母胎间差异甲基化片段在无创性产前诊断中的应用价值

目的探讨HLCS、RASSF1A片段在母胎间甲基化状态的差异并评估其在无创性产前诊断中的应用价值。方法收集388例孕妇血浆,其中126例同时收集外周血细胞及胎盘（或绒毛）组织,采用甲基化敏感性限制性酶切联合荧光定量PCR（MSRE＋PCR）技术,检测母胎间HLCS基因、RASSF1A基因甲基化状态的差异,分析其影响因素,并根据孕妇血浆中胎源性HLCS/RASSF1A浓度比值判断胎儿21号染色体数目。结果研究证实HLCS及RASSF1A在胎盘或绒毛组织中均呈高甲基化状态,而在母体外周血细胞呈现低甲基化状态,且这种甲基化差异不受孕妇年龄、孕周、胎儿性别的影响。采用MSRE＋PCR技术对孕妇血浆中HLCS、RASSF1A片段的检出率分别为97.4%和96.9%。计算274例正常妊娠孕妇血浆中胎源性HLCS/RASSF1A比值,确定其95%的参考值范围为0.34～2.02,以此为标准判断102例胎儿21号染色体数目,其中98例二倍体妊娠的准确率为95.9%（94/98）,4例21三体综合征妊娠均获正确诊断。结论高甲基化HLCS、RASSF1A基因可作为孕妇血浆中胎源DNA的标志物,且有望根据孕妇血浆中甲基化HLCS/RASSF1A浓度比值进行21三体综合征的无创性产前诊断。     

妊娠各期母血中胎儿RASSF1A基因含量的测定

目的本文旨在分析确定妊娠早、中、晚各期母血中胎儿DNA的含量,从而为利用孕母血浆循环DNA进行病理性妊娠诊断研究奠定基础。方法收集746例不同孕期孕妇抗凝血,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)技术测定高甲基化RASSF1A基因含量,确定不同孕期孕周孕妇外周血浆中胎儿DNA含量。结果孕妇早、中、晚期孕组血浆胎儿DNA平均含量分别34.68±24.76copies/μL、204.03±124.91copies/μL、338.84±345.15 copies/μL,三组比较有显著性差异(P0.05)。孕妇血浆中的高甲基化RASSF1A水平随着孕周的增长而增高。最早可在7周检测到孕妇血浆中高甲基化RASSF1A基因,含量随妊娠的进程逐渐增加,且在分娩后三天内消失。10例健康未妊娠女性血浆均未检出高甲基化RASSF1A基因。结论用实时荧光定量PCR的方法可确定正常孕妇血浆中不同孕期孕周胎儿DNA的含量,为后续病理性妊娠诊断研究提供实验依据。     

AIRE基因在21-三体综合征无创性产前诊断中应用的可行性研究

目的利用AIRE基因母、胎间差异甲基化,探讨其在无创性产前诊断21-三体综合征患儿中的应用价值。方法随机选择健康的孕妇、非妊娠妇女、21-三体妊娠的孕妇血浆、血细胞、绒毛和胎盘组织,利用甲基化敏感限制性内切酶法,酶切后进行常规PCR检测目的基因AIRE的甲基化模式,分析其影响因素。结果AIRE基因在非妊娠妇女的血细胞和血浆中及妊娠妇女的血细胞中均未甲基化,而在孕妇血浆中高甲基化,且与孕妇绒毛组织和胎盘组织AIRE基因甲基化状态相同,两组间甲基化率差异显著有统计学意义（P〈0．0001）。且母胎间差异甲基化不受孕妇年龄、孕周和胎儿性别的影响。孕早、中、晚期孕妇血浆中甲基化检出率分别为87％、97％、97％稍有不同,但无统计学意义。21-三体妊娠妇女血浆中游离胎儿DNA浓度约为正常孕妇血浆中游离胎儿DNA的2倍。结论在母体和胎儿DNA中AIRE基因甲基化有显著差异,可作为孕妇血浆中胎儿游离DNA表观遗传学标记,有望进行21-三体综合征的无创性产前诊断。     

