BMSCs种植双相复合支架修复兔关节软骨及软骨下骨缺损

目的关节软骨的病变常伴有软骨下骨缺损,其修复重建一直是骨科难题。探讨BMSCs-双相支架复合物修复骨软骨缺损的可行性,比较其与植入单纯双相支架及动物自身修复效果的差别具有重要意义。方法以聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物(poly-lactic-co-glycolic acid,PLGA)、羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)为原料制备由软骨相和骨相构成的三维支架,提取天然Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,ColⅠ)涂于表面制成PLGA-HA-ColⅠ双相支架。取新西兰乳兔骨髓分离培养获得的第2代BMSCs,以1×106个/mL接种于双相支架,扫描电镜观察支架结构和细胞分布。取30只6月龄新西兰大白兔,建立股骨远端关节面骨软骨缺损模型,随机均分为3组,A、B组分别于缺损区植入单纯双相支架和BMSCs-双相支架复合物,C组作为空白对照组未植入支架材料。于术后1、3、6、9个月取材行大体及组织学观察,术后9个月对A、B组标本行大体评分比较、micro CT扫描定量分析及免疫组织化学染色观察。结果扫描电镜示双相支架孔隙连通性好,软骨相和骨相孔径不同,BMSCs在双相支架内生长良好。大体观察示术后9个月内A组关节表面逐渐形成类软骨样组织,部分出现塌陷或不规则缺损;B组关节面无塌陷或碎裂,新生组织质地更接近正常组织;C组缺损一直存在。大体评分显示3组修复效果比较差异均有统计学意义(P0.001),B组优于A组,C组最差。micro CT扫描示A、B组软骨下骨得到良好的修复重建,定量分析示B组骨组织体积分数、结构模型指数及骨小梁数目均高于A组,但差异无统计学意义(P0.05)。组织学观察示术后1个月A、B组缺损区存在炎性反应;术后3个月新生组织长入;术后6个月支架完全降解,新生组织在植入物及缺损边缘爬行生长;术后9个月形成大量胶原纤维,表面多为纤维软骨。C组观察期内缺损持续存在。术后9个月免疫组织化学染色示A、B组标本缺损区ColⅡ染色呈弱阳性,ColⅠ染色阳性。结论PLGA-HA-ColⅠ双相支架具备较适宜的一体化修复骨软骨缺损的物理特性,接种BMSCs后整体修复效果更好。     

同种异体软骨移植修复关节软骨缺损实验研究

目的 采用兔膝关节软骨标本经打孔梯度降温冻存后行同种异体移植,研究打孔梯度降温冻存对兔关节软骨的影响及其修复关节软骨缺损的效果.方法 自16只2月龄新西兰白兔膝关节股骨髌面取分别取3块骨软骨移植物,随机分为3组.Ⅰ组为实验组,在软骨上以3 mm×3 mm矩阵打孔,Ⅱ、Ⅲ组为对照组,不打孔.分别将软骨标本置于二甲基亚砜冷冻保护溶液中,并经梯度降温至-80℃(Ⅰ、Ⅱ组)或直接置于-80℃(Ⅲ组)保存1周,复温后移植到成年兔相应膝关节部位.术后分批处死动物,通过对移植物的大体形态学、组织学、免疫组化染色光镜观察,研究各组移植物保存效果的差异.结果 Ⅰ、Ⅱ组光镜观察结果明显优于Ⅲ组;Ⅰ组与Ⅱ组结果差异不明显,但Ⅰ组对中间层软骨组织的保护明显加强.结论 关节软骨的梯度降温冷冻保存效果明显优于快速降温冷冻保存,且关节软骨打孔冷冻保存对深层软骨细胞有一定的保护作用,可提高软骨细胞存活率,延缓移植软骨组织的退变过程.     

