功能回复作用。结果 (1)与空白对照组比较,高糖模型组细胞侵袭和迁移能力均明显增强(P均<0.05),成管数量明显...     

艳山姜挥发油对高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞VEGF表达的调控作用

目的:研究艳山姜挥发油对高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞(RMCs)增殖的抑制作用,并探讨其可能的作用机制。方法:将培养的RMCs分为正常对照组、甘露醇对照组、模型组、罗格列酮阳性对照组及艳山姜挥发油高(1μg/L)、中(0.5μg/L)、低(0.25μg/L)浓度组。给药48 h后,MTT法检测艳山姜挥发油对高糖诱导RMCs增殖的影响,苏木素-伊红染色(HE)进行形态学观察,划痕修复实验及transwell实验分别分析RMCs迁移能力和侵袭能力。免疫印迹法(Western blot)分析血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。结果:高糖作用后,RMCs增殖率、迁移及侵袭能力显著升高(P<0.01);VEGF蛋白表达显著上调(P<0.01)。与模型组比较,给予艳山姜挥发油及罗格列酮预保护能显著抑制RMCs的异常增殖(P<0.05),RMCs形态和数量趋近正常对照组,RMCs迁移和侵袭能力显著降低,同时显著下调了VEGF蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)。结论:艳山姜挥发油对高糖诱导下RMCs的增殖及VEGF蛋白的表达具有调控作用。     

芪参益气滴丸对糖尿病大鼠视网膜谷氨酸转运体及谷氨酰胺合成酶表达的影响

目的探讨芪参益气滴丸对糖尿病大鼠视网膜谷氨酸转运体（glutamate-aspartatetransporters,GLAST）、谷氨酰胺合成酶（glutaminesynthetase,GS）表达的影响,及其对视网膜神经细胞保护作用的机制。方法链脲佐菌素诱导实验性糖尿病大鼠模型。治疗组每日予芪参益气滴丸灌胃给药1次。LSAB法检测GLAST、GS在视网膜的表达,ImagePlusPro6.0图象分析系统计算阳性表达的IOD值。结果与正常组相比,模型组视网膜GLAST（5.491±0.121）、GS（3.142±0.063）的表达明显降低（P〈0.05）;与模型组相比,治疗组GLAST（6.820±0.404）、GS（6.532±0.073）的表达增强（P〈0.05）。结论芪参益气滴丸能够促进视网膜GLAST及GS的表达,减轻高浓度谷氨酸的兴奋性毒性作用,对视网膜神经细胞起保护作用。     

芪参益气滴丸对糖尿病大鼠视网膜谷氨酸转运体及谷氨酰胺合成酶表达的影响

目的:探讨芪参益气滴丸对糖尿病大鼠视网膜谷氨酰胺合成酶及谷氨酸转运体的表达水平的影响。方法:选择维通利华实验动物研究所提供的六周龄SPF级SD大鼠80只,体重180~220 g,雄性,根据随机数字表法分为实验组(例数=70)、正常组(例数=10),进行链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ),一次性注射腹腔对胰岛β细胞进行选择性破坏,诱发实验性糖尿病;应用时由PH 4.4、0.1 mmol/L无菌的柠檬酸钠缓冲液配制为1%STZ溶液,根据大鼠体重予以65 mg/kg左下腹腔一次性注射1%STZ,正常组注射相同体积的生理盐水,72 h后应用快速血糖仪检测血糖水平;血糖水平超过16.7mmol/L者则为糖尿病大鼠模型;随机分为对照组(多贝斯对照组)(20只)、治疗组(芪参益气滴丸组)(30只)、糖尿病模型组(模型组)(20只)、正常组(例数=10),应用RT-PCR法检测4组大鼠视网膜GFAP mRNA表达水平;应用免疫组织化学染色法(Labelled Streptavidin Biotin Method,LSAB法)检测4组视网膜的谷氨酸转运体(Glutamate/aspartate Transporter,GLAST)表达水平;应用免疫组织化学染色法(LSAB法)检测视网膜上谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase,GS)的表达水平情况。结果:对照组、模型组、治疗组的大鼠视网膜GFAP阳性表达IOD值显著低于正常组,差异有统计学意义(P0.05);治疗组、对照组的大鼠视网膜神经胶质原纤维酸性蛋白(Glialfibrillaryacidprotein,GFAP)阳性表达IOD值显著高于模型组,差异有统计学意义(P0.05);治疗组的大鼠视网膜GFAP阳性表达IOD值显著高于对照组,差异有统计学意义(P0.05);对照组、模型组、治疗组的大鼠视网膜GS阳性表达IOD值显著低于正常组,差异有统计学意义(P0.05);治疗组、对照组的大鼠视网膜GS阳性表达IOD值显著高于模型组,差异有统计学意义(P0.05);治疗组的大鼠视网膜谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase,GS)阳性表达IOD值显著高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:芪参益气滴丸可促进视网膜GS和GLAST的表达,降低谷氨酸的高浓度兴奋性毒性功能,保护视网膜神经细胞。     

