丙型肝炎病毒抗原的免疫组化检测及方法学探讨

采用丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ区、Ｃ区、ＮＳ３区单克隆及多克隆抗体以及丙型肝炎患者血清及血清中ＩｇＧ抗体作为特异性第一抗体，分别应用ＬＳＡＤ、改良ＰＡＰ及直接酶标法对６５例丙型肝炎患者肝组织冰冻及石蜡包埋标本进行ＨＣＶ抗原检测，其中以ＮＳ３区抗体、ＬＳＡＢ法的检测结果较为理想（检出率２７．７％～２９．２％）。ＨＣＶ抗原呈肝细胞胞浆弥漫型、胞核型及胞浆类包涵体型表达。阳性肝细胞多呈单个散在分布。急性丙型肝炎比慢性丙型肝炎的ＨＣＶ抗原检出率更高且抗原颗粒的分布与病理损伤呈正相关，炎症区浸润的淋巴细胞中可见阳性颗粒；而慢性丙型肝炎肝组织中ＨＣＶ抗原与病理损伤无明显关联；支持急性丙型肝炎的肝细胞损伤由病毒的直接作用及免疫攻击协同所致，而慢性丙型肝炎则以免疫反应引起肝细胞持续损伤为主。胞浆弥漫型ＨＣＶ抗原表达是急性或活动性病变时的主要表达形式，而胞核型ＨＣＶ抗原表达多见于病变静止期。     

慢性乙型肝炎患者肝组织FasL表达与血清可溶性FasL水平的关系

目的：探讨慢性乙型肝炎患者肝组织中FasL表达与血清可溶性FasL水平的关系。方法：用免疫组化方法检测60例慢性乙型肝炎患者肝穿组织FasL的表达,同时用酶联免疫吸附试验检测血清可溶性FasL。结果：重度慢性乙型肝炎患者血清中sFasL水平＞中度＞轻度,各组间差异有显著意义（P＜0．01）;慢性乙型肝炎患者肝组织FasL表达的程度和血清sFasL水平与肝组织病变的活动性一致。结论：（1）肝组织炎症程度加重,肝组织FasL抗原的表达增强,同时血清中sFasL水平升高;（2）Fas介导的肝细胞凋亡在慢性乙型肝炎的发病机制中起重要作用,抑制肝细胞Fas表达有助于减轻肝细胞损伤程度。     

丙型肝炎病毒感染外周血单个核细胞的进一步研究

为进一步研究外周血单个核细胞 (PBMC)感染丙型肝炎病毒 (HCV)的状况。用逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)、地高辛标记 HCV探针作原位杂交和链酶亲和素 -生物素 (SABC)作免疫组化三项技术 ,检测血清和 PBMC中的 HCV RNA和 HCV NS5 抗原。结果显示 RT- PCR检测的 2 0例慢性丙型肝炎患者 ,除去 4例接受干扰素治疗者 ,余16例中有 14例 (87.5 % )血清 HCV RNA阳性 ,2例血清 HCV RNA阴性者的 PBMC- HCV RNA阳性。对 RT- PCR检测的 9例 PBMC- HCV RNA阳性患者 ,进一步用原位杂交和免疫组化技术 ,分别检测 PBMC中的 HCV RNA和HCV NS5 抗原。显示这几种方法的检测结果是基本一致的 ,呈正相关关系。患者的 PBMC中的 HCV RNA和 HCV NS5抗原呈散在颗粒状或弥漫分布 ,主要位于胞浆中 ,HCV NS5 抗原还分布于胞膜上。证实 HCV可以感染 PBMC,并在其中复制 ,复制部位在胞浆。     