培养软骨移植修复关节软骨缺损的实验研究

目的：为探讨一种新的关节软骨缺损修复方法。方法：将体外培养２周形成软骨样组织,移植修复兔关节软骨全层缺损。于移植术后２、４、８周分别行功能评价、大体形态及组织学检查。结果：全部实验兔于术后２周内恢复正常活动。２周时移植修复组织由非成熟透明软骨组成。４周时部分移植组出现成熟透明软骨。８周时移植组关节软骨缺损全部由成熟透明软骨充填修复,修复组织与邻近关节软骨融合。培养软骨移植修复关节软骨全层缺损明显优于自身修复（Ｐ＜００１）。结论：本实验提示使用具有高有丝分裂率的软骨细胞,经离心管培养形成骺软骨样组织,植入关节软骨全层缺损后,软骨细胞生长良好,逐渐成熟和转化,能发挥良好的修复作用。     

多孔钽复合BMP-7修复兔软骨及软骨下骨缺损的实验研究

目的研究多孔钽与BMP-7复合后对兔关节软骨及软骨下骨缺损修复的作用,探讨其软骨修复能力及与宿主组织的生物相容性。方法取成年新西兰大耳白兔48只,随机分为3组(n=16),制备兔股骨内髁软骨缺损模型,分别于右侧股骨内髁植入复合BMP-7多孔钽材料(A组)、多孔钽材料(B组)及不植入材料(C组)。术后观察动物一般状况,术后4、8、16周取材行大体、组织学、扫描电镜观察,术后16周行Micro-CT观察A、B组组织空隙内软骨及骨长入情况和多孔钽周围成骨情况。结果术后动物存活良好,手术切口均Ⅰ期愈合。大体观察示,随时间延长,A、B组术后缺损区材料表面均出现新生软骨并逐渐覆盖缺损区域,A组术后新生软骨组织出现更早,表面平整光滑,修复程度较B组好;C组术后各时间点缺损区均未修复,表面逐渐被纤维组织填充。除术后4周A、B组软骨缺损修复大体观察评分比较差异无统计学意义(P0.05)外,术后8、16周A组评分均高于B组(P0.05)。扫描电镜观察示,随时间延长,A组材料表面新生软骨及成骨细胞数量逐渐增多,细胞外基质逐渐将材料覆盖,孔隙内长入的新生骨组织逐渐增多,A组新生骨组织及细胞外基质分泌明显多于B组。甲苯胺蓝染色组织学观察示,术后4、8、16周两组多孔钽界面新生软骨及骨组织逐渐增加,出现新生骨小梁并向材料孔隙内生长,骨组织与多孔钽接触趋于紧密,软骨缺损区域逐渐被新生软骨样组织覆盖,新生软骨组织与多孔钽结合越发紧密;A组新生软骨及骨组织多于B组。Micro-CT观测示,术后16周A组组织骨密度、骨小梁厚度、骨小梁数目、骨体积分数均高于B组,骨小梁间隙低于B组,比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论多孔钽具有良好的生物相容性,其与BMP-7复合后可与宿主形成稳定的连接与整合,对软骨及软骨下骨缺损修复起良好作用。     

脱细胞软骨支架材料修复兔关节软骨缺损

目的 观察异种异体脱细胞软骨支架材料(ACM)复合同种异体兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)修复兔股骨内髁关节软骨缺损的效果.方法 (1)密度梯度离心和差速贴壁法获得原代兔BMSCs,选择第3代BMSCs作为种子细胞;(2)利用冷冻干燥、胰酶消化和化学去垢剂等方法制备脱细胞软骨支架材料;(3)3个月龄新西兰兔股骨内髁制备直径4 mm,深3 mm砌关节软骨缺损模型,24只新西兰兔以2个时间段随机分为3组,Ⅰ ACM-BMSCs组:第3代BMSCs 1×106个/ml与ACM于37℃5%CO2饱和湿度复合48 h;Ⅱ ACM组;Ⅲ空白对照组.(4)移植6、12周后大体及组织学观察,免疫组织化学染色观察修复组织Ⅱ型胶原,Wakitani评分评估修复效果.结果 (1)大体观察及组织学观察:6和12周Ⅰ组再生组织与正常关节软骨面平齐,修复部位表面较平整,界限模糊,接近正常软骨.Ⅱ组修复组织表面不平整并有明显下陷,修复组织全层可见成纤维样细胞,深层可见极少数透明软骨样细胞.Ⅲ组未见明显修复,肉芽组织形成伴成纤维样细胞增生;(2)Wakitani组织学评分可见在不同的时间段I组和Ⅱ组均低于Ⅲ组,差异有统计学意义(P<0.05),Ⅰ组和Ⅱ组间组织学评分差异无统计学意义(P>0.05).(3)免疫组织化学:ACM-BMSCs组修复组织的细胞为软骨样细胞,可见柱状排列,周围软骨基质Ⅱ型胶原染色阳性.结论 以ACM为支架材料,同种异体BMSCs为种子细胞制备的组织工程化软骨对兔股骨内髁关节软骨缺损有修复作用,形成的新生软骨为透明软骨样组织.     

