补肾中药诱导骨髓基质干细胞成骨分化的动物实验研究

目的通过动物实验于体外条件下观察补肾中药对大鼠骨髓基质干细胞增殖分化的影响。方法将不同浓度的补肾中药方剂与骨髓基质干细胞体外共同培养,测定细胞增殖功能,检测成骨细胞增殖与分化指标(包括碱性磷酸酶、矿化结节)。结果与空白组比较,浓度100 mg/L、200 mg/L的补肾中药在不同时间段均可提高骨髓基质干细胞增殖率(P<0.05);与空白组比较,浓度20 mg/L、40 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的补肾中药可使ALP活性增强、矿化结节数量增多(P<0.05)。结论较高浓度的补肾中药能促进骨髓基质干细胞的成骨潜能。     

靶向PPARγ基因RNA干扰对乙醇诱导家兔骨髓基质细胞成脂分化的影响

目的:观察靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPARγ)基因RNA干扰阻断乙醇诱导骨髓基质细胞的成脂分化效应.方法:选用家兔第2代骨髓基质细胞,随机分为7组.对照组(N):无特殊处理;模型组(M):给予0.09 mol/L乙醇;感染空载体组(CO):给予空载体腺病毒1×105U和乙醇;感染无关siRNA组(C1):给予无关序列siRNA腺病毒1×105U和乙醇;干扰1、2、3组(S1、S2、S3):分别给予靶向PPAR-γ siRNA 1、2、3 腺病毒1×105U和乙醇.7d后采用RT-PCR技术检测MSCs内PPARγmRNA表达,14 d后测定MSCs内甘油三酯含量,21d后MSCs苏丹Ⅲ染色,计数脂肪细胞.结果:M组、C0组、C1组PPARγ mRNA呈高表达,脂肪细胞数增多,细胞甘油三酯含量升高.与N组比较差异均有统计学意义(P均<0.05);S1组、S2组、S3组PPARγ mRNA呈低表达,脂肪细胞数少,细胞内甘油=三酯含量稍高,与M组、CO组、C1组比较差异均有统计学意义(P均<0.05),与N组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论:靶向PPARγ,基因RNA干扰能够有效地阻断乙醇诱导的骨髓基质细胞中PPARγmRNA高表达和成脂分化.     

靶向PPARγ基因RNA干扰对激素抑制家兔骨髓基质细胞成骨分化的影响

目的:观察靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPARγ)基因RNA干扰阻断激素作用保持骨髓基质细胞(MSCs)成骨分化的作用.方法:选用家兔第2代MSCs,随机分为7组.对照组(C):无特殊处理;模型组(M):给予10-7 mol/L地塞米松;感染空载体组(O):给予空载体腺病毒1 × 105 U和地塞米松;感染无关siRNA组(N):给予无关序列siRNA腺病毒1×105 U和地塞米松;干扰1、2、3组(I1、I2、I3):分别给予靶向PPARγ siRNA 1、2、3腺病毒1 × 105 U和地塞米松.7d后采用RT-PCR技术检测各组细胞中PPARγ mRNA和核心结合因子 al(Cbfal) mRNA表达.14 d后测定各组培养液骨钙素含量和细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性.结果:M组、O组和N组PPARγ mRNA呈高表达,cbfal mRNA呈低表达,骨钙素含量和ALP活性均下降,与C组比较差异均有统计学意义(P均<0.05).I1组、I2组、I3组PPARγ,mRNA呈低表达,Cbfal mRNA呈高表达,骨钙素含量和ALP活性均接近C组,与C组比较差异均无统计学意义(P均>0.05).结论:靶向PPARγ基因RNA干扰能够阻断激素作用,下调PPARγ基因表达,上调Cbfal基因表达,保持细胞的正常成骨分化.     