慢性病毒性肝炎肝细胞凋亡与Fas抗原和病毒表达的相互关系

采用原位末端标记技术对一组慢性病毒性肝炎患者肝细胞凋亡状况进行研究，并探讨其与病毒和Fas抗原表达的关系。结果：31例患者，25例肝组织中检出末端标记阳性细胞，散布于肝小叶和肝窦内，部分炎症坏死灶中和胆管上皮细胞也可检出阳性细胞；组织炎症活动度较大者和病毒抗原阳性者凋亡指数较高；凋亡细胞可为病毒抗原阳性和阴性；Fas抗原阳性与阴性组间凋亡程度无显著差异。这种现象提示肝炎病毒可能主要通过间接途径向感染和非感染病毒的肝细胞传递死亡信号，其机制有待进一步研究。慢性病毒性肝炎肝细胞凋亡与Fas抗原和病毒表达的相互…     

原发性肝细胞癌组织中丙型肝炎病毒的检出及其相关意义的研究

目的 探讨丙型肝炎病毒（HCV）感染导致肝细胞癌变的可能机理。方法 应用抗－HCVNS3单克隆抗体和地高辛标记的HCV全基因组cDNA探针,对19例伴单一HCV感染的肝细胞癌石蜡组织切片进行了HCAg的免疫组化和原位杂交检测。结果 两种方法的阳性检出率分别为89．5％（17／19）和57．9％（11／19）。HCAg主要分布于癌细胞和癌旁肝细胞的胞浆和胞核内,呈局灶或弥漫型分布,癌旁组织表达较癌巢显著,核型分布在癌旁组织中常见;HCV RNA仅见于癌或癌旁肝细胞的胞浆中,呈散在及局灶分布,弥漫型分布少见。结论 本研究结果支持HCV感染可能导致原发性肝细胞癌的观点。HCAg在癌旁肝细胞和癌细胞核中的存在提示其可能对肝细胞核产生基因调节作用,这是否是HCV感染导致肝细胞癌变的可能机理之一,值得进一步研究阐明。     

丙型肝炎病毒核心抗原在肝细胞癌及癌旁组织中的表达

应用ＳＰ法（链霉菌抗生物素蛋白－过氧化酶连结法）对肝细胞癌（４６例）癌组织及癌旁组织（３８例）中丙型肝炎病毒核心抗原进行免疫组织化学染色，发现两者的检出率分别为２１．７％和３６．８％。阳性染色细胞呈弥漫、灶状和散在分布。抗原定位于肝细胞和肝癌细胞的胞浆内，少数有围核分布的特点。阳性染色多呈细颗粒状，少数呈均质状。癌旁组织抗原表达区域中有淋巴细胞浸润聚集。结果提示丙型肝炎病毒感染在肝细胞癌的发生中可能有一定的关联。     

丙型肝炎病毒感染者肝组织中丙型肝炎病毒RNA原位杂交研究

应用原位杂交（ＩＳＨ）方法检测了１２例丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者肝组织中ＨＣＶ ＲＮＡ，以研究丙肝病毒的定位及其与肝细胞病变的关系。结果：１２例患者中９例（７５％）阳性，阳性信号主要位于肝细胞浆中；切片经ＲＮＡ酶消化后进行杂交，阳性信号消失但ＤＮＡ酶预处理对结果无明显影响；阳性细胞可位于炎症坏死灶附近，但也可与炎症反应无明显关系。结果表明原位杂交方法对研究ＨＣＶ生物学特性及致病机制有一定价值。     

多抗原肽免疫血清体外阻断丙型肝炎病毒感染树鼩肝细胞的初步研究

目的：探讨多抗原肽（MAP）免疫血清在体外能否阻断丙型肝炎病毒（HCV）感染树Gu感染树Gu肝细胞，为研制HCV分子疫苗提供实验基础。方法：用兔抗MAP血清分别与两分感染血清按一定比例混合后接种于原代培养的树Gu肝细胞中，用逆转录聚合酶链反应（RR－PCR），免疫组化，原位杂交分别检测细胞内或上清中正负链RNA，细胞内HCV NS3抗原的表达情况，以及原位检测细胞内HCV负链RNA，结果：1份HCV RNA阳性血清与兔抗MAP血清按1：1混合后接种于培养的树Gu肝细胞中，细胞内可检出HCV正负链RNA，并有HCV NS3抗原的表达，而另外1份HCV RNA阳性血清与兔抗MAP血清按1：1，5：1，10：1混合后接种于培养的树Gu肝细胞中，细胞内未检测出HCV正负链RNA，也未见特异性抗原表达，结论：兔抗MAP血清在体外能部分阻断HCV感染。     

