软肝化疒徵丸对肝星状细胞活化的影响

观察软肝化疒徵丸干预肝纤维化的主要作用机制.分离培养大鼠肝星状细胞(HSC),以软肝化疒徵丸灌胃正常大鼠,制备药物血清,温育培养细胞.JH3,D,Z-TdR掺入法测定细胞增殖,ELISA法测定细胞上清Ⅰ型胶原含量, RT-PCR法观察前胶原α2(Ⅰ)mRNA的表达,同位素标记法测定细胞上清间质胶原酶的活性.结果:软肝化疒徵丸药物血清能抑制HSC的增殖与胶原蛋白的分泌,提高其间质胶原酶的活性,抑制其α2(Ⅰ)mRNA的表达.结论:软肝化疒徵丸干预肝纤维化的作用机制可能在于抑制HSC的活化.     

来氟米特对免疫性肝损伤大鼠Kupffer细胞TRAIL表达的影响

目的 观察来氟米特（Lef）对免疫性肝损伤大鼠的保护作用及对Kupffer细胞（KC）中肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及其受体表达的影响，探讨Lef防治肝损伤的作用及机制。方法 雄性SD大鼠24只，随机分为正常组、模型组和Lef组，每组8只。模型组及Lef组采用卡介苗（BCG）+脂多糖（LPS）诱导大鼠免疫性肝损伤模型，Lef组再采用lef干预，考察Lef对大鼠免疫性肝损伤的保护作用；体外分离培养KC，观察Lef对KC分泌细胞因子TRAIL及其受体TRAIL-R的影响。结果 Lef可明显改善免疫性肝损伤大鼠肝细胞损伤、肝细胞变性坏死减轻，视野内凋亡小体变少。Lef能显著降低KC分泌的TRAIL、TRAIL-R1、TRAIL-R2表达，与模型组相比明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 Lef对BCG+LPS诱导的免疫性肝损伤有保护作用，其机制可能与抑制TRAIL信号传导通路有关。     

汉防己甲素对脂多糖刺激的大鼠肝星状细胞增殖的影响

目的观察汉防己甲素对脂多糖刺激的大鼠肝星状细胞(HSC)增殖及瘦素表达的影响,并观察Ⅰ型胶原表达的变化。研究汉防己甲素抗肝纤维化过程中的作用和机制。方法用脂多糖刺激大鼠肝星状细胞后,加汉防己甲素分组培养。采用MTT法测定细胞增殖,ELISA法检测其上清液瘦素和Ⅰ型胶原水平。结果脂多糖可刺激HSC增殖,汉防己甲素抑制脂多糖刺激的HSC增殖,并抑制瘦素和Ⅰ型胶原的表达。结论汉防己甲素可能通过抑制HSC增殖和抑制瘦素的分泌发挥抗纤维化作用。     

益气活血方药理血清对大鼠贮脂细胞增殖作用研究

研究益气活血方药理血清对大鼠贮脂细胞增殖作用机制。通过制备 3周、5周、7周的肝纤维化模型大鼠血清、正常大鼠血清和益气活血复方药物血清 ,培养肝星形细胞HSC(Hepaticstellatecells)和肝Bel74 0 2瘤株 ,采用MTT法观察和分析HSC的增殖作用。结果表明 :①益气活血方剂血清能抑制 5周、7周模型血清培养的继代HSC的增殖 ,P <0 .0 5。②益气活血方剂血清可促进 3周模型血清培养的继代HSC和模型血清培养的原代HSC的增殖 ,P <0 .0 5。③益气活血方剂血清和3周模型血清共同作用促进培养的Bel74 0 2的增殖 ,P <0 .0 5。提示益气活血方剂能够对HSC和Bel74 0 2细胞的增殖产生影响。HSC的生活状态 ,即HSC发育时相是决定益气活血方剂具有抑制或促进增殖作用的关键事件     

