高血糖对树鼩脑皮层局灶性缺血时海马微环境离子稳态及神经元继发性损伤的影响

 目的：研究高血糖对树鼩脑皮层血栓性缺血时海马微环境离子稳态的影响,探讨高血糖在缺血后神经元继发性损伤中的作用及机制。方法：用链脲佐菌素复制树鼩高血糖模型,并用光化学方法诱导脑皮层局部血栓性缺血,用单泵等速微灌流系统和离子分析仪测定缺血4 h、24 h及72 h海马离子微环境（细胞外pH值、K+、Na+、Ca2+、Cl-）的动态变化,并观察脑组织的病理形态学改变及海马神经元密度变化。结果：树鼩脑皮层缺血后,其海马微环境内出现了pH值、Na+、Ca2+及Cl-含量的降低,K+含量升高,变化以缺血后4 h为著,24 h次之,72 h无显著差异;高血糖加缺血进一步加重离子稳态的紊乱,缺血后4 h的pH值、K+和Ca2+含量,以及缺血后24 h的pH值和Na+含量与正常血糖缺血组同期值相比,变化显著（P<0.05）。形态学观察显示,光化学反应后4 h照射区皮层可见梗死灶,且患侧海马CA1区也存在缺血损伤性改变;24 h病损达高峰;72 h伴随胶质细胞增生等修复性反应。相应时点高血糖加缺血组皮层及海马的损伤均大于缺血组,以缺血后24 h(P<0.01)和72 h(P<0.05)尤为显著。结论: 树鼩脑皮层血栓性缺血形成后,缺血中心区扩布所导致的微环境内酸碱平衡及离子稳态性异常可能是海马神经元继发性损伤的重要原因,高血糖可加剧缺血脑区离子微环境的紊乱。     

缺血后适应对树鼩脑缺血信号转导及转录激活因子3过磷酸化的调控作用

目的观察信号转导及转录激活因子3(STAT3)磷酸化在树鼩脑缺血后适应(PC)神经保护中的作用,并探讨其可能机制。方法将50只健康成年树鼩随机分为对照组、脑缺血4 h组、脑缺血24 h组、后适应4 h组和后适应24 h组(每组n=5),其中10只动物做HE染色(n=5)及电子显微镜观察(n=5)。本实验通过光化学反应建立树鼩血栓性脑缺血模型;于缺血后4 h夹闭患侧颈总动脉3次(每次5 min)实施缺血PC。采用TTC染色观察树鼩脑梗死面积的变化,通过HE和电子显微镜观察脑皮质和海马组织学改变及其超微结构变化,应用Western blotting检测皮层总STAT3(t-STAT3)及磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白表达变化。结果脑缺血后皮层血管内皮细胞肿胀,皮层及海马神经元损伤,线粒体肿胀、嵴溶解,以缺血24 h损伤最为明显,脑梗死面积达到(24.78±2.06)%。而皮层p-STAT3蛋白表达随缺血时间延长呈增高趋势,缺血4 h p-STAT3蛋白表达明显增高(0.24±0.1,P<0.01),缺血24 h p-STAT3蛋白表达则持续增高(0.32±0.1,P<0.01)。缺血PC处理后皮层血管内皮细胞水肿好转,皮层及海马神经元损伤减轻,脑梗死面积减小为(17.67±1.90)%(P<0.01)。与缺血组相比,缺血PC 4 h p-STAT3蛋白表达进一步升高(0.41±0.09,P<0.01),缺血PC 24 h p-STAT3蛋白表达增高更加显著(0.70±0.11,P<0.01)。结论树鼩脑缺血可导致STAT3磷酸化代偿性增强,缺血PC的脑保护作用可能与其促进STAT3过磷酸化有关。     