丙型肝炎患者肝组织中病毒抗原检测

目的研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）抗原在患者肝组织中的分布状况及其相互关系。方法采取免疫组织化学方法，用多克隆抗－ＨＣＶ和单克隆抗－ＨＣＶ－ＮＳ３、抗－ＨＣＶ－ＮＳ５，对１０７例ＨＣＶ感染患者肝组织中ＨＣＶ抗原进行检测。结果应用三种抗体均从ＨＣＶ患者肝组织中检出相应抗原，检出率分别为３８．３％，２８．０％和５２．３％；阳性颗粒定位于肝细胞浆；阳性细胞分布呈散在、弥漫状和簇状；ＨＣＶ－ＮＳ３的表达与炎症反应无明显解剖学关系，ＨＣＶ－ＮＳ５阳性细胞较常见位于炎症灶旁或灶中。结论ＨＣＶ各成分在肝组织中的表达水平存在差别；ＨＣＶ－ＮＳ５的表达可能与ＨＣＶ的致病机制有关。     

丙型肝炎肝细胞凋亡的电镜和免疫组化研究

探讨丙型肝炎肝细胞凋亡与Ｆａｓ抗原表达及病理损伤的关系。方法应用电镜和免疫组化方法检测了２３例慢性丙型肝炎患者的肝组织。结果凋亡肝细胞呈多种形态学改变；Ｆａｓ抗原中，强度表达及组织炎症活动度积分高者，细胞凋亡指数增高。     

Fas在HDV致病机制中的作用

目的：通过研究丁型肝炎病人肝组织Ｆａｓ和ＨＤＡｇ表达及关系,了解Ｆａｓ与ＨＤＶ致病的相关性。方法：应用免疫组化单、双标记技术,检测４８例丁型肝炎病人肝组织Ｆａｓ、ＨＤＡｇ表达,以５４例乙型肝炎病人肝组织Ｆａｓ表达作对照。结果：Ｆａｓ以肝细胞浆表达为主,ＨＤＡｇ以肝细胞核表达为主,二抗原达及分布呈一致性。各临床类型肝炎中Ｆａｓ和ＨＤＡｇ表达有统计学判别意义,两种抗原的分析的表达强度与肝组织炎症活动和     

丁型肝炎重型化机制中Fas/FasL的作用

探讨Ｆａｓ／ＦａｓＬ途径介导的肝细胞凋亡在丁型肝炎重化机制中的作用。方法：采用兔疫组化双重染色和连续切征技术,检测４８例丁型肝炎病人肝组织丁型肝炎病毒抗原ＨＤＡｇ、Ｆａｓ／ＦａｓＬ表达,以５４例乙型肝炎作疾病对照,结果：Ｆａｓ以肝细胞浆表达与为主,ＨＤＡｇ以核浆型表达为主,两抗原表达及分布有相关性,ＦａｓＬ主要表达在浸润淋巴细胞浆,肝细胞核,与ＨＤＡｇ表达及分布不全一致,丁型肝炎Ｆａｓ、ＦａｓＬ检     

丙型肝炎患者外周血单个核细胞HCV和Fas抗原检测

目的：探讨丙型肝炎（丙型）患者外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）内丙型肝炎病毒抗原（ＨＣＶＡｇ）及Ｆａｓ抗原（ＦａｓＡｇ）表达状况及意义。方法：采用ＨＣＶ核心区及ＮＳ３区单克隆抗体,对２８例慢性丙肝患者ＰＢＭＣｓ进行免疫组化检测,并同步检测ＦａｓＡｇ。结果：ＨＣＶＡｇ及ＦａｓＡｇ阳性率分别为８５．７％（２４／２８）和８２．２（２３／２８）,经相关分析显示。两者表达呈显著正相关（ｒ＝０．５４６,Ｐ〈０．     