大黄蛰虫丸对大鼠肝星状细胞活化增殖的影响

 【目的】 观察大黄蛰虫丸对经旁分泌和自分泌途径激活大鼠肝星状细胞活化增殖情况的影响&#65377;【方法】 采用Nycodenz 分离液非连续密度梯度离心法同步分离急性CCl4 损伤模型大鼠和正常大鼠肝的枯否细胞(KC)和星状细胞(HSC)&#65377;在制备正常鼠血清和DHZCW药物血清的基础上,将它们分别加入KC和HSC培养板内作用后制备成正常鼠KC条件培养液(NKCCM)&#65380;损伤鼠KC条件培养液(KCCM)以及正常鼠HSC条件培养液(HSCCM)&#65377;将上述条件培养液分别干预HSC 24 h&#65380;48 h和72 h,然后采用MTT法和3H-TdR掺入法分别检测比较各组HSC细胞活化增殖情况&#65377; 【结果】 损伤鼠不含药组和正常KC对照组比较,HSC活化增殖情况显著性增高(P < 0.01),损伤鼠含药组HSC活化增殖则显著降低(P < 0.01,P < 0.05),且其抑制效应随着含药血清浓度的升高逐渐增强;而正常鼠HSC不含药组和正常鼠HSC含药组各组间比较均无显著性差异(均P > 0.05)&#65377; 【结论】 DHZCW对经旁分泌途径激活大鼠HSC活化增殖有明显的抑制作用,且作用效应与血清药物浓度间存在剂量依赖关系,但对经自分泌途径激活大鼠HSC活化增殖未见明显抑制作用&#65377;     

苦参素对肝星状细胞增殖及结缔组织生长因子表达的影响

目的 观察苦参素对肝星状细胞(HSC)增殖及结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响,探讨苦参素抗肝纤维化的作用机制.方法 利用胶原酶/链蛋白酶灌注梯密度离心分离大鼠HSC,用噻唑蓝(MTT)比色法观察苦参素对HSC增殖的影响,利用qRT PCR观察对CTGF表达的影响.结果 体外实验表明苦参素可以呈剂量依赖关系抑制HSC增殖,并抑制其CTGF的表达.结论 苦参素可能通过抑制HSC增殖及CTGF的表达介导其抗肝纤维化作用机制.     

大鼠肝星状细胞和枯否细胞的分离与培养方法

目的建立一种可以同时分离大鼠肝星状细胞(HSC)和枯否细胞(KC)的方法。方法选用SD大鼠,经胶原酶和蛋白酶灌注肝脏后,用18%Nycodenz密度梯度离心,分离大鼠HSC和KC,HSC处在界面,KC处在界面下。常规台盼蓝染色行细胞活力鉴定;荧光显微镜下观察自发荧光确定HSC的纯度;KC免疫细胞化学检测。结果成功分离大鼠肝星状细胞和枯否细胞,HSC得率为2×107/肝,KC得率为(3~6)×106/肝,活性>90%,纯度>90%。结论该方法建立的HSC和KC同时分离培养的方法,简单、易行、可靠,细胞纯度高,同时获得的细胞可保持良好的生物学性状。     

大黄蛰虫丸对大鼠肝星状细胞活化增殖的影响

【目的】观察大黄蛰虫丸对经旁分泌和自分泌途径激活大鼠肝星状细胞活化增殖情况的影响。【方法】采用Nycodenz分离液非连续密度梯度离心法同步分离急性CCl4损伤模型大鼠和正常大鼠肝的枯否细胞（KC）和星状细胞（HSC）。在制备正常鼠血清和DHZCW药物血清的基础上,将它们分别加入KC和HSC培养板内作用后制备成正常鼠KC条件培养液（NKCCM）、损伤鼠KC条件培养液（KCCM）以及正常鼠HSC条件培养液（HSCCM）。将上述条件培养液分别干预HSC24h、48h和72h,然后采用MTT法和3H—TdR掺入法分别检测比较各组HSC细胞活化增殖情况。【结果】损伤鼠不含药组和正常KC对照组比较,HSC活化增殖情况显著性增高（P〈0．01）,损伤鼠含药组HSC活化增殖则显著降低（P〈0．01,P〈0．05）,且其抑制效应随着含药血清浓度的升高逐渐增强;而正常鼠HSC不含药组和正常鼠HSC含药组各组间比较均无显著性差异（均P〉0．05）。【结论】DHZCW对经旁分泌途径激活大鼠HSC活化增殖有明显的抑制作用,且作用效应与血清药物浓度间存在剂量依赖关系,但对经自分泌途径激活大鼠HSC活化增殖未见明显抑制作用。     

扶正化瘀方对大鼠肝星状细胞旁分泌与自分泌活化途径的干预

为研究扶正化瘀方对肝星状细胞（HSC）旁分泌与自分泌活化途径的干预，用含药（由桃仁、丹参、虫草菌丝等组成的319方）血清分别添加于大鼠损伤肝库普弗细胞（IKC）与传代HSC（MFBC）中培养，制备含药血清作用过的KC条件培养液（IKCM）与MFBC条件培养液（MCM）；并以添加正常血清制备的条件培养液为对照，温育大鼠原代HSC。通过MTT法观察有HSC增殖与ELISA法观察对HSC分泌Ⅰ型胶原的影响。结果显示，IKCM与MCM可明显促进HSC的增殖与Ⅰ型胶原的分泌；扶正化瘀方则明显抑制了这一作用。提示扶正化瘀方对HSC旁分泌与自分泌活化途径有明显的抑制作用。     

