人源性抗地高辛单链抗体（scFv）及diabody的获取

目的：从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗地高辛单链抗体（scFv），并构建双价抗体（diabody）．方法：以固相化的Dig对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选，4轮后挑取集落，用ELISA法鉴定其特异性，并对抗Dig阳性抗体基因进行DNA指纹分析及测序分析，选取活性好的抗体基因进行改造，构建diabody．结果：在抗体库的筛选过程中可见到明显的富集现象，获得4株可与Dig特异性结合的人源单链抗体，经DNA指纹分析及测序分析证明为不同抗体基因，     

从人天然抗体库中克隆IgM抗角蛋白抗体

目的：克隆制备人源性抗角蛋白IgM抗体。方法：以人表皮角蛋白为抗原,从人源性天然抗体库中筛选IgM型抗角蛋白人抗体,并用ELISA对所获抗体进行抗原结合活性和特异性等鉴定。结果：通过3轮“亲和吸附－洗脱－扩增”筛选,获得2株IgM型抗角蛋白噬菌体抗体。酶切去掉载体上的噬菌体基因Ⅲ,得到 了可溶性表达的Fab段。经过鉴定,所获抗体具有良好的抗原结合活性和特异性。结论：从人源性天然抗体库中成功筛选出2株抗角蛋白IgM抗体,为进一步研究抗角蛋白抗体的特性提供了条件。     

人源抗狂犬病毒免疫型抗体库的构建及特异性抗体筛选与鉴定

目的:利用噬菌体展示技术,构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,筛选特异性的抗狂犬病毒糖蛋白人源单链抗体(scFv)并对其进行初步鉴定。方法:从接种狂犬疫苗的志愿者外周血中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv。将纯化后的scFv克隆至噬菌体载体pComb3XSS构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,以狂犬病毒糖蛋白(RABVG)为抗原,从抗体库中筛选抗RABVG的scFv。通过phage-ELISA验证噬菌体单链抗体的结合特异性,将阳性克隆转化E.coliTOP10F′进行表达。结果:构建了人源抗狂犬病毒抗体库,抗体库的库容为3.29×109。经过5轮筛选,获得43株与RABVG特异结合的噬菌体单链抗体,其中15个A450值较高的克隆序列分析结果显示,有3个正确的单链抗体基因。单链抗体基因转化TOP10F′构建工程菌,表达纯化后的单链抗体,经ELISA检测能够与RABVG特异性结合。结论:从构建的人源免疫型抗狂犬病毒单链抗体库筛选出的能与RABVG特异性结合的scFv,为进一步制备抗RABVG的治疗性人源化抗体奠定了基础。     

从大容量人源噬菌体抗体库中筛选抗黑素瘤特异性抗体

目的：用黑素瘤（MM）细胞系筛选大容量人源噬菌体抗体库，获得能与MM细胞特异性结合的人源性单链抗体（scFv）．方法：用完整的MM细胞对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选，并通过细胞ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定，得到的阳性克隆进一步做DNA序列测定和免疫组化染色鉴定．结果：从80个随机挑选的克隆中，筛得1株抗MM细胞的抗体，该抗体对人的鳞癌细胞、角质形成细胞、黑素细胞、角蛋白、胰蛋白酶、转铁蛋白及小鼠igG等细胞或抗原的结合反应均呈阴性．免疫组化染色显示，该抗体与MM细胞系Libr的染色呈阳性，对黑素细胞和痣细胞的染色呈阴性．DNA测序结果表明，该抗体VH属于人IgG VH5亚群，VL属于人Vκ亚型．结论：通过筛选噬菌体抗体库获得到1株抗MM细胞的特异性抗体，为MM的靶向治疗研究奠定了基础．     

人源天然Fab噬菌体抗体库的构建及抗c-Met抗体的筛选?鉴定

目的:构建大容量人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗c-Met特异性抗体并进行初步鉴定.方法:采集20位健康成人的骨髓淋巴细胞.用PCR扩增人Fab片断抗体基因,插入载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab抗体库.以固相化的抗原对抗体库进行6轮筛选后,随机挑选60个克隆用Phage ELISA、BstO I酶切片断分析进行检测,阳性克隆作可溶性表达和鉴定.结果:构建的Fab噬菌体抗体库的库容为1.2×109,从中筛选到1株与c-Met特异性结合的人源抗体克隆,命名为AM2-26.DNA序列分析证明为人免疫球蛋白可变区基因,Western blot证实为人源抗c-Met Fab抗体片段,ELISA特异性鉴定阳性.结论:构建了大容量人源天然Fab抗体库,从中获得1株抗c-Met人源Fab抗体片段,有望为抗肿瘤药物的研制提供新的候选分子.     