诱导后自体骨髓基质细胞移植修复兔关节软骨缺损

目的采用经诱导的兔自体骨髓基质细胞移植于受损关节软骨组织进行修复，并对其组织形态学进行观察。方法取新西兰兔髂棘骨髓，分离基质细胞，以含碱性成纤维生长因子 (basic fibroblast growth factor, bFGF,25 ng/ml)及转化生长因子 (transforming growth factor beta 1, TGF-β 1,2 ng/ml)的无血清培养液作诱导培养。采用明胶海绵为载体，实验组用诱导培养后的骨髓基质细胞移植修复兔自体股骨髁关节面的缺损；对照组仅进行单纯明胶海绵移植。结果诱导后的骨髓基质细胞，通过 RT- PCR检测证实有Ⅱ型前胶原 mRNA表达。移植 24周后，肉眼下实验组移植物与正常软骨组织难以区分，表面光滑。而对照组移植物在 24周后为白色松软的组织。光镜下，实验组移植 4周后新生的软骨组织即充填于软骨缺损区，甲苯胺蓝异染性明显， 12周时修复组织逐渐塑形， 24周后修复组织塑形成类似周围正常的软骨组织结构；对照组关节缺损区在各阶段无明显关节软骨修复， 24周后关节缺损区被纤维软骨样组织充填，甲苯胺蓝异染性不明显。结论经诱导后自体骨髓基质细胞移植于受损关节软骨，可促进软骨缺损的快速修复，恢复软骨组织的结构和功能。     

自体骨软骨移植治疗股骨髁关节软骨缺损

目的探讨关节镜下自体骨软骨移植治疗关节软骨缺损的可行性。方法16例膝关节软骨缺损患者,关节镜下在其非负重区的软骨面上用专用器械凿取圆柱状骨软骨,移植至软骨缺损部位以修复缺损。术后行系统功能锻炼和MRI检查。结果随访7～20个月,患者关节症状消失,关节活动度正常,MRI显示原关节软骨缺损区表面平整,移植骨软骨位置良好。Brittberg-Peterson评分：13例0分,2例2分,1例1分。结论关节镜下自体镶嵌式骨软骨移植术创伤小,操作简单,能保持关节面曲度,可用于修复关节软骨缺损。     

同种软骨移植后胶原含量变化的实验研究

采用生化手段测定了豚鼠异体软骨移植后１～２０周软骨胶原含量的变化，结果显示：术后第３周起软骨胶原含量开始下降，至第４周达最低点（Ｐ＜０．０５），此后逐渐回升，至第８周时已接近于正常组并维持在接近于对照组的水平（Ｐ＞０．０５）。提示可采用生化测定胶原在同种软骨移植后不同时期的含量变化来评价异体软骨移植后的结构和弹性变化。     

同种软骨移植后胶原含量变化的实验研究

采用生化手段测定了豚鼠异体软骨移植后1～20周软骨胶原含量的变化,结果显示:术后第3周起软骨胶原含量开始下降,至第4周达最低点(P<0.05),此后逐渐回升,至第8周时已接近于正常组并维持在接近于对照组的水平(P>0.05)。提示可采用生化测定胶原在同种软骨移植后不同时期的含量变化来评价异体软骨移植后的结构和弹性变化。     

同种软骨移植后胶原含量变化的实验研究

采用生化手段测定了豚鼠异体软骨移植后１￣２０周软骨胶原含量的变化。结果显示，术后第３周起软骨胶原含量开始下降，至第４周达最低点（Ｐ〈０．０５），此后逐渐回升，至第８周时已接近于正常组并维持在接近于对照组的水平（Ｐ〉０．０５），提示可采用生化测定胶原在同种软骨移植后不同时期的含量变化来评价异体软骨移植后的结构和弹性变化。     