树鼩脑缺血后适应升高海马区rCBF及VEGF的变化

目的 探讨缺血后适应(PC)缓解海马rCBF与血管内皮生长因子(VEGF)的变化及其机制.方法 建立树鼩血栓性局部脑缺血模型,通过激光多普勒血流计测量海马CA1区rCBF含量;用免疫组化法测定海马VEGF的表达.结果 树鼩脑缺血时海马rCBF逐渐降低,以24 h的改变最显著,脑缺血后海马CA1区VEGF阳性细胞数增多,12 h表达最强(P<0.01);缺血PC可显著影响缺血所致的改变:rCBF逐渐增加,72 h最显著(P<0.01),与此同时VEGF的表达除8 h外均比血栓性缺血组增强(P<0.01),12 h组最明显;电镜显示缺血24 h血栓性缺血组的海马线粒体应激及内质网池形成最明显,给予PC后得以缓解.结论 缺血12 h内PC通过明显增强VEGF的表达可能与其改善rCBF有关,从而延长治疗的时间窗.     

树鼩脑缺血后适应升高海马区rCBF及VEGF的变化

目 的：研究树鼩局部脑缺血海马rCBF与血管内皮生长因子（VEGF）间的关系，探讨缺血后适应（PC）对rCBF与VEGF表达的改变及其机制。方 法：建立树鼩血栓性局部脑缺血及缺血PC模型，通过激光多普勒血流计测量脑缺血后4、8、12、24及72h海马CA1区rCBF的改变；用免疫组化法测定脑缺血上述时间海马VEGF的表达，并用图像分析系统测定其平均灰度值。于脑缺血后4h重复3次夹闭缺血侧颈总动脉实施缺血PC，并观察其对海马CA1区rCBF及VEGF表达的影响。结 果：树鼩脑缺血后4h海马CA1区VEGF阳性细胞数增多，以12h表达最强（P＜0.01），72h表达最低（P＞0.05）。脑缺血时海马rCBF逐渐降低，以24h的改变最显著（为2.55±0.28PU，P＜0.01）；72h时海马rCBF略有增加，为9.84±1.22 PU。实施缺血PC后，海马CA1区rCBF逐渐增加，72h最显著（P＜0.01）与此同时VEGF的表达除8h（P＞0.05）外，其余各组均比血栓性缺血组增强（P＜0.01），以12h组最明显；电镜显示缺血24h血栓性缺血组的海马线粒体应激及内质网池形成最明显，给予PC后得以缓减。结 论：树鼩脑缺血时海马CA1区rCBF减少的程度与VEGF表达增加具有密切联系；缺血PC可延长治疗的时间窗；缺血12h内VEGF表达的明显增强可能与rCBF改善有关；PC对海马rCBF的影响可能是神经元保护的关键所在。     

亚低温后适应对树鼩局部脑缺血海马CA1区神经元的保护机制

目的： 观察亚低温后处理(HPC)对树鼩局部脑缺血后不同时间海马CA1区血管内皮生长因子（VEGF）表达及神经元缺失的影响,探讨亚低温后适应保护脑缺血后海马CA1区神经元的可能机制。方法：建立光化学诱导树鼩脑缺血模型,于缺血后6h采用局部恒温控温装置使脑温降低并维持亚低温(31-32 ℃)状态1 h。用免疫组化法及图像分析仪测定海马CA1区VEGF表达的改变;计数海马神经元并观察其超微结构变化。结果：与常温组相比,亚低温后适应组海马CA1区VEGF表达在24 h时增加而72 h时明显下降（P＜0.01）;24 h时神经元坏死减少,72 h时坏死细胞增多,缺血侧超微结构呈现相同变化。结论：在脑缺血后早期VEGF的表达可能与其直接发挥对神经元细胞的保护作用有关,亚低温后适应对脑缺血的保护作用在脑缺血的早期有明显意义,而在缺血的晚期则可能加重脑缺血的损伤,低温后适应脑保护的意义在于延长脑缺血治疗时间窗。     

