RNAi抑制Survivin基因的表达对乳腺癌SKBr-3细胞的影响

目的 应用RNA干扰技术抑制人Survivin基因表达,观察其对乳腺癌SKBr-3细胞增殖和凋亡的影响.方法 设计、合成靶向Survivin基因的siRNA基因片段,应用脂质体包埋转染乳腺癌SKBr-3细胞,采用MTT比色法检测细胞增殖率、RT-PCR和Western blot法观察乳腺癌细胞Survivin mRNA和蛋白质的表达、流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 MTt检测显示Survivin-siRNA组对细胞增殖有明显抑制作用(P<0.05),其细胞最高抑制率为(43.1±O.3)%;RT-PCR检测显示Survivin-siRNA组mRNA表达明显下调(P<0.01),其相对表达量分别为0.203 ±0.018、0.229±0.019,抑制率分别为55.2%、49.4%;Western blot检测显示Survivin-siRNA组蛋白表达下调(P<0.01),其蛋白相对表达量分别为0.702±0.007、0.684±0.016,抑制率分别为34.8%、36.4%;流式细胞仪检测显示Survivin-siRNA组细胞凋亡率明显增高(P<0.01),分别为(14.2±1.4)%、(16.8±0.6)%.结论 Survivin-siRNA能有效封闭Survivin的表达,抑制SKBr-3细胞增殖并诱导细胞凋亡,推测Sur-vivin基因可能成为乳腺癌基因治疗的一个新靶点.     

重组人p53腺病毒基因药物对人鼻咽癌细胞的抑制实验

目的探索p53基因在鼻咽癌基因治疗方面的可行性。方法以人鼻咽癌CNE细胞株为实验对象,将重组人p53腺病毒药物（1010rAd/p53）转染人鼻咽癌CNE细胞,用MTT比色实验及流式细胞仪实验的方法进行体外实验,观察重组人p53腺病毒药物（rAd/p53）对人鼻咽癌CNE细胞体外生长的影响。结果各浓度重组人p53腺病毒药物（1010rAd/p53、109rAd/p53、108rAd/p53、107rAd/p53）对人鼻咽癌CNE细胞生长有抑制。尤以1010rAd/p53明显。转染3天后,重组人p53腺病毒药物（rAd/p53）诱导人鼻咽癌CNE细胞明显凋亡。结论重组人p53腺病毒药物（rAd/p53）对人鼻咽癌CNE细胞生长能有效抑制,为鼻咽癌的基因治疗提供了实验依据。     

Survivin表达抑制影响鼻咽癌细胞的增殖与凋亡

目的研究Survivin表达抑制对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响,探讨Survivin在鼻咽癌中的生物学功能。方法采用脂质体将Survivin特异性SiRNA(small interfering RNA)转入鼻咽癌细胞株5-8F,培养48h后,收集细胞。逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、流式细胞仪(flow cytometry,FCM)分别检测Survivin mRNA和蛋白在细胞中表达。流式细胞仪检测细胞凋亡与周期,显微镜下计数检测细胞增殖抑制。结果SiRNA抑制5-8F细胞Survivin表达后,细胞凋亡指数显著高于对照组(P<0.01);S/G1比值显著高于对照组(P<0.01);细胞增殖抑制率也显著高于对照组(P<0.01);脂质体对照组与阴性SiRNA对照组比较,细胞凋亡、周期和增殖差异无显著性(P>0.05)。结论Survivin表达抑制,诱导鼻咽癌细胞凋亡并抑制其增殖。     