木黄酮对培养肝星状细胞增殖及脂质过氧化的影响

目的 以培养的大鼠肝星状细胞(HSC)为模型,测定植物雌激素木黄酮对HSC增殖及培养液中脂质过氧化产物的影响.以明确木黄酮抑制肝纤维化形成的作用.方法 采用培养的SD大鼠肝星状细胞(HSC-T6)为模型,培养后加入H2O3诱导氧化应激,分为3组,用不同浓度的木黄酮温育48 h,收集细胞培养基的上清液,每个浓度设6个重复组,用MTT法检测HSC增殖;收集细胞培养基上清液,采用试剂盒方法测定脂质过氧化产物超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱苷肽(GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX).结果 木黄酮各剂量组不同程度降低HSC的增殖.呈剂量-效应关系.给予木黄酮后,MDA和GSH水平明显降低,SOD和GSH-PX活力明显升高.也呈剂量-效应关系.结论 植物雌激素木黄酮具有抑制肝纤维化形成的作用,其作用机制可能与抑制HSC的增殖及抗HSC氧化应激、抗脂质过氧化作用有关.     

分离、鉴定与培养大鼠肝细胞、肝星状细胞和Kupffer细胞

目的：建立稳定的同时分离原代大鼠肝细胞（HC）、肝星状细胞（HSC）和Kupffer细胞（KC）的方法,并初步评估其在体外培养的特征。方法：通过胶原酶原位灌注获得肝脏单细胞悬液,随后行等密度离心结合选择性贴壁纯化肝脏原代细胞,细胞的产量和活力经自动细胞计数仪计算出,纯度经免疫荧光、特殊染色及吞噬等实验进行鉴定。结果：大鼠原代HC产量为（21.0±8.2）×106/g肝组织,活力为92.1%±2.1%,纯度为96.5%±2.2%;原代HSC产量为（2.5±0.8）×106/g肝组织,活力为90.1%±3.8%,纯度为93.1%±1.5%;原代KC产量为（4.1±1.2）×106/g肝组织,活力为96.2%±2.7%,纯度为95.1%±1.4%。分离的HC、HSC和KC适合体外长期培养。HSC在体外培养过程中失去维生素A,逐渐向成纤维细胞表型转变。KC在体外可增殖,至14 d时仍表达CD68,具有较强的吞噬能力。结论：成功建立同时分离和培养大鼠HC、HSC和KC的方法,为进一步研究肝脏病理生理提供细胞基础。     

白细胞介素10抑制枯否细胞诱导的肝星状细胞激活的研究

目的　研究白细胞介素 10 (IL 10 )对与枯否氏细胞 (KC)共培养的肝星状细胞 (HSC)激活的影响 ,并初步探讨其作用机制。方法　采用肝脏离体胶原酶灌注消化 ,及密度梯度离心的方法来分离培养HSC和KC ;将原代培养 2d的HSC和KC分为HSC单独培养、KC单独培养和HSC与KC共培养 3大组 ,分别加 2ng/ml和 2 0ng/ml的IL 10处理。 2d后 ,分别采用3 H 胸腺嘧啶脱氧核苷 (3 H TdR)掺入法检测HSC的增殖 ,Western印染法检测HSC中α 平滑肌肌动蛋白 (α SMA)的表达和酶联免疫吸附分析 (ELISA)法检测培养上清中肿瘤坏死因子 α(TNF α)的含量。结果　IL 10对单独培养的HSC的增殖 (P >0 .0 5 )和α SMA表达 (P >0 .0 5 )无明显影响。共培养组HSC的增殖和α SMA表达分别增加了 2 .4倍和 6倍 ;2ng/ml和 2 0ng/ml的IL 10分别使共培养组HSC的增殖降低了 2 3%和 33% ,α SMA表达降低了 35 %和 4 9% ,均呈浓度依赖性 ,和HSC单独培养组相比 ,差异有显著意义 (P <0 .0 5或P <0 .0 0 1)。HSC单独培养组未检测出TNF α ;共培养组的TNF α量比KC单独培养组增加了 74 %(P <0 .0 1) ;2ng/ml和 2 0ng/ml的IL 10分别使共培养组的TNF α量降低了 2 7% (P <0 0 1)和 36 % (P<0 0 1) ,使KC单独培养组的TNF α量降低了 2 9% (P <0 0 5 )和 4     