甲基化荧光PCR定量检测母体循环中不同妊娠状态下胎儿maspin基因

目的依据孕妇血浆中存在游离胎儿DNA的理论,从孕妇外周血浆中分离出胎儿DNA并加以鉴定,预防X连锁遗传病患儿的出生。方法从孕早期、中期及晚期共80名孕妇外周血浆中分离胎儿DNA,采用实时荧光定量PCR（real- time fluorescence quantitative polymerase chain- reaction, FQ- PCR）方法对不同妊娠状态下孕妇外周血中游离的胎儿DNA（fDNA）进行定量分析,初步探讨游离fDNA在不同妊娠状态下的浓度变化,为尽早应用于临床提供科学依据。结果早孕组28例血浆标本中有25例检测到U—MASPIN基因,其平均浓度为57．82拷贝数／ml;中孕组20例血浆标本中均检测到U—maspin基因,其平均浓度为153．08拷贝数／ml;晚孕组32例血浆标本中均检测到U—maspin基因,其平均浓度为219．34拷贝数／ml,组间两两比较,差异有极显著意义（P〈0．01）。结论用实时荧光定量PCR的方法最早在孕72天的孕妇外周血浆中就可以检测到胎儿U－maspin基因,随孕周的增加,母血中胎儿DNA的量也在逐渐增加。实时荧光定量PCR技术在进行无创伤性产前性别诊断中有重要的价值。     

定量检测子痫前期孕妇血浆中超甲基化的RASSF1A基因

目的 探讨子痫前期孕妇血浆中超甲基化的Ras相关区域家族1A(ras association domain family 1A,RASSF1A)基因的水平变化及应用价值.方法 选择晚期妊娠子痫前期患者60例为实验组,其中轻度和重度子痫前期各30例;正常晚期孕妇60名为对照组.提取血浆游离DNA,经甲基化敏感的限制性内切酶处理,实时定量检测酶切前、后RASSF1A基因的浓度,同时检测β肌动蛋白(β-actin)基因以确保酶的完全消化.结果 子痫前期孕妇血浆中超甲基化的RASSF1A基因含量为正常妊娠组的3.31倍.轻、重度子痫前期患者浓度有差异,中位数分别为1659.00 copies/mL及2036.50 copies/mL(P<0.05).结论 子痫前期孕妇血浆中的超甲基化RASSF1A基因含量明显升高,且浓度水平与子痫前期的严重程度相关.     

p16、RASSF1A在肝细胞性肝癌患者肿瘤组织及血浆中异常甲基化的检测及临床意义

目的探讨原发性肝细胞性肝癌(HCC)患者肿瘤组织及血浆中p16及RASSF1A启动子区的甲基化状态及其在HCC早期无创诊断中的意义。方法采用甲基化特异性PCR技术检测60例HCC患者肿瘤组织、癌旁组织、血浆及60例正常肝脏患者肝组织及血浆中p16、RASSF1A基因启动子区域的甲基化状态,分析其与肝癌患者临床病理参数之间的关系。结果 60例HCC患者血浆、肿瘤组织及癌旁中p16基因甲基化率分别为68.3%(41/60)、63.3%(38/60)和41.7%(25/60);RASSF1A基因异常甲基化检出率分别为73.3%(44/60)、70.0%(42/60)和36.7%(22/60);60例正常肝脏患者肝组织及血浆p16、RASSF1A未检测到基因启动子区域的甲基化,差异有统计学意义(P=0.000)。HCC患者外周血浆和癌组织中p16、RASSF1A基因的甲基化率与患者年龄、性别、AFP、有无肝炎病毒感染(HBV)、有无肝硬化、Child分级、肿瘤个数、包膜完整与否、有无癌栓、是否复发、病理分级、肿瘤分期无统计学相关性。结论 HCC患者肿瘤组织及血浆DNA中可检测到RASSF1A基因和p16基因的甲基化,外周血p16基因和RASSF1A基因的甲基化检测对肝癌筛查有重要意义,可能成为HCC新的肿瘤分子标记物。     

不同妊娠状态下孕妇外周血中游离胎儿DNA定量分析

目的对不同妊娠状态下孕妇外周血中游离胎儿DNA(f DNA)定量分析,确定其平均浓度及临床参考值范围,初步探讨在不同妊娠状态下母血中f DNA的浓度变化,为临床应用提供科学依据。方法从孕妇外周血浆中提取fDNA,用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测其中Y性别决定区的SRY基因。结果在正常早期的孕妇组38例血浆标本中有32例检测到SRY基因,其平均浓度149.25拷贝数/ml,参考值范围为33.28~265.22拷贝数/ml;在正常晚期的孕妇组32例血浆标本中全部检测到SRY基因,其平均浓度为212.14拷贝数/ml,参考值范围为142.76~281.52拷贝数/ml;在晚期患有子痫前期的孕妇30例血浆标本中全部检测到SRY基因,其平均浓度为678.70拷贝数/ml,参考值范围为595.01~726.40拷贝数/ml。实验数据用单因素方差分析,组间差异显著性检验用LSD-t检验。妊娠晚期孕妇血浆中f DNA的含量较妊娠早期升高,约为1.4倍,有统计学意义(P<0.01);晚期患子痫前期的孕妇血浆f DNA的水平是同期正常对照组的3.9倍,有统计学意义(P<0.01)。结论1.用FQ-PCR法最早在孕48天孕妇外周血中即可检测到fDNA。2.随着妊娠的进展孕妇血浆中f DNA的含量升高。3.晚期患子痫前期孕妇其血浆f DNA的水平是同期正常对照组的3.9倍,有统计学意义(P<0.01)。4.f DNA在进行无创伤性产前诊断中有重要价值。     