沉默YAP1可抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力

目的探究沉默Yes 相关蛋白1（YAP1）对鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法采用实时荧光定量PCR和 Western blot方法检测YAP1在鼻咽癌细胞系中的表达水平;在鼻咽癌细胞S26和S18中转染3条合成的小干扰RNA：si-NC, si- YAP1#1和si-YAP1#2,以转染阴性对照si-NC的细胞作为对照组,转染si-YAP1#1和si-YAP1#2的细胞作为实验组,实时荧光定 量PCR和Western blot检测转染后的干扰效率;通过细胞计数、平板克隆形成等方法评估转染si-YAP1#1和si-YAP1#2后的实验 组和转染si-NC的对照组对鼻咽癌细胞增殖能力的影响;用划痕和Transwell 方法分析各组细胞迁移与侵袭能力的变化; Western blot检测各组细胞中c-myc、上皮性钙黏蛋白（E-cadherin）、神经性钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）等与细 胞增殖和上皮间质转化相关蛋白的表达变化。结果YAP1在鼻咽癌细胞系中高表达;与阴性对照组相比,转染si-YAP1#1和si- YAP1#2的实验组细胞中YAP1的mRNA及蛋白水平均显著降低（P<0.05）;生长计数、平板克隆、划痕及Transwell等实验结果 均显示转染si-YAP1#1和si-YAP1#2的实验组细胞的生长和克隆能力、划痕愈合能力及侵袭能力较阴性对照组细胞明显下降 （P<0.01）;且相较阴性对照组,实验组细胞中c-myc、N-cadherin和Vimentin等蛋白的表达水平降低,E-cadherin的表达量增加。 结论YAP1在鼻咽癌细胞系中高表达,在鼻咽癌细胞中利用siRNA靶向敲低YAP1的表达后可以抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移 及侵袭能力,提示YAP1可以作为一个潜在的鼻咽癌临床治疗干预靶点。     

RNA干扰沉默bcl-2基因对人黑素瘤细胞生长抑制研究

目的：探讨应用RNAi技术下调bel-2基因表达后对人黑素瘤M14细胞株生长的影响。方法：采用人黑素瘤川4细胞株,利用人工合成的bcl-2靶向小分子干扰RNA（small interference RNA,siRNA）转染细胞,MTT法测细胞增殖情况。结果：免疫组化可见25例实验组细胞爬片均表达bcl-2,表达强度弱阳性,25例空白对照组和阴性对照均表达bel-2,表达强度强阳性,实验组细胞与空白对照组和阴性对照组相比bcl-2表达明显减低,差异有统计学意义（P〈0．05）,空白对照组和阴性对照组bcl-2表达差异无统计学意义（P〉0．05）,MTT法测定显示：转染48h后,实验组7组细胞平均吸光度OD值0．384±0．026,空白对照组7组细胞平均吸光度OD值0．590±0．032,阴性对照组7组细胞平均吸光度OD值0．541±0．034,实验组细胞吸光度降低,与空白对照组及阴性对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）,而空白对照组和阴性对照组两组间差异无统计学意义（P〉0．05）,实验组细胞增殖抑制率34．9l％,阴性对照组细胞增殖抑制率8．30％,差异有统计学意义（P〈0．05）,显示实验细胞增殖减慢。结论：Bcl-2RNAi能显著降低人黑素瘤M14细胞株的bcl-2蛋白表达,有效押制癌细胞的生长,为黑素瘤的治疗提供了一种新的治疗策略。     

miR-34a抑制人鼻咽癌细胞生长与侵袭

目的探讨miR-34a在人鼻咽癌CNE2细胞中的生物学功能。方法采用MTT、Transwell侵袭实验、细胞划痕实验分别检测过表达miR-34a对人鼻咽癌CNE2细胞的生长与侵袭作用。结果 MTT检测发现,过表达miR-34a可抑制人鼻咽癌CNE2细胞的生长增殖;细胞划痕和Transwell侵袭实验显示,在鼻咽癌CNE2细胞中过表达miR-34a 48 h后划痕愈合率为40.3%±9.0%,与对照组（76.3%±6.8%）比较,能明显减缓CNE2细胞划痕的愈合,转染miR-34a mimics 48 h后穿过基底膜的细胞数为71±10,与对照组（147±5）比较,能明显减缓CNE2细胞侵袭能力（P〈0.01）。结论 miR-34a可抑制鼻咽癌CNE2细胞生长与侵袭。     