乙烯雌酚诱导兔骨髓基质干细胞向成骨分化的实验研究

目的观察乙烯雌酚（Diethylstilbestrol）对兔骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）成骨分化的影响,探讨乙烯雌酚对骨髓基质干细胞的成骨调节及其对骨骼系统的影响。方法用不同浓度（0,10-（-10）～10-（-5） mol/L）乙烯雌酚干预1周龄新西兰长耳白兔的骨髓基质干细胞,并设地塞米松10-（-8） mol/ L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、维生素C 50mg/L为阳性对照,在干预不同时间分别用茜素红染色鉴定钙化结节形成、全自动生化仪测碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性。结果10-（-8）mol/L乙烯雌酚干预25天后开始出现钙化结节 10-（-8）、10-（-7）mol/L乙烯雌酚干预组ALP在14、21天时显著增加。结论乙烯雌酚能促进兔骨髓基质干细胞的成骨分化,并能通过成骨细胞的数量来发挥骨骼系统的保护作用。     

兔骨髓基质干细胞诱导成骨的实验研究

目的:研究兔骨髓基质干细胞(BMSCs)的生长特点和在诱导条件下的成骨特性。方法:使用密度梯度法分离骨髓基质细胞并进行培养,传2代后运用成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸钠(β-Gp)、L-坏血酸(AA)进行诱导,测试骨髓基质细胞的生长变化和成骨分化。结果:形态学表明骨髓基质细胞呈集落生长,有成纤维细胞样外观,诱导后细胞生长较前明显减慢,逐渐变为立方形、锥形或梭形。汇合时细胞呈铺石状重叠生长,进而形成“钙结节”样表现。染色及电镜观察可见细胞诱导前后有明显区别,细胞增殖吸光度(OD值)及细胞碱性磷酸酶测试表明,随着时间的延长,细胞增殖变慢,但分化能力增强(P<0.05)。结论:骨髓基质细胞作为构建组织工程骨的种子细胞在地塞米松、β-甘油磷酸、L-坏血酸诱导下成骨具有可靠的重复性。     

辛伐他汀促进骨髓基质细胞的成骨分化

目的：观察辛伐他汀对骨髓基质细胞成骨分化的影响，探讨其刺激成骨的作用机制。方法：体外培养成年小鼠骨髓基质细胞，不同浓度的辛伐他汀作用72h后，RT-PCR检测骨钙素(osteocalcin，OCN)mRNA水平的变化，Western blot检测OCN和骨桥蛋白(osteopontin，OPN)表达水平的变化，细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)细胞化学染色及酶比活性测定。结果：辛伐他汀作用72h后，OCN的mRNA表达水平增高，OCN、OPN蛋白表达水平增高，呈剂量依赖关系，细胞ALP染色增强，ALP比活性显著增高。结论：辛伐他汀促进骨髓基质细胞的成骨分化，辛伐他汀刺激成骨的作用机制可能与此有关。     

促骨髓基质干细胞成骨分化因子研究现状

骨髓基质干细胞（BMSCS）是具有多项分化潜能的干细胞,体外诱导培养表达成骨、神经分化等细胞表型是现代研究热点及难点。现代医学对其促分化及影响因子进行了积极的科研探索。现代基础研究多应用骨髓基质干细胞经典成骨诱导基本辅剂（地塞米松、β—黼磷酸钠和维生素C）培养促进BMSCS成骨分化。在基础研究时常把碱性磷酸酶活性、骨桥蛋白、骨钙蛋白和I型胶原等作为评判促成骨分化效果的重要量化指标。现将近年来研究较多的促成骨分化细胞因子综述如下。     