血浆中多基因联合甲基化检测在肺癌诊断中的应用

 目的:探究血浆中CDH13、RASSF13A、DLEC13、SEPT13、RUNX13等抑癌基因启动子甲基化及其联合检测在肺癌诊断中的价值。从中选出诊断效能高的组合。方法: 采用巢式甲基化特异性PCR（nest methylation specific PCR,nMSP）法,检测106例健康人血浆样本、106例肺癌组织和癌旁组织以及其对应的106例术前血浆样本、中基因启动子区的甲基化状态。对血浆基因组DNA修饰后进行多重置换扩增 （multiple displacement amplification, MDA）,以解决血浆DNA模板不足的问题。结果: 肺癌组织样本中的CDH13、RASSF13A、DLEC13、SEPT13、RUNX13基因启动子甲基化率分别为51.9%、44.3%、54.7%、36.8% 、24.5%。对应的血浆样本中的CDH13、RASSF1A、DLEC1、SEPT9、RUNX3基因启动子甲基化率分别为46.2%、41.5%、50.9%、31.1%、19.8%。Kappa一致性检验结果表明肺癌组织与血浆的甲基化检出率一致。CDH13、DLEC1、RASSF1A、SEPT9组合对肺癌的诊断效能明显高于其它组,准确度ACC为82.08%,Youden指数为0.6415（灵敏度为79.49%,特异度为81.13%）。 结论: 血浆多基因联合甲基化检测有望应用于肺癌早期诊断。     

孕妇外周血中胎儿短串联重复序列基因型的检测

目的探讨利用孕妇血浆中胎儿DNA进行遗传病产前基因诊断的可行性。方法应用9个具有高度多态性的短串联重复序列（short tandem repeat，STR）位点，以多重荧光PCR方法对10名健康孕妇孕早、中、晚期共30份血浆标本和非孕期血浆标本中DNA进行STR等位基因扩增。同时检测孕妇丈夫的外周血本，然后进行基因扫描及对照分析，判断胎儿父源性等位基因在孕妇血浆中的检出情况。结果10名孕妇均足月分娩，男婴3名，女婴7名。10名孕妇血浆中均检出胎儿父源性等位基因，即胎儿DNA。30份孕期血浆标本中有23份检出胎儿DNA，其中孕早期标本6份（6／10）；孕中期标本8份（8／10）；孕晚期标本9份（9／10）。7份标本未见到胎儿DNA。结论应用多重荧光PCR方法对孕妇血浆中DNA进行SFR多态化点的复合扩增，可获得男性和女性胎儿DNA信息，可用于无创伤性产前诊断。     

母体循环胎儿DNA的生物学特点与前置胎盘的关联研究

目的依据孕妇血浆中存在游离胎儿DNA的理论,从孕妇外周血浆中分离出胎儿DNA并加以鉴定,探讨前置胎盘孕妇外周血中胎儿DNA含量的变化及其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative Polymerase chain-reaction,FQ-PCR)方法对35例明确为前置胎盘孕妇血浆中胎儿DNA的含量进行检测并比较,初步探讨游离f DNA在不同状态下的浓度变化。结果前置胎盘粘连组、前置胎盘非粘连组及对照组孕妇血浆中DNA的含量拷贝数分别为(630.34±75.52)、(490.08±56.32)、(230.82±25.47)copys/m I。各组间孕妇外周血中胎儿DNA的含量比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论孕妇外周血中胎儿DNA量与胎盘组织的功能状态有关。测定孕妇外周血中胎儿DNA量可能有助于预测前置胎盘合并胎盘粘连。     