原发性肝细胞癌组织中丙型肝炎病毒的检出及其相关意义的研究

目的　探讨丙型肝炎病毒 (HCV)感染导致肝细胞癌变的可能机理。方法　应用抗 - HCV NS3单克隆抗体和地高辛标记的 HCV全基因组 c DNA探针 ,对 19例伴单一 HCV感染的肝细胞癌石蜡组织切片进行了HCAg的免疫组化和原位杂交检测。结果　两种方法的阳性检出率分别为 89.5 % (17/19)和 5 7.9% (11/19)。HCAg主要分布于癌细胞和癌旁肝细胞的胞浆和胞核内 ,呈局灶或弥漫型分布 ,癌旁组织表达较癌巢显著 ,核型分布在癌旁组织中常见 ;HCV RNA仅见于癌或癌旁肝细胞的胞浆中 ,呈散在及局灶分布 ,弥漫型分布少见。结论　本研究结果支持 HCV感染可能导致原发性肝细胞癌的观点。 HCAg在癌旁肝细胞和癌细胞胞核中的存在提示其可能对肝细胞核产生基因调节作用 ,这是否是 HCV感染导致肝细胞癌变的可能机理之一 ,值得进一步研究阐明。     

丙型肝炎病毒核心抗原的转位表达与肝（癌）细胞凋亡的关系

目的　探讨丙型肝炎病毒核心抗原的转位表达与肝(癌 )细胞凋亡的关系及其意义 .方法　采用免疫组织化学方法检测 HCV核心区抗原和 NS3区抗原在肝硬变 (L C)和肝细胞肝癌 (HCC)组织中的分布 ,同时对连续切片进行原位凋亡检测并计算凋亡指数 .结果　 HCV核心区抗原定位于肝细胞或肝癌细胞的胞质或胞核中 ,在 L C组织中 ,核心抗原呈弥漫或灶状分布于肝细胞胞质 ,偶见胞核阳性的肝细胞 ,阳性率为 6 0 .7% ;核心抗原在癌组织中以核阳性分布为主 ,阳性率为 37.6 % ,癌旁肝组织以胞质阳性为多见 .HCC中 HCV核心抗原的核阳性率 (75 .0 % ,15例 / 2 0例 )明显高于其在 L C(17.7% ,6例 / 34例 )及癌旁肝组织 (11.8% ,2例 / 17例 )中的阳性率 (P<0 .0 5 ) ;在 HCC中 ,HCV核心抗原核转位表达的癌组织的 AI值 (0 .174± 0 .0 93)显著低于胞质阳性的癌组织 (0 .5 12± 0 .113,P<0 .0 1) . HCV NS3区抗原定位于肝细胞或肝癌细胞的胞质中 ,在 L C和 HCC组织中的阳性率分别为 5 3.6 %和 39.6 % .未发现 HCV NS3区抗原的表达与肝(癌 )细胞凋亡的相关性 .结论　 HCV感染与我国 L C,HCC的发生关系密切 ,HCV核心抗原在肝癌组织中常发生核转位表达 ,这种核转位表达抑制了肿瘤细胞发生凋亡 ,从而促进肿瘤组织的进一步恶化     

体外培养人肝癌细胞系7721中HCV复制和表达特性

建立支持ＨＣＶ体外长期复制的细胞培养体系,研究其体外复制和表达特性。方法：将ＨＣＶ感染血清接种人肝癌细胞系７７２１后,以逆转录－聚合酶链反应、免疫组化、原位杂交检测细胞内ＨＣＶ的感染和复制情况。结果细胞内和培养上清中在孵育后的３月余均可间断地检测出ＨＣＶ正链和／或负链ＲＮＡ,多种ＨＣＶ抗原在细胞内能稳定有达;ＨＣＶ ＲＮＡ和抗原多位于胞浆中,结论ＨＣＶ在７７２１细胞系中的复制和表达与体内感染状态接     

