黏蛋白质手性合成多肽疫苗对BALB/c小鼠CTL的诱导作用

目的：研究由具有局部手性特征的合成多肽D-MUC1和小鼠血清白蛋白(mouse serum albumin,MSA)构成的多肽疫苗对小鼠MUCl特异性CTL的诱导作用．方法：用固相合成法合成含有D-Ser的多肽D-MUC1,纯化后与载体蛋白MSA偶联,分别以细胞因子重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和胸腺肽(TP)为佐剂,免疫BALB／c小鼠,测定淋巴细胞增殖活性、MUCl特异性CTL杀伤活性．结果：合成肽经HPLC纯化后,质谱分析证明目的肽的分子量与理论值相符;D-MUCl多肽疫苗对BALB／c小鼠淋巴细胞增殖有明显的促进作用;D-MUCl多肽疫苗诱导出的特异性CTL杀伤MUCl阳性肿瘤细胞GZ．A5．3H．4．结论：研究结果表明D．MUCl合成肽疫苗可以在小鼠体内诱导出MUC1特异性CTL,为具有局部手性特征的MUCl合成肽疫苗进行肿瘤免疫治疗提供了实验依据。     

类风湿关节炎患者外周血T细胞抑制性多肽的研究

目的探讨HLADRB1结合性流感病毒血凝素(HA)308317变构肽对类风湿关节炎(RA)患者外周血T细胞激活的影响。方法选取27例HLADRB1阳性的RA患者,密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。采用固相法合成HA308317变构肽,并检测RA患者外周血T细胞对这些多肽的反应性;及多肽对白细胞介素(IL)2、γ干扰素分泌及CD69表达的影响。同时进一步观察HA308317变构肽对CII263272或HA308317多肽介导的T细胞激活的抑制作用。结果变构肽刺激T细胞增殖的阳性率分别为7.4%(APL1)、3.7%(APL2)和3.7%(APL3),明显低于CII263272和HA308317原型肰(62.2%和52.9%),3条变构肽的刺激指数也明显低于原型肽(均P<0.01)。并且,其诱导IL2、γ干扰素分泌的水平及CD69的表达亦下降(P<0.05)。与单独加入CII263272或HA308317原型肽的对照组相比,加入HA308317变构肽的T细胞增殖的刺激指数明显下降(P<0.05)。结论替换HA308317多肽中T细胞受体的接触残基产生了弱或非T细胞刺激肽,它们可能有效地抑制RA的T细胞免疫反应。     

T细胞疫苗对HCV的清除作用

1 材料和方法 1.1 材料 雌性BALB/c小鼠(H-2d) 5～6 wk龄; P815细胞(H-2d,仅表达MHC Ⅰ类抗原,不表达MHCⅡ类抗原);SP2/0(H-2d)细胞;表达丙型肝炎病毒(HCV)结构蛋白的质粒载体pcDNA-C、pcDNA-CE1、pcDNA-CE1E2[1];腺病毒表达载体pAd.HCV-C、pAd.HCV-CE1、pAd.HCV-CE1E2[2];Na51CrO4;抗CD8 单克隆抗体;小鼠抗HCV C单克隆抗体;重组鼠源性IL-2;2-巯基乙醇等.     

负载自体肿瘤抗原的成熟DC体外联合小剂量IL-2及IL-12增强CTL抗胃癌活性研究

目的 探讨在体外条件下负载自体胃癌细胞裂解物的成熟DC(matured dendritic cells loaded with autologous tumor lysates,TL-mDC)联合小剂量白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)及白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)增...     

多肽SJMHE1调控Th17/Treg细胞平衡以及对哮喘小鼠治疗作用的研究

目的 探索日本血吸虫热激蛋白来源多肽SJMHE1对辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)平衡的调控以及在小鼠过敏性哮喘治疗中的作用.方法 免疫磁珠法分选正常小鼠脾脏CD4+T细胞,分别加入0.5、1和1.5μg/mL的SJMHE1进行体外培养.流式细胞术检测不同SJMHE1浓度作用下Th17细胞和Tre...     