软骨移植与软骨下骨钻孔修复全层关节软骨缺损的比较实验研究

目的 :评价软骨移植、软骨下骨钻孔修复关节软骨缺损的生物特性和效果差异。方法 :采用重复拉丁方设计 ,将 36只雄性新西兰大白兔按三个因素三个水平进行随机区组 ,对左右后肢按设计好的创面大小制造全层软骨缺损。软骨移植组将不同家兔关节软骨交换嵌入移植。钻孔组依创面大小制造孔直径、间距、深度相同的骨孔 ,深达松质骨。对照组缺损不作任何修复。术后 4、8、1 2周处死取材 ,分别进行大体观察、光镜观察、电镜观察 ,对观察指标进行量化统计学分析。结果 :(1 )两实验组在第 1 2周时均能以类透明软骨组织修复缺损 ,而对照组为纤维肉芽组织 ,统计学分析表明各组间有显著性差异 (P <0 .0 1 )。 (2 )光镜观察表明两种手术方法均能以软骨的方式修复缺损 ,软骨移植组无明显免疫排斥迹象 ,软骨细胞有活性 ,各组间有显著性差异 (P <0 .0 1 )。 (3)形态学分析表明 ,随时间延长 ,光密度与修复高度渐增 ,其中软骨移植组优于其他各组 (P <0 .0 1 )。 (4)随时间延长修复效果逐渐改善。小创面修复效果与中等创面间无明显差异。 (5)电镜观察表明 ,两种手术方法均有软骨细胞生成 ,细胞器发达。对照组符合纤维肉芽组织特征。结论 :(1 )软骨移植、钻孔均能以类透明软骨的结局修复关节软骨缺损 ,软骨细胞生物学特性类似     

同种异体兔关节软骨细胞移植实验研究

将幼兔关节软骨细胞复层培养后植入同种成年兔关节软骨面人为缺损部，术后１．５个月－６．５个月采用大体、ＨＥ、甲苯胺兰、番红花精０染色及放射性自显影等方法观察软骨细胞修复缺损情况。结果表明移植术后１．５个月，植入软骨细胞在局部生长，与周围原有软骨组织融合，将缺损填平。２．５个月－６．５个月仍保持透明软骨性质，无纤维化、骨化、血管长入，免疫排斥反应等。     

软骨生长因子对兔关节软骨缺损修复作用的实验研究

软骨生长因子(cartilage-derived growth factor，CDGF)是能促进软骨细胞生长，加速骨基质合成的类似于碱性成纤维细胞因子(bFGF)的碱性蛋白^[1]。在体外培养兔软骨细胞中，CDGF能以剂量依赖性的方式促进软骨细胞增殖和胶原的合成^[2]。然而生长因子若没有载体的保护，易被稀释或水解，最终失去生物学活性。我们以新西兰大白兔为实     

术后早期活动对同种异体关节移植后关节软骨保护作用的实验研究

目的采用同种异体关节移植动物模型,于术后采用不同处理方法进行对照实验,探讨同种异体关节移植后早期活动对关节软骨的保护作用。方法选用生长条件相同的6月龄新西兰大耳白兔10只(雌雄不限,体重2.5～3.0 kg)作为供体,取其一侧半膝关节,经深低温冻存处理后移植于取下股骨侧半膝关节的6月龄青紫蓝兔(雌雄不限,体重2.5～3.0 kg)膝关节处,术后分别给予早期活动(术后2周,早期活动组,n=5)或持续石膏固定6周(持续固定组,n=5);并取供体对侧半膝关节设立空白对照组(未经任何处理,n=5)和冻存对照组(经深低温处理2周,n=5)。术后分别行大体、X线片及组织学观测,观察同种异体关节软骨的变化情况。结果大体观察示,早期活动组实验兔关节活动良好;持续固定组实验兔关节活动受限明显。X线片示,术后当天、术后2周同种异体关节供体骨端与受体骨端对合整齐、对位对线良好;术后6周,早期活动组3只实验兔受体和供体骨端略有成角畸形,持续固定组对位及对线仍良好。HE染色示,早期活动组同种异体半膝关节标本软骨细胞数量和形态基本正常,偶见核碎裂及核溶解;持续固定组同种异体半膝关节标本中软骨细胞大量减少,大部分细胞核溶解消失,软骨基质中大量纤维组织增生。细胞存活率检测示,早期活动组细胞存活率(49.66%±2.15%)显著高于持续固定组(20.68%±1.24%),比较差异有统计学意义(P<0.05)。扫描电镜观察示,早期活动组同种异体半膝关节标本可见软骨细胞细胞核核膜尚完整,染色质凝聚、边集,线粒体及粗面内质网肿胀;持续固定组同种异体半膝关节标本可见软骨细胞细胞膜消失,软骨细胞与周围基质界限不清,核膜破裂,染色质及细胞质内细胞器消失。结论同种异体关节移植术后进行早期功能活动对兔关节软骨有保护作用,但不能完全阻止软骨退变。     