不同脑温对树鼩局部脑缺血海马血管内皮细胞生长因子表达的影响

目的研究不同脑温（亚低温、常温及高温）对树鼩局部脑缺血海马CA1区内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的影响,探讨缺血时脑温对VEGF表达的影响。方法建立光化学诱导树鼩皮层脑缺血模型,于缺血后6h采用局部恒温控温装置维持脑温在亚低温（31～32℃）、常温（36～37℃）和高温（39～40℃）三种不同温度状态持续1h。于缺血后24h及72h处死动物,用免疫组化染色方法染色及图像分析仪测定海马CA1区VEGF表达的不同强度。结果局部脑缺血后海马CA1区VEGF表达随温度的增加而减弱,亦随时间的延长而减弱;其中以72h时31℃组VEGF的表达下降最为明显（P〈0.01）。结论亚低温后处理将在脑缺血的早期发挥脑保护作用,其脑保护作用可能与亚低温能增强VEGF的表达有关。低温脑保护的意义在于延长脑缺血治疗时间窗。     

L-电压门控钙通道在糖尿病大鼠局灶性脑缺血中的变化及意义

目的: 检测单纯局灶性脑缺血和糖尿病局灶性脑缺血大鼠不同时间L-电压门控钙通道电流的变化,通过比较探讨其在糖尿病局灶性脑缺血中的意义。方法: 应用高脂饮食联合链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病大鼠模型,线栓法制备单纯局灶性脑缺血模型及糖尿病大鼠局灶性脑缺血模型,根据缺血不同时间分为正常假手术组、单纯脑缺血1 h、3 h、6 h、24 h;糖尿病假手术组、糖尿病脑缺血1 h、3 h、6 h、24 h共计10组。对单纯缺血24 h及糖尿病局灶性脑缺血24 h大鼠进行神经功能评分;应用全细胞膜片钳技术检测各组缺血周围皮层神经元细胞上电压门控钙通道电流的变化。结果: 糖尿病组大鼠术后清醒较晚,肢体偏瘫程度重于单纯缺血组(P<0.05);随着缺血时间的延长,单纯局灶性脑缺血及糖尿病局灶性脑缺血各组L-电压门控钙通道电流呈逐渐增大趋势(P<0.05),其中糖尿病局灶性脑缺血各组电压门控钙通道电流分别高于单纯局灶性脑缺血各组(P<0.05) 。结论: 与正常大鼠局灶性脑缺血相比,糖尿病大鼠局灶性脑缺血加重的原因可能与膜上钙通道开放电流增大导致的细胞内钙超载有关。     

缺血后适应对树鼩海马CA1区脑血流及星形胶质细胞活化的影响及可能机制

目的：研究缺血后适应（PC）对树鼩局部脑缺血海马CA1区脑血流（rCBF）与星形胶质细胞（AS）活化的影响，探讨缺血PC影响AS表达胶质纤维酸蛋白（GFAP)的可能机制。方法：建立树鼩血栓性局部脑缺血及缺血PC模型，通过激光多普勒（LD）血流计测量脑缺血后4 h、8 h、12 h、24 h及72 h海马CA1区rCBF的改变；用免疫组化法测定脑缺血上述时间海马GFAP的表达，并用图像分析系统测定其平均灰度值。于脑缺血后4 h重复3次夹闭缺血侧颈总动脉实施缺血PC，并观察其对海马CA1区rCBF和AS活化以及GFAP表达的影响。结果：树鼩脑缺血后4h海马CA1区GFAP阳性细胞数增多，AS表达GFAP增强，24h可见AS胀亡；72h海马CA1区AS表达GFAP达高峰（120.0±2.1，P＜0.01）。脑缺血时海马CA1区rCBF逐渐降低，以24 h的改变最显著,为(2.55±0.28) PU，P＜0.01；72 h时海马CA1区rCBF略有增加，为(9.84±1.22) PU。实施缺血PC后，海马CA1区rCBF逐渐增加，72 h最显著,为(18.74±1.60) PU，P＜0.01；此时海马GFAP表达进一步增强（111.0±1.3),P＜0.01。但AS胀亡的病理改变基本消失。结论：多次短暂的闭塞动物的颈动脉可延长树鼩脑缺血治疗的“时间窗”；缺血PC的脑保护机制可能与增加海马rCBF、调控AS活化及改善海马微环境有关。     