Th1和Th2细胞对记忆性CTL抗肿瘤的增强作用

目的：研究CD4 辅助型T细胞在记忆性CTL介导的抗肿瘤免疫中的作用。方法：以OT-1细胞转输RAG基因敲除小鼠产生记忆性CTL，以OVA特异性T细胞表位多肽联合不同佐剂事先免疫C57BL/6小鼠产生不同类型的T细胞，将记忆性CTL传输上述C57BL/6小鼠并接种表达OVA的肿瘤细胞EG7。结果：遇肿瘤细胞攻击时，单纯OVA特异性Th多肽免疫小鼠虽可产生较多效应性CTL，但不能完全抵御肿瘤攻击；记忆性CTL介导的抗肿瘤免疫效应需要Th1和Th2细胞的辅助；Th12和Th2细胞间的相互作用有利于机体产生较多的效应性CTL以发挥强大的抗肿瘤效应。结论：记忆性CTL介导的抗肿瘤效应中，Th1和Th2的联合作用有较单纯Th1或Th2细胞更为重要的辅助作用，应是进一步研究的重点。     

ALT与HCV核心抗原及HCV—RNA相关性研究

目的研究ALT与HCV核心抗原、HCV—RNA间关系。方法对81例HCV—RNA阳性标本检测HCV核心抗原和ALT水平。结果81例HCV—RNA阳性标本检出HCV核心抗原阳性32例,灰区26例,ALT水平超过临床参考值56例,ALT检测水平与HCV核心抗原阳性程度呈正相关性。结论HCV—cAg仅与HCV—RNA复制密切相关,与复制水平无关。HCV核心抗原可联合HCV抗体检测提高血液标本HCV感染检出率,结合ALT可以评测感染状态。     

鼻咽癌可溶性抗原负载DC诱导CTL杀伤鼻咽癌细胞的体外研究

目的：用负载鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原的树突状细胞(dendritic cells，DC)诱导自身淋巴细胞，使之活化为鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)特异性细胞毒性T细胞(cvtotoxic T lymphocyte，CTL)，观察其对鼻咽癌细胞的体外特异性杀伤作用。方法：用GM-CSF、IL-4和TNF-α体外诱导健康成人外周血单核细胞，使其分化为高纯度DC。用鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原负载成熟DC，流式细胞仪检测负载前后DC的表型特征，MLR检测负载前后DC对同种异体T淋巴细胞增殖的能力。在白细胞介素-2(IL-2)的作用下，用负载鼻咽癌细胞可溶性抗原的DC诱导自身淋巴细胞成NPC特异性CTL，通过杀伤活性实验观察它对鼻咽癌细胞(CNE)的特异性杀伤效应。结果：人外周血单核细胞体外在GM-CSF、IL-4、TNF-α诱导下获得具典型表型特征的成熟DC。负载CNE可溶性抗原对成熟DC表面共刺激分子及特异性表面标志无影响，仍有较强的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力，所诱导的CTL对鼻咽癌细胞(CNE)有明显的特异性杀伤作用。结论：负载鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原的DC所诱导的CTL在体外对鼻咽癌细胞有特异性杀伤作用，对NPC的临床治疗有潜在的应用价值。     

树突状细胞对肿瘤特异性CTL体外激发、扩增及功能的作用研究

目的:研究凋亡肿瘤细胞负载的DCs联合细胞因子对T细胞体外激发、扩增及功能的诱导作用。方法:人B淋巴瘤细胞株Raji经顺铂(DDP)诱导凋亡，体外共育法负载DCS，DCs和T细胞体外共培养观察DC5对T细胞的效应，采用免疫荧光标记和流式细胞仪分析T细胞表型：ELISA法检测细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-10的含量；溶血实验检测细胞毒性T细胞(CTL)产生穿孔素的能力；体外肿瘤杀伤实验分析CTL的特异性肿瘤杀伤作用。结果：凋亡肿瘤细胞负载联合CD40激发的DCs能有效地激发自体T细胞的体外扩增并诱导具有较特异杀伤肿瘤细胞作用的CTL。结论：凋亡肿瘤细胞负载的DCS在CD40信号的作用下对自体T细胞具有较强的激发和扩增效应．所获得的CTL对肿瘤细胞具有较特异的杀伤作用。     

