血液放置时间和RNA反复冻融对RNA质量的影响

正在临床和科研工作中,血液和组织是比较容易获取的生物标本,特别适用于临床和实验室检测及生物样本库收集保存。DNA、RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子,其中RNA在人类多种生理和病理过程中发挥着举足轻重的作用。RNA通常是从组织、全血和培养的细胞中提取获得~([1]),高质量RNA可满足RT-PCR、Northern blot、基因表达谱、转录组测序和阵列分析等生物学实验的研究需求~([2-3])。由于     

保存温度、时间和冻融次数对RNA样本浓度和纯度的影响

RNA 在人类多种生理和病理过程中发挥着举足轻重的作用.近些年来,随着分子生物技术在生命科学、医学等方面的广泛应用,以 RNA 为靶标进行的组织及细胞的分子生物学研究较为广泛.在 RNA 的科学研究中,高质量 RNA 可满足 RT-PCR、Northern blot、基因表达谱、转录组测序和阵列分析等生物学实验的研究需...     

RNA m~6A修饰在肺部疾病中的研究进展

正N~6-甲基腺苷(N~6-methyladenosine,m~6A)修饰是指RNA中腺苷的第6位氮原子处发生的甲基化修饰。在已发现的RNA修饰中,m6A修饰被认为是真核生物m RNA中最常见的修饰类型。此外,这种甲基化修饰也可发生在r RNA、t RNA、mi RNA、circ RNA和lnc RNA[1]。Dominissini等[2]的研究显示,m6A修饰位点主要集中在终止密码子附近和长内部外显子上,这些位点存在共有序列RRm6ACH(R=G/A,H=C/U/A),并且在人类和鼠之间高度保守。由于RNA修饰增加了RNA结构的复杂性,影响生物学过程[3],     

基于生物学信息分析及推测PCGEM1在前列腺癌中的表达分子调控网络

非编码 RNA,包括以 miRNA、siRNA 和 piRNA 等为代表的短小 RNA 和长链非编码 RNA（long non-coding RNA,lncRNA）。长链非编码 RNA,有别于其他小分子非编码 RNA,是目前非编码 RNA 研究的热点。随着研究的不断推进,人们发现 lncRNA 与物种进化、胚胎发育、物质代谢以及肿瘤发生等都有着密切的联系[1]。miRNA 是一类长度为21~25个核苷酸（nt）的单链 RNA,属于非编码蛋白 RNA,广泛存在于生物界,miRNA 调节人类1/3基因的表达,miRNA 是一类新发现的基因调节剂,可以在转录水平或转录后水平调节基因的表达,在肿瘤的发生与发展中扮演着“癌基因”与“抑癌基因”的角色[2]。前列腺癌基因表达标记1（prostate cancer gene expression marker 1, PCGEM1）全长1643 nt,在前列腺组织及前列腺癌组织中呈特异表达的长链非编码 RNA,但其表达调控网络目前未知[3],本文旨在运用生物学软件对其进行生物学信息分析,为下一步实验验证其表达分子调控网络机制提供线索。     

生物样本库的设施与环境

正生物样本库融合了生物样本实体、生物分子信息以及样本资料数据的综合资源,对于开展人类疾病预测、诊断、治疗等研究具有不可替代的重要作用~[1],是众多重要科研成果快速产业化、实现转化医学和精准医学的重要保证~[2]。世界范围内已将生物样本库视为发展生物医药核心竞争力的重要战略举措之一~[3],纷纷投入大量资金。要建设好生物样本库,设施和环境是根基、是基础,一定要充分重视。下面就生物样本库的设施和环境进行简单介绍。     

长链非编码RNA(LncRNA)的研究进展

<正>随着生命科学的不断发展,人们发现RNA不仅仅是编码蛋白质的遗传物质,还有很多非编码蛋白的RNA,以复杂的调控机制参与机体的生命活动,进一步深入的研究表明,这些非编码蛋白的RNA不仅能够与DNA、蛋白质结合,还可以通过碱基配对与其他的RNA结合形成复合体,参与转录及转录后调控[1,2]。在对人类基因组测序时发现只有2%的基因组序列被转录为具有蛋白编码能力的RNA,这一数     

