呼吸道合胞病毒感染促进哮喘小鼠气道分泌TSLP和Th2炎症反应

目的 探讨呼吸道合胞病毒(RSV)对哮喘小鼠胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)分泌的影响,以探索RSV对哮喘小鼠Th1/Th2免疫反应的调节作用.方法 雌性BALB/c小鼠32只.随机分成4组,分别为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组、鸡卵白蛋白(OVA)组、RSV组、OVA/RSV组;应用OVA腹腔注射致敏、OVA气道雾化结合RSV滴鼻激发哮喘;无创肺功能检测小鼠气道反应性,ELISA法检测小鼠血清IL-4、IFN-γ、IL-5、IL-13水平;ELISA法检测气管灌洗液(BALF)TSLP含量并进行细胞分类计数;小鼠肺组织病理观察炎症反应,免疫组化观察小鼠气管上皮细胞TSLP表达水平.结果 RSV感染促进哮喘小鼠呼吸道分泌TSLP增加,OVA/RSV组小鼠TSLP浓度达(2.13±0.05)ng/ml,高于其他组(P<0.01);同时促进IL-4、IL-5、IL-13等Th2型细胞因子的分泌,并增加IFN-γ分泌;0VA/RSV组BALF细胞总数、嗜酸性粒细胞数、中性粒细胞数、淋巴细胞数与其他各组比较均明显增加;无创肺功能检测显示OVA/RSV组小鼠气道反应性明显增高,乙酰甲胆碱浓度达6.25 mg/ml时,Penh值(318.66±50.87)明显增加,与其他各组比较具有统计学意义(P<0.01);病理观察显示RSV感染明显加重哮喘小鼠气道炎症细胞浸润;免疫组化染色证实RSV/OVA组小鼠气道上皮细胞TSLP表达量较高.结论 RSV感染可以增加小鼠气道上皮细胞表达TSLP,促进Th2细胞因子的表达,加重哮喘小鼠肺部Th2炎症反应.     

聚肌胞对RSV感染哮喘加重小鼠气道分泌TSLP和炎症的影响

目的探讨聚肌胞(poly I:C)对呼吸道合胞病毒(RSV)感染哮喘加重小鼠气道分泌胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)和气道炎症的影响。方法雌性BALB/c小鼠32只,随机分成4组:分别为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组、鸡卵白蛋白(OVA)组、OVA/RSV组、OVA/RSV/polyI:C组;应用OVA腹腔注射致敏、OVA气道雾化结合RSV滴鼻激发哮喘,聚肌胞1mg/kg肌肉注射;无创肺功能检测各组小鼠气道反应性;ELISA法检测小鼠血清IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ水平;ELISA法检测气管灌洗液(BALF)中TSLP含量;BALF行细胞分类计数;病理观察小鼠肺组织炎症反应,免疫组化观察小鼠气道上皮细胞TSLP表达水平。结果无创肺功能检测显示聚肌胞抑制RSV感染哮喘加重小鼠气道反应性的增高,OVA/RSV/polyI:C组小鼠Penh值明显低于OVA/RSV组(P<0.01);OVA/RSV/polyI:C组小鼠血清IL-4、IL-5、IL-13和BALF中TSLP浓度均明显低于OVA/RSV组(P<0.05);OVA/RSV/poly I:C组小鼠BALF细胞总数、嗜酸性粒细胞数及淋巴细胞数明显少于OVA/RSV组(P<0.05);病理观察显示聚肌胞减轻RSV感染哮喘小鼠气道炎症细胞浸润;免疫组化染色证实聚肌胞抑制RSV感染哮喘小鼠气道上皮细胞TSLP表达。结论聚肌胞前期注射减少RSV感染哮喘加重小鼠气道上皮细胞表达TSLP,抑制哮喘小鼠气道炎症反应。     