抗HIF-1tx肺腺癌人源单链抗体的筛选和初步鉴定

目的 从单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗HIF-lα肺腺癌人源单链抗体(scFv),并进行初步鉴定.方法 先后以肺腺癌细胞A549、HIF-1α为抗原,通过"吸附-洗脱-扩增"从大容量噬菌体抗体库中筛选特异性抗体.感染大肠杆菌HB2151,实现可溶性抗体的表达,ELISA、免疫细胞化学检测抗原-抗体结合活性,SDS-PAGE和Western blot检测可溶性抗体表达和相对分子质量.结果 经筛选后,单链抗体得到富集.随机选取10个克隆,ELISA检测5个与HIF-lα抗原呈阳性反应,阳性率为50%.免疫细胞化学表明抗体与A549细胞特异性结合.SDS-PAGE、Western blot证明单链抗体成功可溶表达,且相对分子质量在30×10~3左右,ELISA显示其有较好的特异性.结论 利用单链大容量噬菌体抗体库技术成功获得特异性抗HIF-1α的肺腺癌人源单链抗体.     

抗HIF-1α肺腺癌人源单链抗体的筛选和初步鉴定

目的 从单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗HIF-lα肺腺癌人源单链抗体(scFv),并进行初步鉴定.方法 先后以肺腺癌细胞A549、HIF-1α为抗原,通过"吸附-洗脱-扩增"从大容量噬菌体抗体库中筛选特异性抗体.感染大肠杆菌HB2151,实现可溶性抗体的表达,ELISA、免疫细胞化学检测抗原-抗体结合活性,SDS-PAGE和Western blot检测可溶性抗体表达和相对分子质量.结果 经筛选后,单链抗体得到富集.随机选取10个克隆,ELISA检测5个与HIF-lα抗原呈阳性反应,阳性率为50%.免疫细胞化学表明抗体与A549细胞特异性结合.SDS-PAGE、Western blot证明单链抗体成功可溶表达,且相对分子质量在30×10~3左右,ELISA显示其有较好的特异性.结论 利用单链大容量噬菌体抗体库技术成功获得特异性抗HIF-1α的肺腺癌人源单链抗体.     

人源性抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa Fab噬菌体抗体库的筛选与鉴定

目的从已构建的人源性抗血小板膜糖蛋白（glycoprotein,GP）Ⅱb/ⅢaFab噬菌体抗体库中筛选人源性抗血小板膜GPⅡb/ⅢaFab抗体,并对特异性阳性克隆进行鉴定。方法以表达GPⅡb/Ⅲa的CHO123细胞包板,对人源性抗血小板膜GPⅡb/ⅢaFab噬菌体抗体库进行富集筛选,采用细胞ELISA法筛选特异性阳性克隆,用Western blot法鉴定表达蛋白与GPⅡb/Ⅲa结合的特异性,将阳性克隆进行扩增、测序。结果以CHO123细胞富集淘筛3轮,并用ELISA法检测到2个高亲合力的特异性识别血小板膜GPⅡb/Ⅲa的克隆,Westernblot鉴定结果显示在阳性克隆的培养上清和细菌冻融上清均有特异性条带出现。对核苷酸序列进行同源性分析,证实这两个克隆轻链基因与人免疫球蛋白κ轻链的同源性分别高达97%和98%,重链基因与人免疫球蛋白Fd段的同源性分别高达94%和93%。结论利用噬菌体抗体库技术,成功地从人源性抗血小板膜GPⅡb/ⅢaFab抗体库中筛选出抗血小板膜GPⅡb/Ⅲa的特异性阳性克隆,该克隆具有较高的特异性,其克隆基因符合抗体可变区结构特点。     

全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定

目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性?方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库?以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性?结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0 × 107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv?经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的scFv抗体?经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg?结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础?     