凋亡抑制基因Survivin在人肝细胞肝癌中的表达及其临床意义

目的 :探讨凋亡抑制基因Survivin在人肝癌 (HCC)中的表达及其临床意义。　方法 :应用SABC免疫组化染色技术和逆转录聚合酶链反应 (RT PCR) ,检测 95例HCC及其癌旁组织、8例非肝癌肝组织Survivin蛋白以及 8例HCC组织SurvivinmRNA的表达 ,分析其与病理分级、临床分期和肿瘤大小等临床指标之间的关系。　结果 :HCC组织中Survivin基因蛋白表达率显著高于癌旁组织和非肝癌肝组织 (5 9.77%vs 2 6 .0 0 %和 5 9.77%vs0 .0 0 % ,P <0 .0 1) ;HCC组织中SurvivinmRNA表达阳性率显著高于癌旁组织 (37.5 %vs 0 .0 0 % ,P <0 .0 1) ;Sur vivin蛋白表达与肝癌组织学分级、临床分期、肿瘤大小无相关关系。　结论 :Survivin基因在HCC组织表达上调 ,提示该基因参与了HCC的发生过程 ;Survivin基因表达与组织分化程度无关 ,提示其可能成为HCC特异性诊断指标或基因治疗的新靶点。     

RNAi技术沉默Bmi-1基因对人胃癌AGS细胞株的作用

目的:探讨RNA干扰(RNAi)技术沉默Bmi-1基因表达对人胃癌细胞株AGS增殖和侵袭能力的影响。方法:利用慢病毒表达体系pHelper1.0/pHelper2.0/pGCL-GFP,构建针对Bmi-1基因shRNA序列的RNAi重组质粒vshRNA-Bmi-1,转染AGS细胞,采用Western blot检测重组质粒对Bmi-1蛋白表达的影响,MTT法检测重组质粒对AGS细胞体外生长的抑制作用,PI单染法流式细胞术检测转染重组质粒后细胞凋亡与细胞周期的变化,小室侵袭实验检测AGS细胞侵袭能力变化。结果:成功构建了vshRNA-Bmi-1重组质粒,并成功转染AGS细胞抑制Bmi-1蛋白的表达。转染重组质粒后,AGS细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡增加,S期比例上升,细胞侵袭能力弱于非特异性转染组。结论:vshRNA-Bmi-1重组质粒明显下调Bmi-1蛋白在AGS胃癌细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞的增殖与侵袭,促进其凋亡。     

二烯丙基二硫诱导人鼻咽癌CNE1细胞凋亡

目的 探讨二烯丙基二硫(DADS)诱导人鼻咽癌CNEl细胞凋亡的生物学效应.方法 通过MTT法检测DADS对CNE1细胞生长的影响;用光学显微镜、流式细胞仪研究DADS诱导细胞凋亡的作用.免疫组织化学法检测细胞内Bcl-2、Bax蛋白的表达,Western blot法检测细胞内Caspase-3蛋白的表达.结果 DADS能抑制CNE1细胞的生长.DADS处理CNE1细胞后,细胞呈凋亡特征性改变.流式细胞分析显示DADS呈浓度依赖性诱导CNE1细胞凋亡.免疫组织化学结果表明DADS处理细胞后,Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达下降.随药物浓度的增加Caspase-3蛋白表达增强.结论 DADS具有诱导CNE1细胞凋亡的作用,其机制可能与Bcl-2/Bax下降,促进Caspase-3活化有关.     

p53基因药物抑制人鼻咽癌生长的免疫组化研究

目的探索p53基因在鼻咽癌基因治疗方面的可行性。方法以人鼻咽癌CNE细胞株为实验对象,将重组人p53腺病毒药物（10^10rAd／p53）感染人鼻咽癌CNE细胞,用免疫组化实验的方法观察重组人p53腺病毒药物（rAct／p53）对人鼻咽癌CNE细胞体外生长的影响。结果重组人p53腺病毒药物（10^10rAd／p53）对人鼻咽癌CNE细胞生长有明显抑制。结论重组人p53腺病毒药物（rAd／p53）对人鼻咽癌CNE细胞生长能有效抑制,为鼻咽癌的基因治疗提供了实验依据。     