核酸提取方法的改进

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）广泛应用于RNA病毒的核酸检测,而前期的RNA提取效率高低直接影响到检测效率,以往病毒RNA提取主要采用异硫氰酸胍-酚-氯仿及TRIzol法[1-3]等,但操作步骤都较繁琐,且易造成污染而出现假阳性。     

全面分子筛选:从RT-PCR到RNA测序

到目前为止,对肿瘤和非肿瘤中mRNA表达的分析主要是通过RT-PCR方法.认为它是测定特定靶基因的拷贝数的金标准.RT-PCR的应用提示RNA转录水平可以辅助对各种疾病患者进行分类和预测其预后,这为一些重要的临床试验提供了依据.然而,定量PCR数据质量的固有变异性使其很难重复,并且分析某个基因需要在实验室耗费大量时间.此外,比较基因在不同的实验中的表达水平往往很困难,并且需要复杂的标准化方法.多年来,许多已开发的技术均未能很好地应用于临床.RNA测序是一个新的、简单而有效的用来测定转录组的构成及发现新的外显子或基因的方法.该技术的优点是可重复性高,测序范围广,对RNA样本量的要求低,即使没有基因组测序也能够检测新的转录和剪接.然而,这种RNA测序技术不可能取代目前的RT-PCR方法,但能够根据需求及医院和实验室的资源与其互补.先以RNA测序确定出部分基因,再利用RT-PCR方法进行进一步的检测.这两个互补的技术能够识别肿瘤所有的分子特征,若作为常规分析应用于癌症实验室,将有助于对病人的分类,同时可以协助肿瘤学家做出临床决策.     

河南省2012—2015年儿童A组轮状病毒病原学监测及基因型别分析CSCD

目的分析2012-2015年河南省5岁以下腹泻儿童A组轮状病毒的感染状况及病原学特征,为A组轮状病毒感染的监测、防控及爆发病例的调查及疫苗研发提供基线数据和方法学参考。方法采集河南省两个监测哨点医院5岁以下儿童腹泻病例的粪便样本1 433份。双抗体夹心法检测A组轮状病毒,阳性样本抽提病毒RNA,两步巢式多重RT-PCR进行G/P基因分型。结果1 433份腹泻样本共检出A组轮状病毒482份,总阳性率33.6%;轮状病毒检出率的季节性特征显著,存在秋季（9-11月份）和春季（3-5月份）两个较为显著的高峰。A组轮状病毒G分型以G1、G2、G3、G9为主;P分型以P[4]、P[8]为主;型别组合以G9P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G1P[8]为主;还存在混合感染型别。阳性病例中,男女性别比1.4∶1;以4-12个月龄的婴幼儿为主;农村感染率高于城市;临床症状以轻中度腹泻为主,部分病例存在发热、呕吐、脱水等现象。结论河南省5岁以下腹泻患儿中存在较高的A组轮状病毒感染率,以秋季和春季为主,且存在混合感染病例;病原体可分为多种基因型别,G9P[8]为优势型别;大部分感染病例以轻症为主。     

不同样本测序前处理方案对冠状病毒基因组高通量测序结果的影响

目的以基因组最大RNA病毒(冠状病毒)为代表,研究不同测序前样本处理模式对高通量测序获得病毒全基因组序列信息质量的影响。方法以细胞培养的人冠状病毒HCoV-OC43样本为代表,分为4种测序前样本处理模式,即:未处理组、核酸提取前DNase和RNase处理组、核酸提取后DNase处理组、核酸提取前DNase和RNase处理且核酸提取后DNase处理组。不同模式处理后的核酸分为两份,一份直接RNA测序(未扩增),另一份经序列非依赖的单引物扩增(SISPA)后DNA测序。结果尽管不同处理方式下获得的病毒基因组覆盖率差别不大,但是样本核酸提取后经DNase处理组直接测序获得了最高的基因覆盖度和测序准确性,而SISPA扩增可有效提高病毒测序读长(reads)比例与基因组各位点的测序深度。结论本研究为优化冠状病毒等RNA病毒全基因组测序策略提供了技术参考。     