肠上皮内淋巴细胞促L929细胞增殖活性的研究

目的:了解应激性溃疡模型中肠上皮内淋巴细胞(iIEL)培养上清促L929细胞增殖活性的变化.方法:采用水浸限制刺激法制备小鼠应激性溃疡模型.分别提取iIEL和脾T淋巴细胞,在含ConA的培养液中培养.采用MTT法检测iIEL和脾T淋巴细胞培养上清的促L929细胞增殖活性.结果:正常鼠iIEL培养上清促L929细胞增殖活性显著高于脾T细胞培养上清(P＜0.05).应激性溃疡发生后,iIEL培养上清促L929细胞增殖活性显著下降,于第4天降至最低(P＜0.05),1周后恢复正常.结论:iIEL培养上清中可能含有高水平的促进L929细胞增殖的因子,这种因子的活性在应激性溃疡中可能发生变化.     

硫化氢对大鼠肝星形细胞增殖和氧应激的影响

目的探讨H2S对大鼠肝星形细胞（HSC）增殖和氧应激的影响。方法用铁超载的方法复制HSC增殖模型，通过绘制生长曲线以及CCK-8细胞计数法检测不同浓度的H2S对500μmol／L次氮基三乙酸铁（FeNTA）作用下的HSC增殖的影响。通过不同浓度的H2S作用于500μmol／LFeNTA培养的HSC，检测6h、12h、24h细胞上清液和裂解液中H2S、SOD活力、MDA含量，观察H2S对HSC氧应激反应的影响。结果同对照组比较，一定浓度的H2S对HSC增殖有抑制作用。在FeNTA诱导的氧应激反应中，一定浓度范围的H2S可有效提高SOD的活性和降低MDA含量。结论H2S对HSC增殖有较强抑制作用，对FeNTA诱导的氧应激具有保护作用。     

牛磺酸在大鼠肝星状细胞中的抗氧化作用

目的：探讨牛磺酸在体外培养的大鼠肝星状细胞（HSC）的抗氧化作用。 方法：将新鲜分离的大鼠HSC分别在普通培养基、含25及50 mmol•L^-1牛磺酸的培养基中孵育培养,检测三种培养基上清中脂质过氧化物(LPO)、羟脯氨酸的表达水平及三种培养基培养的HSC表达转化生长因子β1（TGF-β1）的水平。利用BrdU法检测牛磺酸对HSC增殖的影响。结果：HSC活化后,各培养液上清中LPO浓度均较活化前明显上升（P<0.05）;在含25及50 mmol•L^-1牛磺酸培养基中培养的HSC与普通培养基培养的HSC相比, LPO及羟脯氨酸的分泌水平明显下降（P<0.05）;与普通培养基相比,两组牛磺酸培养基培养的HSC表达TGF-β1明显减少（P<0.05）; 50 mmol•L^-1牛磺酸可以明显抑制HSC的增殖（P<0.05）。 结论：牛磺酸在体外实验中可以有效抑制大鼠肝星状细胞的LPO及羟脯氨酸的合成,并显示出显著的抑制HSC增殖的作用,提示牛磺酸可能在抗肝纤维化治疗中作为抗氧化剂具有重要的治疗价值。     

来氟米特对肝星状细胞增殖和胶原合成的影响

目的:研究来氟米特活性代谢物A771726对肝星状细胞(HSC)增殖和胶原合成的影响.方法:用链蛋白酶和胶原酶原位肝灌注、Nycodenz密度离心法分离大鼠HSC和Kupffer细胞,制备Kupffer培养上清液(KCCM),并以不同浓度、不同培养时间的CCl4损伤的KCCM作为刺激因素观察了A771726对HSC增殖(3H-TdR掺入法)和胶原合成(3H-Pro掺入法)的影响.ELISA法测定KCCM内TGF-β、TNF-α和IL-1含量.结果:HSC和Kupffer细胞得到较好的分离.CCl4损伤的KCCM显著增加HSC增殖和胶原合成,并且稀释度为1:2的KCCM在培养7 d时,对HSC增殖和胶原合成的刺激作用明显.A771726(0.001～10 μmol/L)对CCl4损伤的KCCM刺激HSC增殖和胶原合成有不同程度的抑制作用,并且A771726(0.001～10 μmol/L)明显抑制CCl4损伤KCCM内升高的TGF-β、TNF-α和IL-1水平.结论:CCl4损伤的KCCM可明显刺激HSC增殖和胶原合成,而A771726对此有明显的抑制作用,并且与其抑制致HSC激活的因子如TGF-β、TNF-α和IL-1分泌有关.     