利用噬菌体展示技术筛选人源抗肝癌单链抗体

目的:利用噬菌体展示技术,从Griffinl Library人源噬菌体单链抗体库中筛选出人源抗肝癌单链抗体.方法:扩增Griffinl Library人源噬菌体单链抗体库后,以甲胎蛋白(AFP)为包被抗原,用免疫试管法富集筛选人源抗肝癌单链抗体,用ELISA法鉴定获得的阳性克隆,对其基因进行测序.将淘选出的阳性单链抗体...     

特异性抗SSA/Ro噬菌体抗体的制备及其基因序列分析

目的　由已构建的人源单链可变区噬菌体抗体库中制备出抗SSA/Ro单克隆抗体 ,并对这些抗体的基因序列进行分析。方法　将冻存的抗体库菌种复苏制备噬菌体抗体库。用PCR、基因序列分析及酶切的方法对其进行鉴定。以组织培养皿法对该噬菌体抗体库进行富集筛选 ,用ELISA方法对富集后次级抗体库进行鉴定。制备单克隆抗体并鉴定其特异性 ,对单克隆抗体的可变区基因序列进行测序分析。结果　所制备的噬菌体抗体库的滴度为 1 6× 10 12 cfu/ml,外源基因的插入重组率为 80 % ,插入片断为人抗体可变区基因 ,且该抗体库具有良好的多样性。富集筛选回收的噬菌体数逐渐增加 ,富集后的抗SSA/Ro噬菌体抗体次级库吸光度 (A)值为富集前的 2 8倍 ,且该次级库有良好的抗SSA/Ro特异性。经富集制备出 5个特异性抗SSA/Ro单克隆抗体 ,这些单克隆抗体重链及轻链可变区基因分别与VH1、VH3、VH4、Vκ1、Vκ2、Vκ3基因家族有高度同源性。结论　本实验室构建的scFv噬菌体抗体库可以用于特异性抗体的筛选及单克隆抗体的制备。制备出的抗SSA/Ro单克隆抗体可变区基因序列与人胚系基因比较有突变 ,为研究相关疾病的发病机理开创了新的途径     

全人源抗PSMA单链抗体的筛选及免疫活性鉴定

目的 从全人源单链噬菌体抗体库中筛选出抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)特异性单链抗体并进行免疫活性鉴定.方法 以合成的PSMA多肽为抗原,经过五轮吸附-洗脱-扩增,从单链噬菌体抗体库中筛选出特异性抗PSMA噬菌体抗体,ELISA检测其抗原结合能力,并对特异性较强的克隆提取质粒,表达可溶性抗体.Western Blott...     

Isolation of human antibodies against hepatitis E virus from phage display library by immobilized metal affinity chromatography

Objective To isolate human antibodies against hepatitis E virus from phage display library by a new method of panning phage antibody library based on immobilized metal affinity chromatography （1MAC）. Methods Phage antibody library was allowed to mix with hex-His tagged expressed HEV specific antigen, NE2, in solution for adequate binding before affinity resin for hex-His was added. The non-specific phage antibodies were removed by extensive washing and the specific bound phage antibodies could then be eluted to infect TG1 or repeat the binding process for subsequent rounds of purification. The specificity of the selected human antibodies were tested by antigen competitive ELISA, human sera blocking ELISA, scFv expression, and sequence analysis. Results His-NE2 specific recombinant phages were successfully enriched after panning procedure. Two individual phage clones, 126 and 138, showed 50% inhibition in NE2 antigen competition ELISA and obvious blocking effect by HEV positive serum in blocking ELISA. Soluble scFv of 126, 138 bound to NE2 specifically. Conclusion Two specific human phage antibodies against hepatitis E virus （HEV） from phage display library were isolated by immobilized metal affinity chromatography. The immobilized metal affinity chromatography applied to phage antibody selection was a helpful supplement to the selection in solution.     