慢病毒介导的siRNA靶向干扰EIF4G1鼻咽癌稳定细胞株的建立

目的 检测人真核翻译起始因子4G1(EIF4G1)基因在8株鼻咽癌细胞中的差异表达,寻找最高表达的细胞株.构建EIF4G1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,建立稳定干扰EIF4G1表达的鼻咽癌细胞株,测定干扰效率.方法 应用荧光定量PCR检测EIF4G1 mRNA在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1表达水平.构建重组靶向EIF4G1 shRNA慢病毒表达质粒pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA.用293FT细胞包装后产生的成熟慢病毒颗粒感染5-8F细胞.经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的5-8F鼻咽癌细胞株.最后荧光定量PCR检测干扰效率.结果 在8个鼻咽癌细胞株中,EIF4G1显示在5-8F细胞株中表达最高.PCR和测序验证pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染5-8F细胞后,与阴性对照组和未十扰组相比可明显抑制EIF4G1 mRNA水平EIF4G1表达.结论 成功构建TpLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰EIF4G1表达的siRNA5-8F鼻咽癌细胞株.     

慢病毒介导的shRNA靶向干扰nestin鼻咽癌稳定细胞株的建立

摘要：目的检测nestin基因在8种鼻咽癌细胞中的表达差异,寻找高表达的细胞株。构建nestin基因的shRNA表达载体,
建立nestin稳定干扰的鼻咽癌细胞株。方法应用Real-time PCR和免疫荧光技术检测nestin在鼻咽癌细胞株中的表达水
平。构建带GFP的重组靶向nestin shRNA慢病毒表达质粒,筛选阳性克隆,测序鉴定。293T细胞包装病毒,收集病毒上
清,测定滴度。经Real-time PCR内源筛靶,选择最佳靶点。将重组慢病毒感染5-8F细胞,Western blotting 和Real-time
PCR检测nestin的表达。结果在8种鼻咽癌细胞株中,5-8F细胞中nestin表达较高。PCR和测序验证重组质粒构建成
功。慢病毒感染5-8F细胞后,与阴性对照组和空白组相比,nestin的mRNA和蛋白水平明显受到抑制。结论成功构建了
干扰nestin的慢病毒重组质粒,并建立了稳定靶向干扰nestin表达的5-8F鼻咽癌细胞株。
     

利用 RNAi阻抑 hTERT 和Bi-1双基因表达的RNAi作用效果的研究

目的：利用LipofectamineTM2000将针对靶向人类端粒酶末端逆转录酶（hTERT）和Bax inhibitor‐1（Bi‐1）基因设计并构建的质粒载体转染至CNE‐2Z鼻咽癌细胞内,诱导序列特异性的基因沉默,研究其产生的shRNA阻抑hTERT 和Bi‐1基因表达的效果。方法收集CNE‐2Z细胞,设未处理组、pEGFP‐N1组、pEGFP‐N1／Lip组,采用流式细胞术检测Lip对CNE‐2Z细胞的转染能力,RT‐PCR和Western blot法分析表达shRNA重组质粒载体对hTERT和Bi‐1基因mRNA表达的抑制效应。结果转染CNE‐2Z细胞的质粒和Lip最佳组合：质粒为2．5μg ,Lip为6．25μL。结论成功构建的针对人hTERT和Bi‐1基因的shRNA真核表达质粒能特异、有效地阻抑hTERT和Bi‐1基因的表达。     

Survivin蛋白和LMP1在鼻咽癌组织中的表达关系

目的：探讨凋亡抑制基因Survivin蛋白和EB病毒潜伏膜蛋白（LMP1）在鼻咽癌组织中的表达情况以及它们之间的关系.方法：应用免疫组织化学技术S-P法对68例鼻咽癌组织标本进行凋亡抑制基因Survivin蛋白与EB-LMP1的表达检测.结果：鼻咽癌组织Survivin蛋白产物的阳性率为82.4%（56/68）,LMP1阳性率为67.6%（46/68）;56例Sur-vivin蛋白表达的阳性鼻咽癌标本中,有42例LMP1阳性,共同阳性率75.0%（42/56）,12例Survivin蛋白表达的阴性鼻咽癌标本中,9例LMP1阴性,共同阴性率66.7%（9/12）,两者之间高度相关（P〈0.01）.结论：鼻咽癌组织中凋亡抑制基因Survivin蛋白的表达与LMP1的表达密切相关.     