我国科学家开发出转录组快速建库新方法 有望助力新型冠状病毒测序

新华社北京2月1日电(记者魏梦佳)北京大学与清华大学联合课题组近期在国际权威学术期刊《美国科学院院刊》发表论文,称开发出了名为"SHERRY"的转录组测序快速建库新方法。研究团队表示,这种方法大大简化了建库过程,不仅可用于高质量的单细胞转录组测序,对包括新型冠状病毒等样本的测序质量和速度也有望显著提升。核糖核酸(RNA)是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。目前,RNA测序技术已广泛应用于绘制物种转录组图谱、研究疾病分子调控机制等方向。据了解,针对不同研究需求,不同起始量的RNA需采用不同的RNA扩增方法,但目前常见的扩增方法大多操作繁复、耗时长。对于微量样本的检测,也存在很多技术挑战。     

长链非编码RNA对能量代谢和相关疾病发生发展的作用

<正>随着高通量测序技术的发展和ENCODE计划揭示,曾一度被认为是无功能的"转录噪音"的非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA),近年来被证实在细胞分化、生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用[1]。其中长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类转录本长度超过200 nt的非编码RNA,在哺乳动物基因组中,有4%~9%的序     

circEPSTI1与恶性肿瘤关系的研究进展

<正>环状RNA(circular RNA,circ RNA)是一类具有共价闭合环状结构的内源性非编码RNA,不具有5’帽状结构和3’腺苷酸尾结构。由于其闭合环状结构对核酸外切酶具有较高的耐受性,circ RNA不易被降解,因此,可稳定存在于真核生物细胞的细胞质中。1976年,circ RNA首次被Sanger等[1]发现,最初认为是RNA错误剪接所产生的无功能产物。随着生物信息学和高通量测序技术等的发展,大量研究报道circ RNA在肿瘤中具有海绵化微小RNA(micro RNA,     

恶性肿瘤中MNX1反义RNA 1的作用及机制研究进展

<正>长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)是一类广泛存在于细胞核和细胞质内、长度在200 nt以上、缺少开放阅读框、不参与或很少参与蛋白质编码、主要从蛋白编码基因的反义链及间隔区转录出来的RNA^[1-6]。已有大量研究证实,lnc RNA涉及调控多种生物学功能,比如细胞增殖、凋亡及血管生成^[7-9]。表达异常的lnc RNA与诸多肿瘤的发生发展密切相关^[10-11]。     

K562细胞DHRS4 L1基因新选择性剪接亚型的克隆及二级结构预测

目的： K562细胞DHRS4L1[ dehydrogenase／reductase （ SDR family） member 4 like 1]的表达及其二级结构分析。方法以K562细胞cDNA为模板, PCR扩增DHRS4[ dehydrogenase／reductase （ SDR fami-ly） member 4]基因簇Ea2转录本。将PCR产物A-T克隆至pGEMT-Easy质粒,对质粒进行DNA Sanger测序。将测序所得序列用NCBI ORF finder分析是否存在编码区,用Clustal Omega分析RNA序列系统树,用RNAfold web server分析RNA最小自由能二级结构。结果用RT-PCR和Sanger测序方法发现, K562表达DHRS4L1 Ea2转录本,未检测到其表达DHRS4L2[dehydrogenase／reductase （SDR family） member 4 like 2] Ea1转录本。 K562表达的DHRS4L1 Ea2至少有8种选择性剪接亚型（ KU058702、 KU058703、 KU058704、KU058705、 KU058706、 KU058707、 KU058708、 KU058709）,其中6种为首次发现。 KU058702、 KU058703、KU058704、 KU058705和KU058707第二外显子受到多种形式的选择性剪接,恰好仅影响第2臂的二级结构,不影响其他臂的二级结构,提示这些不同亚型的二级结构有一定相似性,第二外显子所对应的二级结构臂可能在区分不同 DHRS4L1亚型功能中发挥关键作用。结论研究发现 K562细胞至少表达8种DHRS4L1选择性剪接亚型,为长链非编码RNA。其二级结构分析为后续研究DHRS4L1在白血病细胞中的潜在功能奠定基础。     