丙型肝炎病毒核心抗原的检测及其临床意义

目的 探讨HCV 核心抗原在HCV 感染诊断和治疗中的作用.方法 丙肝核心总抗原检测采用酶联免疫法;丙型肝炎抗体检测采用第三代酶联免疫法.所有血清标本均进行HCV-RNA 和肝功能检测.丙肝核酸定量采用PCR- 荧光探针法;肝功能检测采用紫外连读检测法.结果 90 例中,HCV-cAg 检测阳性率为42.22%(38/90).HCV-cAg 阳性组HCV-RNA 阳性率100%(38/38),显著高于HCV-cAg 阴性组的71.15%(37/52).阳性组丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)异常率63.16%(24/38),显著高于HCV-cAg 阴性组的40.38%(21/52),两组间比较(P<0.05).HCV-cAg 阴性组中59.62% (31/52)的患者ALT 在正常范围内(ALT<40U/L),显著高于HCV-cAg 阳性组的36.84%(14/38) ;而HCV-cAg 阳性组中36.84%(14/38)ALT 值均>100U/L,明显高于HCV-cAg 阴性组的9.62%(5/52).两组间比较(P<0.05).丙肝核心抗原HCV-cAg 和HCVRNA有很好的正相关性,HCV-cAg 与ALT 水平也有一定相关性,可以反映肝功损害程度.结论 丙肝核心抗原HCV-cAg是慢性丙肝感染良好的监测指标.     

丙型肝炎病毒NS3区C末端HLA-11限制性CTL表位的作用

目的 研究丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）非结构３区（ＮＳ３）Ｃ末端ＨＬＡ－１１限制的细胞Ｔ细胞（ＣＴＬ）表位在ＨＣＶ感染中的作用。方法 血清学方法检测３例患的ＨＬＡ分型,他们均存在ＨＬＡ－Ａ１１表型,以ＨＬＡ－１１结合基序为依据,预测了ＨＬＡ－１１限制的ＣＴＬ表位。２例慢性患５ａ内３个时间点和３ａ内２个时间点及转阴患的血清样本,用反转录ＰＣＲ扩增出ＨＣＶ基因片段,     

用T7噬菌体展示技术筛选HCV核心蛋白的相互作用蛋白

目的 用T7噬菌体筛选系统筛选HCV核心蛋白的相互作用蛋白.方法 应用T7噬菌体展示技术,以通过原核表达的方式得到HCV的核心蛋白作为靶分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行筛选,对筛选到的克隆进行DNA序列分析及同源性搜索.结果 经鉴定得到1个阳性克隆,确定了能与HCV核心蛋白相互作用的蛋白为:Smad interacting-protein 1(SIP1).结论 T7噬菌体展示筛选系统是筛选相互作用蛋白的一种简单、快速和有效的手段,筛选到的相互作用蛋白为进一步探讨核心蛋白的致病、致癌机制提供重要依据.     

Frequencies and characterization of HBV-specific cytotoxic T lymphocytes in self-limited and chronic hepatitis B viral infection in China

Hepatitis B virus （HBV）-specific cytotoxic T lymphocytes （CTLs） are believed to play a major role in viral clearance and disease pathogenesis during HBV infection. To clarify the differences in host immune responses between self-limited and chronic HBV infections, we constructed three HLA-A＊0201/HBV tetramers with immunodominant epitopes of core18-27, polymerase 575-583 and envelope 335-343, and analyzed the HBV-specific CTLs in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） from patients infected with HBV. The frequencies and expansion ability of HBV-specific CD8＋T cells in most self-limited HBV infected individuals were higher than those in chronic HBV-infected patients. HBV-specific CD8＋T cells could be induced by in vitro peptide stimulation from chronic patients with a low level of serum HBV-DNA but not from those with a high level of serum HBV-DNA. In chronic infection, no significant correlation was found either between the frequencies of HBV-specific CD8^＋ T cells and the viral load, or between the frequencies and the levels of alanine transaminase. Our results suggested that the frequencies of HBV-specific CTLs are not the main determinant of immune-mediated protection in chronic HBV infection and immunotherapeutic approaches should be aimed at not only boosting a HBV-specific CD8^＋T response but also improving its function.     

不同缺失突变的丙型肝炎病毒核心蛋白基因在大肠杆菌中的表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)全长及3种不同缺失突变的核心蛋白基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达. 方法:用PCR方法扩增基因型为1b型的HCV核心蛋白的全长及3种不同缺失突变的基因片段,对应氨基酸分别为C573:1-191aa,C510:1-59aa 81-191aa,C507:1-169aa,C444:1-59aa 81-169aa. 将其克隆到高效表达载体pRSET-A中构成重组质粒(pRSET-A-C573,pRSET-A-C510,pRSET-A-C507,pRSET-A-C444),转化大肠杆菌BL-21(DE3)pLysS. IPTG诱导表达6×His融合蛋白,表达产物经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定. 结果:经酶切鉴定及测序证实全长及3种不同缺失突变的核心蛋白基因的原核表达载体构建正确. 经SDS-PAGE及Western blot显示在Mr约为21×103, 19×103, 19×103, 16.5×103处出现融合表达条带. 融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的20%. 结论:全长及3种不同缺失突变的丙型肝炎病毒核心蛋白基因均在大肠杆菌中得到有效表达.     