应用QF-PCR技术研究孕妇血浆中胎儿游离DNA与染色体非整倍体妊娠的关系

目的孕21三体胎儿孕妇血浆中胎儿游离DNA水平明显高于正常孕妇,该研究旨在评价妊娠时期孕妇血浆中胎儿游离DNA作为筛查唐氏综合征指标的意义及可行性。方法应用荧光定量PCR技术(QF-PCR)检测怀孕唐氏综合征男胎孕妇和孕正常男胎孕妇血清中胎儿游离DNA的水平。15例孕唐氏综合征男胎孕妇和25例孕正常男胎孕妇及10例孕正常女胎孕妇参与该项研究。结果孕唐氏综合征孕妇血清中胎儿游离DNA水平为185.8基因当量/ml,明显高于正常组(81.9基因当量/ml),P=0.005。结论孕唐氏综合征男胎孕妇血清中胎儿游离DNA含量明显高于正常组,提示荧光定量PCR技术检测孕期母血中胎儿游离DNA水平可能成为筛查唐氏综合征的一个有效指标。     

胎盘CYP11A1基因启动子甲基化与胎儿生长受限和子痫前期的相关性

目的探讨CYP11A1基因启动子甲基化改变与胎儿生长受限(FGR)和或子痫前期(PE)的相关性。方法针对正常妊娠对照26例、胎儿生长受限(FGR) 40例、子痫前期(PE) 40例及胎儿生长受限合并子痫前期(FGR-PE) 18例标本,采用焦磷酸测序和实时荧光定量PCR,检测CYP11A1基因的甲基化和mRNA表达水平。结果胎盘中CYP11A1基因在FGR、FGR-PE、PE中呈低甲基化水平,尤其在FGR-PE中CYP11A1基因甲基化水平相对更低;同时,可能受到CYP11A1基因低甲基化状态的反向调控,CYP11A1基因的mRNA表达水平显著上调。结论CYP11A1基因甲基化作为胎盘组织特异性表观遗传学分子标志物,与胎儿生长受限、子痫前期等疾病相关。     

荧光定量PCR检测孕妇外周血中游离胎儿DNA在子痫前期中的价值

目的探讨孕妇外周血中的游离胎儿DNA水平作为子痫前期预测指标的可能。方法普通PCR检测子痫前期孕妇22例和正常孕妇25例的血浆中Y染色体性别决定基因（SRY）,然后应用荧光定量PCR技术对有SRY基因表达者的胎儿DNA水平进行定量分析并比较子痫前期孕妇组和正常孕妇组胎儿DNA水平的差异。结果22例子痫前期患者及25例对照组中各有12例出现SRY阳性信号。子痫前期组的胎儿DNA水平明显高于正常对照组（P〈0.01）。结论孕妇外周血中的游离胎儿DNA可望作为预测子痫前期的指标之一。     

孕妇外周血中游离胎儿DNA的检测在早产预测中的价值

目的探讨孕妇外周血中的游离胎儿DNA检测的可行性及其水平变化在早产预测中的价值。方法普通PCR检测17例先兆早产孕妇和20例正常孕妇血浆中Y染色体性别决定基因(SRY),继应用荧光定量PCR技术对有SRY基因表达者的胎儿DNA水平进行定量分析并进一步比较早产孕妇组和正常孕妇组间DNA水平的差异。结果17例先兆早产患者及20例对照组中各有9例、10例出现SRY阳性信号。先兆早产组的胎儿DNA水平明显高于正常对照组(P<0.01)。结论孕妇外周血中的游离胎儿DNA可望作为预测早产的指标之一。     

Rh阴性孕妇外周血基因鉴定胎儿RhD血型的方法

目的建立可靠有效的检测孕妇外周血中胎儿游离DNA的方法,探讨其在非创伤性产前诊断中的价值。结论采用PCR技术对5例RhD阴性孕妇外周血血浆DNA进行分析,然后对出生后婴儿脐带血进行Rh血清学表型分析,回顾性评价无创性预测胎儿RhD基因分析的准确性。结果 5例RhD阴性血浆标本扩增出180bp与156bp两条特异性片段,产后新生儿脐血血清学检测结果为RhD阳性,与PCR检测结果完全吻合。结论孕妇外周血浆中胎儿游离DNA的测定能实现对胎儿RhD基因型的预测判定。孕妇外周血检测胎儿DNA可应用于非创伤性产前诊断。     