从兔外周血直接克隆B细胞κ轻链的可变区

目的 从兔外周血总RNA中直接扩增出B细胞κ轻链的可变区序列.方法 首先从IMGT/GENE-DB数据库中获取大耳白兔Ig胚系基因Vκ(IGKV)、Jκ(IGKJ)和Cκ(IGKC)的cDNA序列、设计引物,然后以非免疫兔外周血总RNA为模板进行RT-PCR扩增,回收产物并克隆到T载体,随机挑选单克隆测序,最终将序列提交到IMGT/V-QUEST,分析出每个克隆的Vκ-Jκ组合,并利用BioEdit的本地Blast程序比较出Cκ的基因型.结果 共设计出4对引物,其中引物对RK.C1[4-5-9]无产物,引物对RK.C1[1-2-7]、RK.C1[3-6-8]和RK.C2[1-2-3-4]有产物,分别回收、克隆到T载体后各挑取20个克隆,共获得51个克隆的插入子序列.没有任何2个克隆的插入子序列完全相同,每个克隆均包含完整的兔Vκ、Jκ及Cκ的5'端序列,其中Vκ-Jκ-IGKC1组合的克隆33个,Vκ-Jκ-IGKC2组合的克隆18个;68个Vκ胚系基因中有22个出现,其中频率最高的是IGKV1S10*01(12次),其次是IGKV1S36*01、IGKV1S37*01和IGKV1S4*01(各5次),其余均为3次以下;8个Jκ胚系基因中只有1个出现,为IGKJ1-2*01;2个Cκ基因的等位基因分别为IGKC1*01和IGKC2*03.33个Vκ-[IGKJ1-2*01]-[IGKC1*01]克隆中有17种不同的组合方式,其中频率最高的为[IGKV1S10*01]-[IGKJ1-2*01]-[IGKC1*01](7次).18个Vκ-[IGKJ1-2*01]-[IGKC2*03]克隆中有11种不同的组合方式,频率最高的为[IGKV1S10*01]-[IGKJ1-2*01]-[IGKC2*03](5次).Vκ-Jκ-Cκ组合方式相同的克隆,序列仍具有明显的差异.结论 利用自行设计的兼并引物,成功并特异地从兔外周血总RNA中直接扩增出了κ轻链的可变区,且产物具有良好的多样性,但所有Vκ-Jκ-Cκ组合中只出现了1种Jκ基因.     

miR-155调控T细胞分化与功能的研究进展

<正>miRNA是在真核生物中发现的一类内源性具有免疫调控功能的非编码小分子RNA,长约19~24个核苷酸,由具有发夹结构的约70~90个碱基大小的单链RNA前体经Dicer酶加工而成,在转录后水平调控基因表达。miRNA主要通过与特定的靶信使RNA(mRNA)的3'非编码区直接结合,降解靶RNA或抑制其翻译,进而影响目的基因的表达[1-3]。     

测序技术发展状况及相关专利分析

<正>基因是生物体的遗传信息载体,其遗传和表达影响生物体的繁衍及各种生命活动。对于人类而言,个体基因组DNA序列突变往往会导致疾病的发生,获取个体的基因组DNA信息将有助于疾病的预防、诊断和治疗[1]。正因如此,科学家们奉献了无数心血研究DNA或RNA测序技术,以期解密这些神奇的生命密码。于此同时,基因测序所带来的巨大经济利益也使得更多科研机构和企业积极投身于这项改变世界的事业,企业乃至国家之间的竞争愈演愈烈。     

应用2周龄ICR小鼠建立CVA16感染模型

正Enterovirus 71(EV71)和coxsackievirus A16(CVA16)都属于小核糖核酸病毒科的单正链RNA病毒,是引起手足口病的两个主要病原体~[1]。临床上,这两种病毒的感染通常是自限性的,小部分感染常与神经系统疾病相关,包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎和急性弛缓性麻痹等~[2]。手足口病已成为一个严重的公共卫生问题,在日本、马来西亚、新加坡、越南、中国大陆等亚太地区存在周期性的爆发流行~[3-5]。     

河北省磁县食管癌高发现场生物样本库建立与管理

肿瘤组织生物样本在肿瘤的研究中扮演着重要的角色[1],生物样本库包括生物样本实体、生物分子及样本相关临床资料等综合资源,对于开展人类疾病预测、诊断、治疗研究具有重要的作用.转化医学的兴起和发展对生物样本资源的迫切需求与日俱增[2-3].在我国已有多家单位建立了不同规模、不同类型和不同管理与应用方式的组织和血液样本资源库[4-8].本文对磁县生物样本库的建设和管理进行介绍.