靶向 PPARγRNA 干扰对激素诱导家兔骨髓基质细胞成脂分化的影响

目的:观察靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPARγ)RNA干扰抑制激素诱导骨髓基质细胞成脂分化的作用.方法:选用家兔第2代骨髓基质细胞.随机分为6组:模型组(M组:给予10-7 mol/L地塞米松),干扰1、2、3组(S1组、S2组、S3组:分别给予siRNA 1、2、3腺病毒1 × 106 U和10-7 mol/L地塞米松),感染无关siRNA gl(C组:给予siRNA4腺病毒1×106 U和10-7 mol/L地塞米松),对照组(N组:不给予siRNA腺病毒和地塞米松).苏丹Ⅲ染色.光镜下进行脂肪细胞计数,并采用RT-PCR方法检测细胞内PPARγ Mrna的表达.结果:处理并培养细胞3 d,S1组、S2组、S3组细胞内PPARγ,Mrna表达水平低于M组、C组(P<0.05),且与N组比较差异无统计学意义(P>0.05).处理细胞14 d后.S1组、S2组、S3组中分化为脂肪细胞的数量少于M组和C组(P<0.05),且与N组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论:siRNA能够有效阻断激素诱导的骨髓基质细胞中PPARγ/Mrna表达及其成脂分化.     

PPARδ激动剂GW501516对大鼠骨髓基质干细胞分化的作用

目的：探讨过氧化物酶体增殖激活受体δ( PPAR δ)激动剂GW501516对大鼠骨髓基质干细胞( BMSCs)向成脂和成骨方向分化的作用。方法全骨髓培养法培养大鼠原代BMSCs后采用差速贴壁法纯化,流式细胞仪鉴定其细胞表面标志物,实验分为PPAR δ激动剂组和对照组,分别进行成骨和成脂方向诱导培养,荧光定量PCR检测成骨细胞分化标志物(碱性磷酸酶、骨钙素)和脂肪细胞分化标志物(脂肪酸结合蛋白2、脂连素) mRNA的表达,油红O 染色检测脂肪细胞分化,茜素红染色检测成骨细胞矿化情况。结果与对照组比较,PPAR δ激动剂促进BMSCs向成骨细胞方向分化标志物表达,抑制向脂肪细胞方向分化标志物表达。茜素红染色显示PPAR δ激动剂组细胞矿化结节较对照组增加,油红染色显示PPAR δ激动剂组脂肪小滴明显减少。结论 PPAR δ激动剂促进BMSCs向成骨方向分化,抑制其向成脂方向分化。     

骨髓基质干细胞成骨分化影响因素研究进展

骨不连、骨组织缺损是外科临床常见的疾病之一.但目前临床主要应用的自体骨移植、异体骨移植及人工代替品移植因各自缺点限制了它们的应用.然而以骨髓基质干细胞(MSCs)为种子细胞的骨组织工程学异军突起,为骨缺损、骨不连的治疗开辟了一条崭新的道路.来源于骨髓的BMSCs在体外培养,扩增并诱导后有很强的成骨能力,并且容易分离,来源广泛应用安全方便,所以其作为骨组织工程首选的种子细胞日益受到重视.     

间充质干细胞与其诱导血管内皮细胞联合种植构筑血管化组织工程骨修复兔大段骨缺损

目的 研究间充质干细胞(MSC)与其诱导的血管内皮细胞(EC)联合种植于多孔β-磷酸三钙(β-TCP)构筑血管化组织工程骨修复大段骨缺损的作用.方法 制备兔双侧尺骨1.5 cm骨缺损共64侧,分4组修复(n=16),A空白未治疗组,B单纯材料组(植入β-TCP),C组织工程骨组(植入MSC+β-TCP),D血管化组织工程骨组(植入MSC+EC+β-TCP),各组交叉配对.术后4、8、12、16周行x线片、放射性核素骨显像、大体解剖、组织切片、生物力学等检查,观察各组骨缺损修复效能及移植物血管化情况.结果 D血管化组织工程骨组完美修复骨缺损,且修复效能及血管化情况优于C组织工程骨组,C组织工程骨组优于B单纯材料组,A空白组未能修复骨缺损.各组结果差异有统计学意义(均P＜0.05).结论 MSC与其诱导EC联合种植构筑的血管化组织工程骨能促进成骨过程和新生骨的血管化,显著提高组织工程骨修复大段骨缺损的能力.     