引导选择抗细胞表面分子单链抗体

目的用引导选择方法从抗KGla细胞的噬菌体展示抗体库中分离单链抗体.方法首先用KGla细胞吸附法富集抗体库3轮或未富集,再分别用抗CD34单克隆抗体为引导分子进行引导选择,分离单克隆后用免疫荧光和流式细胞术鉴别其细胞结合特异性.酶联免疫吸附法分析部分克隆与CD34抗原的结合,并对10个阳性克隆进行DNA序列分析.用一级结构不同的单链抗体作免疫印迹,鉴别其抗原分子量.结果从144个经3轮富集和引导选择的单菌落中挑选出100个阳性单克隆,从96个未经富集的文库中引导选择出2个阳性克隆.102个阳性克隆中47个可识别KGla、HL60、U937、和CEM细胞(KGla 、HL60 、U937 、CEM ),55个只识别KGla细胞(KGla 、HL60-、U937-、CEM-).其中28个只识别KGla细胞的单克隆经ELISA检测均不结合CD34抗原.10个阳性克隆的DNA序列分析显示来自4种不同克隆,所结合的抗原显示不同的分子量.结论从抗KGla单链抗体库分出102个能识别造血干细胞和祖细胞的阳性克隆,引导选择在改进筛选效率方面具有优越性.     

抗HEV ORF2单链可变区抗体的筛选和鉴定

目的：筛选和鉴定抗戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）开放读码框架２（ＯＲＦ２）的人源化噬菌体单链可变区抗体。方法：以大肠杆菌表达的重组ＨＥＶ ＯＲＦ２多肽做为固相包被抗原,从半合成的人源化噬菌体抗体库中经过４轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、ＤＮＡ序列分析鉴定,获得抗原结合活性较强的抗－ＨＥＶ ＯＲＦ２单链可变区抗体,并以间接酶标法用该抗体对戊型肝炎患者石蜡包埋肝组织中的ＨＥＶ ＯＲＦ２抗原进行免疫组织化学鉴定。结果：筛选到的抗－ＨＥＶ ＯＲＦ２的单链可变区抗体基因。酶切和序列分析表明,该抗体基因由７９５ｂｐ组成：ＥＬＩＳＡ和免疫组织化学结果显示,抗－ＨＥＶ ＯＲＦ２人源化噬菌体单链可变区抗体能与重组ＨＥＶ ＯＲＦ２抗原特异性结合,并能够特异性识别戊型肝炎患者肝组织中的ＨＥＶ抗原。结论：此法     

大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞,提取mRNA后用RT-PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段,两者分别与Linker连接后,采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH-Linker-VL片段）,继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中,连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1,构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接,经电转化E.coliTG1和噬菌体的超感染,构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞，提取mRNA后用RT—PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段，两者分别与Linker连接后，采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH—Linker—VL片段），继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中，连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1，构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接．经电转化E.coli TG1和噬菌体的超感染，构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库，可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

人源性抗乳腺癌HER-2噬菌体单链抗体库的构建与筛选

目的：构建人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体（scFv）库,筛选和鉴定抗乳腺癌人类表皮生长因子受体2（HER2）特异性scFv,为HER2和CXC趋化因子受体4（CXCR4）双靶向融合蛋白的研制提供靶向HER2的高亲和力序列。 方法：取已确诊的乳腺癌患者癌旁淋巴组织,提取总RNA;构建可变区基因的T载体库,将重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因与pCANTAB连接肽连接,获得pCANTAB-scFv,电转化感受态大肠杆菌TG1;以M13K07辅助噬菌体进行感染,获噬菌体抗体库;利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测筛选后获得的噬菌体抗体活性,以免疫组织化学法检测抗体亲和力,并通过测序进一步鉴定。 结果：成功构建大容量pCANTAB-scFv抗体库,获得的scFv长度为750 bp,VH和VL长度分别为375和330 kb;电转化大肠杆菌TG1后酶切验证插入片段大小正确,得到库容为2.48×108的大容量抗体库;通过噬菌体展示和淘洗筛选,富集针对乳腺癌细胞株SKBR-3表面抗原的抗体库;所得抗体对HER2有高度的亲和力和特异性,对乳腺癌组织HER2抗原也具有较高的亲和力;测序结果与人IgG抗体进行对比,所获得的scFv具有高度的人源性。 结论：主要构建了大容量人源性抗乳腺癌细胞的噬菌体scFv库,并筛选获得可特异性识别人乳腺癌HER2的高亲和力scFv,为制备以HER2为靶点的抗肿瘤HER2和CXCR4双靶向融合蛋白提供了载体。