噬菌体呈现疫苗诱导乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T细胞反应

目的 研究噬菌体呈现颗粒作为亚单位疫苗是否能在体诱导乙型肝炎特异性细胞毒性Ｔ细胞反应。方法 构建呈现ＭＨＣＩ类分子（Ｈ－２＾ｄ）限制性表位ＨＢｓ２８－２９的噬菌体颗粒,小剂量、无佐剂接种ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２＾ｄ）小鼠。结果 重组噬菌体呈现颗粒在体诱导Ｈ－２＾ｄ限制的ＨＢｓ２８－２９特异性细胞毒性Ｔ细胞反应。结论 丝状噬菌体疫苗有效诱导细胞毒性Ｔ细胞反应,能用于发展抗病毒疫苗。     

Humoral immune response to HCV core DNA vaccine in mice

DNAvaccine,alsocallednucleicacidvaccine,isarecombinanteukatyoticexpressionplasmidencodingcertainantigenofpathogen.DNAvaccinecanexpressantigenandinducecellularandhumoralimmuneresponsesaftervaccinationbyintramuscularinjectionorplasmid--coatedmicroparticlebombardment.Itshightemperaturestability,lowexpenseofmassproductionandtheabilitytoinducestrongimmuneresponsesevenfortheuseintherapyhavemadeDNAvaccineanexcitingwayfornewvaccinedevelopment['J.InordertofurnishevidenceforHCVDNAvaccinesuitablefo…     

应用计算机预测T细胞抗原表位研究HCV免疫反应

目的：编写预测Ｔ细胞怕表位的软件ＧＵＯＴＩＦ,对１例丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）健康带者进行人类白细胞怕（ＨＬＡ）分型及ＨＣＶＮＳ３区部分区段的一级结构测定,用ＧＵＯＴＩＦ预测其Ｔ细胞怕表位,。为合成肽研究针对ＨＣＶ的免疫反应提供指导。方法：在Ｉｎｔｅｒｎｅｔ上搜集各型主要组织相容性复合体（ＭＨＣ）分子的ｍｏｔｉｆ资料,以之为基础用ＶｉｓｕａｌＣ＋＋语言编写ＧＵＯＴＩＦ软件,用已报道的ＨＣＶＴ细胞怕表位     

HCV核心蛋白在酵母双杂交系统中的表达及自激活作用检测

目的: 检测用含丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的cDNA片段构建的酵母双杂交诱饵载体的表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用. 方法: PCR扩增含HCV核心蛋白不同大小的cDNA片段,分别克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中. 将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用. 结果: 成功获得含HCV核心蛋白的cDNA片段,HCV核心蛋白对酵母菌AH109无毒性,且对报告基因无激活作用. 结论: 利用酵母双杂交Gal4系统3研究与HCV核心蛋白相互作用的蛋白,证实了HCV核心蛋白无自激活功能.     

丙型肝炎病毒核心蛋白对HePG2细胞增殖和细胞周期的影响

目的 观察核心蛋白对细胞增殖和细胞周期调控的影响。方法 观察表达HCV核心蛋白的细胞株HePG2-C和作为对照的细胞株HePG2-CMV的细胞形态;绘制细胞生长曲线;检测细胞周期;用流式细胞仪、免疫组化染色检测PCNA,P16,P27,P53;半定量RT－PCR检测P16,P27,P53mRNA。结果 转染重组质粒PBK－HVCC的HePG2-C细胞与转染空载体PBK－CMV的HePG2-CMV细胞相比细胞形态未见明显变化。生长曲线显示HePG2 细胞在转染PBK-HCVC和空载体PBK－CMV后,生长速度无明显变化。检测转染空载体的细胞HePG2-CMV 81.3%进入G0／G1期,7．7％进入S期;而转染PBK－HCV C的细胞HePG2-C73%进入G0／G1期,13．7％进入S期。在进一步分子机制的探讨中发现HePG2-C细胞PCNA、P53表达显著增加,P16、P27表达显著降低。 同样的变化也发生在转录水平。结论 HCV核心蛋白可能通过调节某些基因的转录与表达,增加细胞DNA合成,扰乱细胞周期,进而参与致癌过程。