孕妇血浆中胎儿DNA在产前诊断中的应用

目的 探讨孕妇血浆中胎儿DNA在无创性产前诊断中的应用。方法 应用酚—氯仿法抽提44名孕7～41周妇女血浆中胎儿DNA，通过PCR扩增胎儿Y染色体上DYZl位点，长度为149bp。结果 22名妊娠男性胎儿孕妇中全部出现DYZ1基因扩增条带，检出率为100．00％。22名妊娠女性胎儿孕妇中20例为阴性结果，两例假阳性结果。早、中、晚孕期性别符合率分别为88．89％、100．00％、96．55％，总符合率为95．45％。结论 使用酚—氯仿法抽提血浆中的DNA。提高模版的浓度和纯度进行PCR，增加了结果的准确性。提示母体血浆中游离的胎儿DNA可以作为无创性产前诊断的标本来源。     

手术终止妊娠对早孕妇女外周血中游离胎儿DNA的影响

目的检测在孕早期手术终止妊娠是否会对母体外周血浆中的胎儿DNA水平造成影响。方法选择孕6~9w妇女36例(自愿要求终止妊娠,无禁忌症,胎儿性别为男性),在其终止妊娠前后分别采取外周静脉血5m l,对其血浆中的游离胎儿DNA的SRY基因行荧光定量分析。结果在36例血浆标本中,术前有31例检测到胎儿DNA,术后全部检测到胎儿DNA。其浓度平均分别为62.40±21.70(31.80~128.00Eq/m l),101.04±37.40(58.20~209.70Eq/m l),术前与术后胎儿DNA含量有统计学差异(P<0.01)。结论①孕妇外周血中游离胎儿DNA最早在孕45天即可检测到。②外周血中游离胎儿DNA的水平在妊娠终止后很快升高。③孕妇外周血中的游离胎儿DNA很可能来源于母胎之间出血。     

妊娠糖尿病孕妇外周血中胎儿游离DNA的定量检测

目的依据孕妇血浆中存在游离胎儿DNA的理论,探讨其在诊断及预防妊娠期糖尿病（GDM）中的应用价值。方法用血浆DNA抽提法提取62例孕中晚期孕妇外周血中胎儿游离DNA（其中病例组32例,对照组30例）,通过实时荧光定量PCR（RQ-PCR）法检测两组孕妇外周血胎儿DNA浓度。结果 39例孕男胎均出现SRY阳性信号,妊娠期糖尿病组孕妇外周血中胎儿游离DNA-SRY水平明显高于对照组（P〈0.05）。结论妊娠期糖尿病孕妇外周血中游离胎儿DNA水平的异常升高有望成为预测及诊断GDM发病与疾病程度的一项有效指标。     

妊娠期高血压疾病孕妇外周血中游离胎儿DNA的检测

目的探讨实时荧光定量PCR（RQ—PCR）检测孕妇外周血中胎儿游离DNA对预测及预防妊娠期高血压疾病的应用价值。方法选15例子痫前期孕妇及正常孕妇20例，用RQ—PCR法检测各例血浆中GAPDH及SRY水平，通过2^-△△ct法分析两组孕妇间的差异。结果22例孕男胎检出SRY21例，13例孕女胎均未检出，子痫前期组胎儿DNA水平明显高于正常组（P=0．009），两者比值为3．57。结论RQ—PCR法检测孕妇外周血中胎儿DNA可作为预测及预防妊高征的一种有效手段。     

痰标本FHIT、P16、MGMT、RASSF1A、APC基因甲基化在肺癌诊断中的作用

目的 探讨肺癌患者痰标本中FHIT、P16、MGMT、RASSF1A和APC等抑癌基因启动子异常甲基化及其联合检测在肺癌筛查及早期诊断中的价值.方法 采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)法,检测47例肺癌组织及对应的痰标本FHIT、P16,MGMT、RASSF1A和APC基因启动子区甲基化状态.24例肺良性疾病患者痰标本作为对照.结果 47例肺癌组织标本中FHIT、P16、MGMT、RASSF1A、APC基因启动子区甲基化检出率分别为40.4%(19/47)、53.2%(25/47)、36.2%(17/47)、21.3%(10/47)和38.3%(18/47);对照的痰标本中五者甲基化检出率分别为38.3%(18/47)、48.9%(23/47)、36.2%(17/47)、17.0%(8/47)和29.8%(14/47),两组甲基化检出率存在着一致性[P>0.05;κ(0.8～1.0)].24例肺良性病变痰标本中未检测到任何异常甲基化,与肺癌组比较差异有统计学意义(P<0.05).五项指标联合检测可明显提高肺癌检测的灵敏度(80.9%)和特异度(100.0%).FHIT和P16基因痰标本甲基化检出率与患者吸烟指数有相关性(P<0.05).结论 痰标本中多个肺癌相关基因甲基化联合检测有望成为肺癌筛查、早期诊断简便有效的指标.