An experiment study of osteogenesis of Ad-VEGF165 transfected human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

Objective:To evaluate the effect of osteogenic potential on human marrow mesenchymal stem cells (hMSCs) transferred with human vascular endothelial growth factor(VEGF) gene by adenovirus. Methods :hMSCs were isolated from human marrow, cultured in vitro and randomly divided into 3 groups:Ad-VEGF165 group: adding 1×1010OPU/ml Ad-VEGF in hMSCs culture fluid after incubating 24 hours, changing into ordinary complete culture and continuing culturing; Positive control group: Cultured hMSCs with 1 nmol/L dexamethasone, 10 mmol/L glycerophosphate and 50 mg/L vitamin C,exchanging this conditioned medium twice a week; blank control group :no special treatment but culturing hMSCs in DMEM.To evaluate osteogenesis competence, Von Kossa's staining and a quantitative alkaline phosphates (ALP) activity analysis were performed after 2 weeks treatment. Results :The calcified nodes formed after 2 weeks treatment in Ad-VEGF165 group and Positive control group but not in blank control group. ALP activities in Ad-VEGF165 group,Positive control group and blank control group were (7.91 ± 0.90)u/L, (8.18 ± 0.76 u/L) and (3.46 ± 0.49)u/L respectively. The differences were no statistical significance between Ad-VEGF165 group and positive control group (P ＞ 0.05), but Ad-VEGF165 group and Positive control group were significantly different with blank control group (P ＜ 0.05). Conclusion:Adenovirus mediated VEGF165 gene can transfect hMSCs and promote osteogenesis of hMSCs.     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ在人垂肿瘤中的分布与表达

目的研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)在人垂体腺瘤组织中的分布和表达.方法免疫组织化学染色检测PPAR-γ在垂体腺瘤组织中的分布情况,Western blot方法分析PPAR-γ在正常垂体与垂体腺瘤中的表达水平.结果免疫组织化学染色显示,PPAR-γ主要分布于细胞核内.Western blot结果显示,PPAR-γ在垂体腺瘤中的表达水平显著高于正常垂体组织(P＜0.01),在促肾上腺皮质激素腺瘤中的表达水平显著高于其他内分泌类型垂体腺瘤(P＜0.05).结论PPAR-γ可能在肿瘤的发生、生长、侵袭中起重要作用,该受体有可能成为未来垂体腺瘤治疗的新靶点.     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学性质

目的：建立人骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）分离培养方法,观察细胞形态,探讨BM-MSCs生物学特征。 方法：从人骨髓中利用Percoll分离有核细胞,培养于含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中,台盼蓝拒染法测定细胞增殖状态。应用流式细胞仪测定细胞周期及细胞表面抗原特征。 结果;BM-MSCs具有纤维样细胞形态特征,独特的表型,即CD29、CD44、CD166和HLA-ABC阳性,CD34、CD45和HLA-DR阴性;细胞周期分析显示：12.8%处于S期,76.4%处于G₀/G₁期;细胞生长倍增时间为2~3 d。 结论：BM-MSC_S是一群均一的单克隆细胞,具有独特的增殖特征及表面标记。     

PPARα和IL-1βmRNA在妊娠期子宫肌层的表达及相关性

目的 探讨人类妊娠的不同阶段过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)和白细胞介素-1β( IL-1β)mRNA在子宫肌层的表达,以及在维持妊娠、发动分娩中的作用.方法 收集10例未孕(NP组)、10例未足月未临产(PL组)、20例足月未临产(TNL组)及20例足月临产(TL组)育龄期妇女的子宫平滑肌组织,采用荧光定量(real time) PCR技术检测PPARα及IL-1βmRNA的表达.以NP组作为对照,采用2△△CT法分析目的基因组间差异性表达.结果 PPARα在PL组的表达较其他各组均明显升高(P＜0.05),在TL组的表达降低(P＜0.05).IL-1β.在PL组的表达明显降低(P＜0.05),在TL组的表达与其他各组比较则明显升高(P＜0.05).TNL组PPARα及IL-1β的表达与NP组比较差异均无统计学意义(P＞0.05).PPARα与IL-1β呈负相关(r=-0.767,P＜0.05).结论 PPARα及IL-1β在妊娠的不同时期均有明显变化.抗炎因子PPARα可能在维持妊娠中起重要作用,促炎因子IL-1ββ可能参与分娩发动.     