RNAi沉默Survivin基因对人甲状腺癌SW579增殖的影响

目的:应用RNAi技术封闭Survivin基因,对甲状腺癌细胞增殖的影响,探讨RNA干扰survivin基因表达治疗甲状腺癌的可行性。方法:实验设为空白组、脂质体组、阴性对照组和RNAi组。RNAi组是针对Survivin基因的有效序列合成DNA正义链及反义链,经变性、退火,形成双链DNA,与pGenesil-1线性质粒构建重组体,经脂质体转染SW579细胞。各组利用RT-PCR、Western-bloting检测survivin表达情况;MTT法检测细胞增殖的变化,流式细胞仪检测转染后SW579细胞凋亡的变化。结果:RT-PCR、Western blotin结果显示,转染survivin基因重组体组的mRNA和蛋白水平的表达与其它各组比较均明显下调(P<0.01),转染后SW579细胞生长率下降,凋亡指数明显增加(P<0.01)。结论:特异封闭survivin基因,能够有效地抑制甲状腺癌细胞的增殖,诱导其凋亡的发生。     

Pro-apoptotic effect of cecropin AD on nasopharyngeal carcinoma cells

Nasopharyngeal carcinoma （NPC） is one of the highly prevalent malignancies in Southeast Asia. Chemotherapy and radiotherapy are commonly administrated to treat nasopharyngeal carcinoma, but these therapies can not prevent the recurrence and metastasis of tumor cells. Furthermore, these therapies have severe side effects. Therefore, it is important to find a more effective therapy, e. g., a gene therapy for treatment of nasopharyngeal carcinoma. Cecropin AD （Cad） is a hybrid peptide that exhibits higher antibacterial activity than natural cecropin. It consists of 1-11 amino acid residues in the N-end of cecropin A and 12-37 amino acid residues in the c-end of cecropin D. The role of Cad in the malignant cells remains unclear. In this study, the Cad gene was cloned and transferred into NPC CNE2 cells and its pro-apoptotic effect were investigated.     

RNAi抑制鼻咽癌细胞表皮生长因子受体表达对细胞生长的影响

目的利用RNAi技术抑制鼻咽癌细胞5-8F表皮生长因子受体（EGFR）表达,观察细胞生长变化,探讨EGFR与鼻咽癌发生发展之间的相关性。方法利用体外转录法合成EGFR特异性siRNA,将其瞬时转染5-8F．收集转染后细胞总RNA和蛋白,利用RT．PCR和Western blot法测定EGFR表达水平的变化,并检测EGFR表达抑制后细胞生长速度和生长周期的变化。结果合成的3对siRNA中,有一对使EGFR mRNA表达下降67．5％,蛋白表达下降77％。EGFR表达抑制后5．8F生长速度减慢,并诱导细胞周期停止在G1期。结论RNAi沉默EGFR表达可抑制鼻咽癌细胞生长,并诱导癌细胞停止在G1期,RNAi可作为探索鼻咽癌发生发展机制和基因治疗的有效工具。     

Expression of telomerase and its RNA in nasopharyngeal carcinoma

Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ,ａｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｔｈａｔｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓｉｎｔｈｅｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅｏｆｔｅｌｏｍｅｒｅｌｅｎｇｔｈ ,ｈａｓｂｅｅｎｆｏｕｎｄｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｃｅｌｌｉｍｍｏｒｔａｌｉｔｙａｎｄｍａｌｉｇｎａｎｃｙ Ｒｅｃｅｎｔｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｉｓａｈｉｇｈａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｅｌｏｍｅｒａｓｅｉｎｍｏｓｔｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒｓａｓｗｅｌｌａｓｉｎｉｍｍｏｒｔａｌａｎｄｔｕｍｏｒｃｅｌｌｌｉ…     

RNA干扰黏着斑激酶抑制人肝癌细胞sk-hep-1生长的实验研究

目的 通过运用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi),干扰人肝癌细胞系sk-hep-1的黏着斑激酶(FAK)的表达,初步探讨干扰效果.方法 在体外,用转染试剂FugeneHD将靶向FAK基因的小发夹RNA质粒(pshFAK)转染至sk-hep-1细胞中,通过流式细胞术、RT-PCR和Western...