人皮肤角质形成细胞的制备及体外培养

目的 探讨人皮肤角质形成细胞制备及体外培养的方法.方法 皮肤标本用胰酶、胰酶＋分离酶（dispase酶）2种方法消化,并分别以DMEM培养基、RPMI 1640培养基、限制性角质形成细胞无血清培养基（KC-FSM培养基）培养,MTT法通过比色分析测定培养48 h、72 h后细胞的光密度值（D值）,以判断不同培养基对角质形成细胞增殖的影响.结果 胰酶＋分离酶消化可获得较纯的原代角质形成细胞,细胞在限制性KC-FSM培养基中生长良好,培养48 h、72 h后测得的D值显著高于DMEM培养基和RPMI 1640培养基（P＜0.05）.结论 胰酶＋分离酶消化、限制性KC-FSM培养基体外培养是制备和培养人皮肤角质形成细胞的好方法.     

肝星形细胞表达转化生长因子α与成纤维细胞生长因子

目的 研究肝星形细胞（ＨＳＣ）转化生长因子α（ＦＧＦα）与成纤维细胞生长因子（ａＦＧＦ）的表达。方法 分别从正常与ＣＣＬ４肝纤维化大鼠肝脏分离ＨＳＣ,提取ＲＮＡ,用ＲＴ－ＰＣＲ测定ＴＧＦα和ａＦＧＦｍＲＮＡ。结果 正常ＨＳＣ表达ＴＧＦα和ａＦＧＦ,肝纤维化时ＴＧＦα与ａＦＧＦｍＲＮＡ水平均显著升高（Ｐ〈０．０５）。结论 ＨＳＣ自分泌ＴＧＦα和ａＦＧＦ,对肝纤维化具有重要促进作用。     

芍药苷对人骨髓基质细胞HFCL蛋白质表达的作用

目的检测芍药苷对人骨髓成纤维样基质细胞系HFCL增殖及蛋白质表达的影响,探讨芍药苷补血作用的分子机制。方法采用流式细胞术和蛋白质组学方法测定芍药苷对HFCL细胞周期及蛋白质表达的影响。结果芍药苷能促进HFCL由G0/G1期进入S期,提高增殖指数,使HFCL的9种蛋白质表达上调,5种下调。上调的蛋白质有Ras相关核蛋白、核纤层蛋白A/C、异柠檬酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、ATP合酶、核蛋白体蛋白质P2和CCT;下调的蛋白质有人类cc趋化因子和Bax。结论芍药苷能促进HFCL增殖,作用于HFCL多个靶点,促进细胞结构蛋白质的合成和蛋白质分子伴侣的表达,促进HFCL的能量代谢,抑制HFCL凋亡,间接发挥补血作用。     

气血并治方有效组分配伍对平滑肌细胞增殖和血小板源生长因子及其受体基因表达的影响

目的:观察氧化低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞损伤条件培养基及气血并治方有效组分芍药苷和总黄酮配伍(重量比为1∶2)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖相关基因表达的影响。方法:将VSMCs正常培养液、氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导血管内皮细胞损伤条件培养基、辛伐他汀加ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤条件培养基、芍药苷和总黄酮配伍(高、中、低剂量)加ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤条件培养基等分别作用于VSMCs,采用MTT染色法检测VSMCs生长活性,逆转录聚合酶链反应法测定血小板源生长因子BB(platelet-derived growth factor BB,PDGF-BB)和血小板源生长因子受体α(platelet derived growth factor receptor-α,PDGFR-α)基因的表达。结果:ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤条件培养基作用于VSMCs后,与正常培养VSMCs比较,细胞生长活性明显增加(P<0.01),PDGF-BB和PDGFR-αmRNA表达增强。芍药苷和总黄酮配伍加ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤条件培养基作用于VSMCs后,与ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤条件培养基比较,细胞生长活性明显降低(P<0.01),PDGF-BB和PDGFR-αmRNA表达减弱。结论:气血并治方防治动脉粥样硬化的作用可能与方中有效组分芍药苷和总黄酮配伍抑制ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤条件培养基引起的VSMCs增殖相关基因的表达有关。