他克莫司诱导的骨髓间充质干细胞成骨细胞分化和体内骨形成

目的研究免疫抑制剂他克莫司（FKS06）对大鼠骨髓来源的间充质干细胞（MSC）的成骨细胞分化诱导,及对MSCs结合多孔β三磷酸钙（β—TCP）的体内成骨作用。方法原代MSCs按实验目的随机分组。对照组生长培养液中加入L-抗坏血酸-2-磷酸（AsAp）和β-甘油磷酸（β—GP）;FKS06处理组在对照组基础上加入50nmol／LFK506。实验分成体外体内两部分相继进行。体外实验细胞分别于培养第4、8、12、16天时行碱性磷酸酶（APase）活性,钙含量,扫描电镜和骨钙素mRNA Northern印迹分析;体内实验将细胞载人多孔β—TCP立方块形成MSCs／β-TCP复合物,继续成骨诱导培养2周后植入大鼠背部皮下,4周和8周后取出复合物作组织学检查。结果FKS06处理组碱性磷酸酶活性、钙含量、骨钙素mRNA均明显高于对照组（均P〈0．05）;体内成骨情况亦明显优于对照组。结论免疫抑制剂FKS06能显著促进大鼠骨髓来源间充质干细胞（MSCs）的体外成骨细胞分化和动物体内继续成骨的作用,并提示FKS06可作为一种新型成骨生长因子,在临床有潜在的应用价值。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及生物特性的观察

目的：观察人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs)在体外培养的生物学特性和作为组织工程的种子细胞的可能性。方法：将人骨髓MSCs自骨髓中分离、纯化和培养，观察原代和传代培养的增殖及生长特征。结果：原代培养及传代培养显示，在体外培养条件下人骨髓MSCS有活跃的增殖能力。结论：体外获得的人骨髓MSCs的生物年龄较为年轻，可以为组织工程的进一步研究提供种子细胞。     

野生型Smad3基因促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的　探讨野生型Smad3基因对大鼠骨髓间充质干细胞 (MSC)增殖和成骨分化的影响以及作用机理。方法　脂质体介导稳定转染Smad3和Smad3△C ,间接免疫荧光试验鉴定 ;采用噻唑蓝 (MTT)检测Smad3转染对MSC增殖的影响 ;采用逆转录聚合酶链反应检测转染细胞中ALP和核心结合因子 (cbfa1)mRNA的表达 ,用对硝基苯磷酸盐 (PNP)法检测细胞ALP活性 ,用茜素红染色法检测细胞矿化能力 ,观察Smad3对MSC成骨分化的影响 ;用PD980 5 9选择性阻断非细胞外信号调节激酶(ERK)通路 ,观察ERK通路在Smad3调节MSC成骨分化中的作用。结果　稳定转染Smad3和Smad3△C的细胞中c Myc抗原阳性表达 ;Smad3 MSC增殖缓慢 ,细胞群体倍增时间延长 ,没有明显的对数生长期 ;Smad3 MSC中ALP和cbfa1mRNA的表达水平、ALP活性以及矿化能力明显高于Smad3△C MSC与V MSC ;加入PD980 5 9后 ,Smad3 MSC中ALP活性以及矿化能力有所减低 ,但与未加入PD980 5 9组相比 ,差异无显著意义 (P >0 0 5 )。结论　野生型Smad3基因抑制MSC的增殖 ,并通过非ERK通路促进MSC向成骨分化和成熟 ,是促进骨形成的重要成分。     