藏药小檗皮对糖尿病大鼠视网膜PKC-β、VEGF、HIF-1α表达的影响

目的：探讨藏药小檗皮对糖尿病大鼠视网膜蛋白激酶C（PKC-β）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）和低氧诱导因子（HIF-1α）的影响。方法：SD大鼠采用链脲佐菌素（STZ）一次性腹腔内注射的方法造模,随机分为模型组、小檗皮低剂量、中剂量和高剂量组、二甲双胍组、羟苯磺酸钙组、小檗碱组和对照组。成模后开始灌胃给药,小檗皮低剂量组、中剂量组、高剂量组分别按成人剂量的5、10、20倍给药,二甲双胍组和小檗碱组按成人剂量的10倍给药,模型组和对照组予灌服蒸馏水。所有实验大鼠于灌胃6周后处死。采用实时荧光定量PCR和Western Blot检测视网膜PKC-β、VEGF和HIF-1α表达,采用免疫组织化学法检测视网膜HIF-1α蛋白表达。结果：与正常组比较,糖尿病大鼠视网膜中PKC-β、VEGF、HIF-1αmRNA和蛋白表达显著升高（P〈0.01）;与模型组比较,小檗皮高、中剂量组视网膜PKC-β、VEGF和HIF-1α mRNA表达显著降低（P〈0.01）,PKC-β、VEGF和HIF-1α蛋白表达水平明显降低（P〈0.05）,小檗皮低剂量组大鼠PKC、VEGF和HIF-1α表达明显降低（P〈0.05）。结论：小檗皮对糖尿病大鼠视网膜具有保护作用,其作用机制可能与整体多点调控糖尿病大鼠视网膜的PKC-β、VEGF、HIF-1α表达有关。     

补肾活血方对AGEs/缺氧条件下视网膜Müller细胞PEDF及VEGF的影响

目的观察补肾活血方对AGEs/缺氧条件下视网膜Müller细胞血管内皮生长因子(VEGF)及色素上皮衍生因子(PEDF)的影响,并对其作用机制进行初步探讨。方法应用改进的酶消化法培养SD大鼠视网膜Müller细胞,将其分为正常对照组(NC组)、正常中药干预组(NCM组)、低AGEs组(LA组)、高AGEs组(HA组)、低AGEs中药干预组(LAM组)、高AGEs中药干预组(HAM组)、模拟缺氧组(SH组)、模拟缺氧中药干预组(SHM组),用酶联免疫吸附法(ELISA)对相关干预条件下体外培养视网膜Müller细胞上清液进行VEGF及PEDF含量的测定。结果 (1)VEGF表达量:(1)24、48、72 h时,SH组、LA组、HA组视网膜Müller细胞VEGF表达量均高于NC组,差异均有统计学意义(P0.05);HA组、SH组表达量均高于LA组,差异均有统计学意义(P0.05)。(2)24 h时,SH组表达量高于HA组;48 h时,SH组表达量低于HA组,差异均有统计学意义(P0.05)。(3)除72 h NCM组VEGF表达量与NC组相比,差异无统计学意义(P0.05)外,其余时段有中药干预组的表达量均较对应无中药干预组降低,差异均有统计学意义(P0.05)。(4)SH组、LA组、HA组、LAM组、HAM组、SHM组细胞48、72 h时VEGF表达量均较前一时段增高,差异均有统计学意义(P0.05)。(2)PEDF表达量:(1)SH组、LA组、HA组各个时段视网膜Müller细胞PEDF表达量较NC组降低,差异均有统计学意义(P0.05)。(2)24、72 h时,HA组、SH组PEDF表达量较LA组降低,差异均有统计学意义(P0.05)。(3)24h时,SH组PEDF表达量较HA组降低,差异有统计学意义(P0.05)。(4)24、72 h NCM组、LAM组,24、48、72 h HAM组,24 h SHM组视网膜Müller细胞PEDF表达量均较对应无中药干预组增高,差异有统计学意义(P0.05)。(5)LA组、HA组、SH组、LAM组、HAM组、SHM组48、72 h时细胞PEDF表达量均较前一时段降低,差异均有统计学意义(P0.05)。(3)VEGF/PEDF比值:(1)NC组、NCM组各时段其比值几乎相同,表明视网膜Müller细胞VEGF与PEDF的量处于相对平衡的状态。(2)LA组、HA组、SH组、各时间点其比值较NC组均有不同程度的升高。(3)LA组、HA组、SH组比值均随着时间的延长而升高;LAM组、HAM组、SHM组比值均随着时间的延长而升高,但较之LA组、HA组、SH组,其升高幅度降低。结论 (1)AGEs以及缺氧均可导致视网膜Müller细胞分泌VEGF增加、PEDF减少,并且这种改变在HA组比LA组更明显。(2)在AGEs以及缺氧条件下,补肾活血中药复方含药血清可降低视网膜Müller细胞VEGF的表达,提高PEDF蛋白的表达,这可能是补肾活血法防治糖尿病视网膜病变(DR)的药物干预途径之一。(3)正常状态下视网膜Müller细胞的VEGF与PEDF呈动态平衡;AGEs以及缺氧条件下不仅使视网膜Müller细胞VEGF与PEDF的动态平衡均被打破,并且AGEs对视网膜Müller细胞VEGF与PEDF动态平衡的损害程度与AGEs浓度有关。(4)补肾活血中药含药血清可减轻在AGEs以及缺氧条件下VEGF与PEDF的不平衡,这可能是其防治DR的一个重要作用机制。     