脑缺血及后适应对树鼩海马内质网应激信号分子PERK及GRP78的影响

目的:探讨脑缺血及后适应对树鼩海马内质网应激信号分子蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)及葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的影响及后适应的脑保护机制。方法:光化学反应诱导树鼩局部血栓性脑缺血,于脑缺血后3.5 h夹闭、打开缺血侧颈总动脉交替3个循环(每次5 min)以复制缺血后适应模型。HE染色观察缺血侧海马神经元损伤及超微结构变化,RT-PCR检测脑缺血及后适应不同时间海马组织PERK及GRP78 mRNA表达的变化,免疫组织化学法与Western blot法检测PERK及GRP78的蛋白定位及表达变化。结果:海马神经元随脑缺血时间延长而损伤加重,缺血24 h损伤最为严重,后适应可减轻损伤。脑缺血4 h、24 h及72 h PERK的mRNA及蛋白表达较假手术组增高(P0.05),后适应组与相应的缺血组相比,PERK的mRNA及蛋白表达减少,4 h、24 h差异显著(P0.05);脑缺血4 h、24 h及72 h GRP78的mRNA及蛋白表达与假手术组无明显差异,后适应24 h组较缺血24 h组表达增高(P0.05)。结论:树鼩局部血栓性脑缺血可激活缺血侧海马内质网应激反应,引起PERK/e IF2α信号转导通路中相关分子PERK的mRNA及蛋白表达增高。缺血后适应处理通过下调PERK、上调GRP78的表达,减轻内质网应激反应,减少神经元损伤,具有一定的脑保护作用。     

缺血后适应促进树鼩血栓性脑缺血时紧密连接occludin/ZO-1蛋白表达及抑制脑水肿的机制

 目的: 研究脑缺血及缺血后适应(postconditioning,PC)条件下,树鼩脑缺血时局部脑血流(regional cerebral blood flow,rCBF)、脑水肿及紧密连接(tight junction,TJ)的occludin和zonula occludins(ZO)-1蛋白表达的改变;探讨TJ表达对脑水肿及脑梗死的影响及其可能机制。方法: 将72只健康成年树鼩随机分为对照组、脑缺血组和脑缺血+PC组,其余3只动物用于磁共振成像(MRI)观察。通过光化学反应诱导树鼩局部血栓形成;缺血PC组于缺血后4 h夹闭患侧颈总动脉3次(每次5 min)实施PC处理。用电镜观察神经超微结构,用TUNEL法检测海马神经元的凋亡数量,用激光多普勒血流监测仪检测缺血区的rCBF,用免疫组化及Western blot法观察缺血海马occludin/ZO-1蛋白的表达,MRI技术监测脑梗死体积,组织干湿法检测脑含水量的改变。结果: 树鼩脑缺血后海马CA1区的正常神经元明显减少以及神经元超微结构明显异常。脑缺血组TUNEL阳性细胞数明显增加(P<0.01),rCBF明显降低,occludin/ZO-1表达减弱(P<0.01),脑含水量和脑梗死体积明显增加(P<0.01)。经PC处理的动物,缺血区rCBF增加,TJ表达增强,脑含水量降低,且TUNEL阳性细胞数和脑梗死体积明显减小(P<0.01)。结论: 缺血PC可增加树鼩缺血区rCBF但不增加局部含水量;提示缺血PC缩小脑梗死体积可能与occludin/ZO-1表达增强而抑制脑水肿有关。     

The effect of hyperglycemia on lipid peroxidation in the global cerebral ischemia of the rat.

To investigate the influence of hyperglycemia on ischemic brain damage, we measured brain ATP, lactate and malondialdehyde (MDA) levels in global cerebral ischemic models of Wistar rats. We induced global cerebral ischemia by the 4-vessel occlusion method. After 30 or 60 min of occlusion, and after 30 min of reperfusion, we measured brain ATP, lactate and MDA levels. During the ischemic period, brain ATP levels decreased to 30-70% of sham groups both in normoglycemic and hyperglycemic groups. But during the reperfusion period, the recovery rate of ATP levels was significantly lower in the hyperglycemic than in the normoglycemic groups (p less than 0.05). After 60 min of global ischemia, brain lactate increased much more in the hyperglycemic than in the normoglycemic group, and, during reperfusion, was washed out slowly in the hyperglycemic group. The MDA level, a parameter of lipid peroxidation, increased more in the hyperglycemic group than in the normoglycemic group during reperfusion periods (p less than 0.05). We conclude that hyperglycemia increases lactate accumulation, delays the recovery of energy metabolism, and enhances the lipid peroxidation in the transient global ischemia of rat brain. These findings may suggest the harmfulness of hyperglycemia in clinical cerebral ischemia.     