利用软骨细胞外基质来源的多孔支架与骨髓基质干细胞体外长期培养组织工程化软骨的试验研究

研究背景 关节软骨损伤临床常见,但损伤后自我修复能力极差,目前的修复方法均有其局限性。在先前的研究中,我们研制了关节软骨细胞外基质来源的多孔支架（Cartilage ECM-derived porous scaffold, CEDPS）并观察了并在裸鼠体内异位构建软骨。但在进一步可能的临床应用之前,应进一步评估其体外培养组织工程软骨的特点及可行性。 方法 本研究利用关节软骨细胞外基质来源的支架及骨髓基质干细胞体外长时间培养构建软骨组织。粉碎人关节软骨,脱细胞处理后差速离心法收集细胞外基质悬液,采用冷冻干燥技术制备三维多孔支架。扫描电镜及Micro-CT观察其微观结构,并进行细胞毒性试验,组织学观察,生化成分定量检测其胶原、氨基葡聚糖（GAG）、DNA含量,生物力学方法测量其干性及覆水状态下压缩弹性模量;骨髓基质干细胞经含TGF-β1, bFGF的条件培养基成软骨诱导后鉴定,种植到支架上,荧光显微镜及扫描电镜观察细胞黏附情况,Dead/Live免疫荧光染色观察支架内部细胞活性,体外培养1,3周后观察大体形态和组织学形态变化,同时行II型胶原免疫组织化学分析。 结果 制备的CEDPS支架无细胞碎片残留,软骨细胞外基质特异性染色阳性,具有相互贯通的三维孔隙结构;支架生化成分定量检测：总胶原含量为708.2?44.7μg/mg,GAG含量为254.7?25.9μg/mg;支架纵向压缩弹性模量E = 1.226?0.288MPa,覆水后压缩弹性模量E = 0.052?0.007MPa。体外培养的BMSCs-CEDPS复合体形成了类软骨样组织,Dead/Live染色表明支架内部均为活细胞,电镜检查结果表明细胞广泛均匀的分布在支架内部,呈圆形或椭圆形,在支架上增殖显著,细胞基质分泌明显。组织学结果表明蕃红花“O”、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,表明随着培养时间的增加,细胞在支架中增殖显著,细胞外有大量基质分泌。 结论 CEDPS支架在生化组成和结构上与软骨细胞外基质成分类似,去细胞彻底,具有良好的生物力学特性,是一种较为理想的软骨组织工程支架载体;成软骨诱导的BMSCs与CEDPS支架在体外可初步构建类软骨样组织。     

体外诱导恒河猴皮肤干细胞分化为结膜上皮细胞的实验研究

目的诱导体外培养、纯化的恒河猴皮肤干细胞向结膜上皮细胞分化,探索皮肤干细胞的可塑性。方法体外培养恒河猴皮肤干细胞,用Ⅳ型胶原纯化,纯化前后用流式细胞仪检测β1整合素和角蛋白15阳性细胞比例,纯化后的皮肤干细胞用细胞免疫荧光和逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）技术鉴定β1整合素和角蛋白15。皮肤干细胞转染绿色荧光蛋白基因,24h后挑选出有荧光的细胞,与人结膜上皮细胞共培养10d,再进行结膜上皮细胞的特异性抗原黏蛋白4和角蛋白4的鉴定,检测方法包括细胞免疫荧光和RT—PCR。结果体外培养的皮肤干细胞纯化后比例接近90％。细胞免疫荧光和RT—PCR检测β1整合素和角蛋白15阳性。转染绿色荧光蛋白基因24h后,细胞呈现绿色荧光,与结膜上皮细胞共培养10d后,细胞免疫荧光和RT—PCR检查黏蛋白4和角蛋白4阳性。结论在体外培养纯化的灵长类动物恒河猴皮肤干细胞,在适宜条件下,可诱导分化为有结膜上皮细胞特征的细胞。