补肾活血方对AGEs条件下体外纯化培养大鼠视网膜Müller细胞HIF-1α介导缺氧信号通路的影响

目的观察在晚期糖基化终末产物(AGEs)条件下,补肾活血方含药血清对大鼠视网膜Müller细胞的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)缺氧信号通路的影响。方法采用SD大鼠制备补肾活血中药含药血清和空白血清,以终浓度50 mg/L的AGEs作为低AGEs条件,终浓度100 mg/L的AGEs作为高AGEs条件,将体外纯化培养的P2代视网膜Müller细胞分为6组,分别置于加入空白血清、中药含药血清、空白血清+低AGEs、空白血清+高AGEs、中药含药血清+低AGEs、中药含药血清+高AGEs的DMEM培养基中,培养48 h后酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞外液中HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)含量,逆转录-聚合酶链法(RT-PCR)测定各组Müller细胞HIF-1αm RNA、VEGFm RNA表达量,比较差异。结果 1.低AGEs组较正常对照组HIF-1α值有升高趋势,但差异无统计学意义(P0.05),HIF-1αm RNA值明显升高,其差异有统计学意义(P0.05),高AGEs组较正常对照组HIF-1α、HIF-1αm RNA值明显升高,其差异有统计学意义(P0.05);低、高AGEs组较正常对照组VEGF、VEGFm RNA值明显升高,其差异有统计学意义(P0.05)。2.正常中药干预组HIF-1α、VEGF、HIF-1αm RNA、VEGFm RNA值接近正常对照组,差异无统计学意义(P0.05)。3.低、高AGEs中药干预组HIF-1α、VEGF、HIF-1αm RNA、VEGFm RNA值均较对应的低、高AGEs组明显降低,其差异有统计学意义(P0.05)。结论补肾活血方含药血清可抑制视网膜Müller细胞在AGEs条件下HIF-1α介导缺氧信号通路的高表达,这可能是补肾活血方防治DR的机制之一。     

补肾活血中药复方对AGEs条件下体外纯化培养视网膜Müller细胞活力的影响

目的:探讨补肾活血中药对体外糖基化终末产物(AGEs)条件下视网膜Müller细胞活力的影响。方法:体外纯化培养7天SD大鼠视网膜Müller细胞至P2代;中药血清药理学方法制备补肾活血中药含药血清;体外纯化培养的P2代视网膜Müller细胞置于AGEs状态下,以补肾活血中药含药血清干预,检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出量。结果:(1)低AGEs组较正常对照组LDH值有升高趋势,其差异无统计学意义(P0.05);高AGEs组较正常对照组LDH值明显升高,其差异有统计学意义(P0.05)。(2)正常中药干预组与正常对照组LDH值比较,其差异无统计学意义(P0.05)。(3)AGEs中药干预组较AGEs组LDH值明显降低,其差异有统计学意义(P0.05)。结论:AGEs条件可导致体外纯化培养的大鼠视网膜Müller细胞细胞膜稳定性下降,通透性增加,细胞活力降低,补肾活血中药含药血清可提高AGES条件下视网膜Müller细胞活力,这可能是补肾活血中药防治糖尿病性视网膜病变(DR)的药物干预途径之一。     

基于视网膜Müller细胞的人参皂苷类成分调节糖基化终末产物干预下HIF-1α表达的谱效关系研究

目的:研究人参须根皂苷HPLC指纹图谱与调节糖基化终末产物干预下视网膜Müller细胞HIF-1α活性表达之间的关系,筛选人参防治糖尿病性视网膜病变的活性成分。方法:采用HPLC建立10批人参须根皂苷指纹图谱,测定人参皂苷类成分抑制糖基化终末产物干预下视网膜Müller细胞HIF-1α的表达活性,运用偏最小二乘法研究特征峰面积与药效值之间的谱效相关性。结果:10批人参须根皂苷提取物(剂量:400mg/L)对HIF-1α的活性表达均有不同程度的抑制作用,其中人参皂苷Re、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rd及4个尚未确定结构的成分可能是人参防治糖尿病性视网膜病变的主要活性成分。结论:谱效关系研究为筛选人参防治糖尿病性视网膜病变活性成分提供了一个有效途径。