不同年龄兔前交叉韧带切断后关节软骨变化的研究

目的探讨膝关节前交叉韧带（anterior cruciate ligament,ACL）切断对不同年龄兔关节软骨的影响,为临床选择方法和时机处理不同年龄ACL损伤的病人提供实验依据。方法健康新西兰大白兔30只,按照年龄分成6、12、24个月组,每组10只。每组再随机分为5个小组。切断右膝关节ACL,左膝仅行切开术作为自身对照。分别于术后5、10、15、20、25周气栓处死实验动物,大体观察并对股骨关节软骨进行损伤评分,对股骨内髁进行Masson染色并显微镜观察,测定软骨含水率。结果大体观察和Masson染色病理切片显示,12月龄组兔软骨损伤发展最快,24月龄组兔发展最慢。术后25周时12月龄组兔软骨损伤最重,6月龄组兔次之,24月龄组兔软骨损伤最轻。随着软骨损伤的发展,右侧ACL切断（阳性对照侧）软骨含水率呈现出先升高后降低的趋势。结论不同年龄兔ACL断裂后软骨损伤存在差异,提示ACL断裂后软骨的损伤与年龄有紧密的关系。     

自体骨软骨移植与含富集骨髓干细胞松质骨移植修复兔关节软骨缺损

目的:评价自体骨软骨移植与含富集骨髓干细胞松质骨镶嵌移植两种方法修复全层关节软骨缺损的生物学特征和效果。方法:采用新西兰大白兔制作左右后肢全层软骨缺损模型,分别进行自体骨软骨镶嵌移植、含富集骨髓干细胞松质骨镶嵌移植修复,对照组不作任何修复,每组12只。术后第4、8、12周处死动物取材,分别进行膝关节活动度测定、大体观察、光镜观察与电镜观察。结果:移植实验组在第12周时均能以类透明软骨组织修复缺损,对照组为纤维肉芽组织。形态学检查表明,两种方法均能以类透明软骨组织覆盖缺损,骨软骨移植组无明显免疫排斥现象,随着时间延长,修复高度逐渐增加。骨软骨移植组同含富集骨髓干细胞松质骨镶嵌移植组效果无显著差别。结论:骨软骨移植、含富集骨髓干细胞松质骨镶嵌移植两种方法均能以类透明软骨组织修复全层关节软骨缺损,含富集骨髓干细胞松质骨镶嵌移植更适用于较大面积软骨缺损的修复。     

骨髓基质细胞修复兔关节软骨的实验研究

目的 研究骨髓基质细胞修复兔关节软骨的可行性。方法 取自体骨髓基质细胞体外培养扩增，聚乳酸吸附骨髓基质细胞植入兔膝关节软骨负重（内髁）和非负重区（外髁）缺损内，观察４、８、１２后软骨缺损的修复情况，并对组织切片评分结果 ８、１２周后，骨髓基质细胞在负重区缺损内可以形成透明软骨，组织评分接近正常软骨优于对照，非负重区内没有形成透明软骨。结论 骨髓基质细胞在负重区缺损内可以形成透明软骨，组织评分接近正     

骨髓基质细胞修复兔关节软骨的实验研究

目的　研究骨髓基质细胞修复兔关节软骨的可行性。方法　取自体骨髓基质细胞体外培养扩增 ,聚乳酸吸附骨髓基质细胞植入兔膝关节软骨负重 (内髁 )和非负重区 (外髁 )缺损内 ,观察 4、 8、 12周后软骨缺损的修复情况 ,并对组织切片评分。结果　 8、 12周后 ,骨髓基质细胞在负重区缺损内可以形成透明软骨 ,组织评分接近正常软骨优于对照 ,非负重区内没有形成透明软骨。结论　骨髓基质细胞可以修复关节软骨缺损 ,摩擦和压应力是成软骨的重要条件。