Hp感染者胃粘膜癌前病变细胞凋亡与Fas抗原表达的关系

目的　研究幽门螺杆菌 (Hp)感染后胃粘膜癌前病变中Fas抗原表达状态及其与细胞凋亡的关系 ,了解Hp在胃癌发生过程中的作用。方法　采用免疫组织化学等方法检测 83例经病理证实为慢性胃炎患者胃粘膜上皮细胞中Fas抗原的表达情况 ,并采用凋亡细胞原位检测方法对组织切片中的凋亡细胞进行观察和比较。结果　在浅表性胃炎、萎缩性胃炎、肠化生及异型增生中 ,Fas抗原表达率分别为 2 0 .0 0 %、36 .36 %、73.33%、4 3.75 % ,Fas抗原在肠化生组织中的表达率显著高于浅表性胃炎、萎缩性胃炎及异型增生 (P <0 .0 1及P <0 .0 5 )。Hp感染者Fas抗原表达率为 6 0 .71% ,显著高于未感染者的 2 2 .2 2 % (P <0 .0 1)。在萎缩、肠化生及异型增生等癌前病变中 ,Hp感染者与未感染者Fas抗原表达率分别为 6 5 .96 %及 2 8.5 7% (P <0 .0 1)。凋亡细胞原位检测结果显示 ,Fas抗原表达阳性肠化生和异型增生组织中的凋亡细胞指数显著高于Fas抗原阴性组 (P <0 .0 5及P <0 .0 1)。结论　Hp感染对Fas抗原表达有一定的影响 ,Fas基因对胃粘膜上皮细胞凋亡具有促进性调控作用 ,Hp感染可促进Fas抗原表达增加 ,这可能是Hp感染诱导胃粘膜上皮细胞凋亡的机制之一。     

Immunohistochemical detection of hepatitis C virus antigen from hepatocellular carcinoma]

To investigate the infection of HCV and the expression of HCV antigen (HCAg) in HCC, immunohistochemical protocol was performed on tumorous liver tissues from 40 patients with HCC to detect HCAg and hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) simultaneously. The results showed that the positive rates for HCAg and HBsAg were 17.5% (7/40) and 70% (28/40) respectively. HBsAg and HCAg were simultaneously detected in six of 40 cases and only one case had HCAg positive alone in the liver tumorous tissue. The positive signals were localized in diffuse cytoplasm of hepatocytes and the positively stained cells were mainly distributed in local pattern. The results suggested that HCV infection did exist in some cases of HCC, so HCV might be a viral risk factor in addition to HBV in the genesis of HCC in China.     

肝细胞癌组织中丙肝病毒抗原及HBsAg的免疫组化检测

为了解丙肝病毒（ＨＣＶ）感染与我国肝细胞癌（ＨＣＣ）之间的关系,以及ＨＣＶ抗原成分（ＨＣＡｇ的）在ＨＣＣ组织中的分布状况,应用鼠抗ＨＣＶ单克隆抗体,采用免疫组化技术检测ＨＣＣ组织中ＨＣＡｇ的表达,同时检测了乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）。结果：４０例ＨＣＣ标本组织中ＨＣＡｇ、ＨＢｓＡｇ检出率分别为１７．５％（７／４０）和７０％（２８／４０）,其中单一ＨＣＡｇ阳性者仅１例,ＨＣＡｇ和ＨＢｓＡｇ同时存在的检出率为１５％（６／４０）。镜下见ＨＣＡｇ呈细颗粒状分布于细胞胞浆,ＨＣＡｇ阳性细胞以局灶型分布为主。提示我国部分肝癌患者的癌组织中确实存在ＨＣＶ,ＨＣＶ感染可能是除乙肝病毒以外,导致我国ＨＣＣ发生的另一相关因素。