树鼩脑血栓梗塞区局部脑血流的变化

本实验采用光化学方法诱导树Ｑｕ（低等灵长类）局部脑血栓形成,静脉注孟加拉红,用λ５６０ｎｍ的光束照射树Ｑｕ右侧颅骨１０ｍｉｎ,检测实验后４、２４、７２ｈ中心区和半暗区 ｒＣＢＦ、微区Ｎａ、Ｋ、Ｃａ＾２＋含量。水含量的改变。结果显示,光化学反应后４ｈ中心区和半暗区ｒＣＢＦ明显降低,Ｎａ＾＋、Ｃａ＾２＋含量和不含量明显升高并达峰值。自４ｈ至７２ｈ中心区和半暗区水含量分别在两个水平保持平衡。实验表明光化     

银杏内酯B对树鼩血栓性脑缺血后GFAP表达的影响及机制探讨

目的:观察树鼠句血栓性脑缺血形成后不同部位星形胶质细胞表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的时间消长改变,以及血小板活化因子(PAF)受体拮抗剂银杏内酯B(GB)对GFAP表达的影响,并探讨其可能机制。方法:建立光化学诱导树鼠句血栓性脑缺血模型,用免疫组化法检测缺血后4、2 4、72hGFAP表达,最后用图像分析系统测定其平均灰度。结果:脑缺血后半暗区GFAP表达增多,以2 4h最为显著,其平均灰度值为6 0 .33±3 .0 9(P <0 . 0 1) ,72h表达仍高,其平均灰度值为6 0. 88±2 . 6 2 (P <0 . 0 1) ,此时对侧及远隔区GFAP表达增强。光化学反应后6h于舌下静脉注射GB(5mg/kg) ,发现缺血后2. 4h半暗区星形胶质细胞GFAP表达明显下调,与对照组相比有显著差异(P <0 . 0 5 )。结论:缺血性脑损伤后星形胶质细胞表达GFAP增多与神经元受损有关;GB通过拮抗血小板活化因子(PAF)对神经元的损伤作用使星形胶质细胞表达GFAP减少。     

树鼩血栓性脑缺血中心区及半暗区神经元PAF受体结合特性的研究

目的：观察血栓性局部脑缺血过程中缺血中心区及半暗区血小板活化因子（PAF）受体的消长变化,探讨PAF在脑缺血中心区及半暗区神经元继发性脑损伤中的分子机制。方法：建立光化学诱导树鼩血栓性局部脑缺血模型并提取树鼩脑细胞膜蛋白,用[³H]-PAF放射配体结合试验检测中枢神经细胞膜不同特性的PAF结合位点（受体）。结果：树鼩脑细胞膜上存在两种亲和性不同的PAF受体,即高亲和性和低亲和性受体,其亲和力（kD）分别为(3.61±0.72) nmol/L（kD₁）和17.04±2.41) nmol/L（kD₂）相应的最大结合容量（B_max）分别为(1 457.94±168.01) pmol/g蛋白和(5 017.40±742.16) pmol/g蛋白。脑缺血4、24及72 h中心区、半暗区及对侧区高、低亲和性受体的kD值、B_max值均显著低于假手术组（P<0.01）,中心区及半暗区尤为明显,其中以缺血后24 h的变化最为显著。结论：PAF受体在介导缺血性脑损伤过程中起着重要作用,缺血中心区及半暗区机能代谢的不同与PAF受体亲和特性及最大结合容量改变不同有关,亦是PAF介导继发性脑损伤的重要分子基础。