呼吸道合胞病毒感染BALB/c鼠活化TLR7介导的抗病毒作用研究

目的探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染BALB/c鼠后,肺内Toll样受体7(TLR7)的水平变化,初步研究TLR7活化在RSV感染中介导产生的I型干扰素(IFN)抗病毒作用及其可能的调控机制。方法以RSV滴鼻感染BALB/c鼠建立急性肺炎模型,并预先给予TLR7特异性激动剂咪喹莫特(Imiquimod)处理,分别于感染后4、8、12、24 h不同时间点处死小鼠取肺组织,并以未感染病毒的BALB/c鼠为正常对照组。①HE染色观察肺的病理学改变;②用TRIzol提取肺组织总RNA,RT-PCR法检测鼠肺内TLR7、干扰素调节因子3(IRF3)、干扰素调节因子7(IRF7),干扰素α(IFN-α),干扰素β(IFN-β)及RSV融合蛋白基因(F基因)mRNA的表达;③Western blot法检测鼠肺组织TLR7蛋白的表达变化;④空斑形成实验(PFU)测定各组不同时间点肺组织匀浆中RSV滴度。结果①HE染色显示肺部炎性细胞浸润及肺泡结构破坏程度随感染时间延长而加重,经Imiquimod干预后肺部炎性细胞浸润程度及肺泡结构破坏较RSV感染组明显减轻;②在mRNA转录水平,RSV感染早期,感染组上调TLR7、IRF3/7、IFN-α/β、RSV F基因的表达;在预先给予TLR7特异性激动剂Imi-quimod处理组,TLR7、IRF7、IFN-α的mRNA比感染组相同时间点的表达量明显升高,且升高有显著性差异,而IRF3、IFN-β表达量在Imiquimod干预后与RSV感染组相比升高不明显;而RSV F基因的mRNA表达量较RSV感染组明显下降;③在蛋白水平,RSV感染组上调TLR7蛋白的表达;在预先给予TLR7特异性激动剂Imiquimod处理组,TLR7蛋白表达量较感染组显著升高;④RSV感染BALB/c鼠肺后,肺组织匀浆中RSV滴度随感染时间的延长而增加;给予TLR7激动剂Imiquimod处理组,RSV复制滴度水平较感染组明显减少。结论 RSV感染BALB/c鼠后通过活化TLR7,诱导Ⅰ型IFN的产生。用Imiquimod激动TLR7后,Ⅰ型IFN表达量较RSV感染组明显升高,RSV F基因和肺组织匀浆中RSV滴度水平明显减少,以及肺部炎症减轻,表明RSV引起的抗病毒免疫机制与TLR7活化的转导途径有关;而且激动TLR7后,IRF7和IFN-α的表达较IRF3和IFN-β明显升高,表明了IFN-α可能是主要通过IRF7通路由TLR7诱导产生的最主要Ⅰ型IFN。     

呼吸道合胞病毒感染加重哮喘模型小鼠气道炎症及气道阻力的观察

【】 目的 探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染加重哮喘模型小鼠气道炎症及气道阻力变化的影响。方法 6～8周龄雄性BalB/c小鼠30只,每组10只,随机分为空白组、OVA组(哮喘模型组)、OVA/RSV组(RSV+哮喘模型组)3组。OVA组用卵清蛋白(OVA)致敏和激发;OVA/RSV组在OVA 致敏后,隔日用RSV滴鼻,连续3次,复制急性病毒感染哮喘模型;空白组予等量PBS。末次激发24h后,用小鼠动物呼吸机(Buxco RC系统)检测小鼠气道反应性;收集支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞学分析;留取肺组织,进行HE染色、PAS染色、VG染色,观察肺组织炎症反应。结果 OVA组肺功能和BALF嗜酸粒细胞比例(EOS％)与正常组相比差异有显著性 (P<0.05);OVA/RSV组肺功能和BALF中嗜酸粒细胞比例(EOS％) 与正常组相比有极显著性差异(P<0.01);OVA/RSV组气道反应性及BALF中嗜酸粒细胞比例(EOS％)与哮喘组相比差异有显著性 (P<0.05)。OVA组小鼠肺组织有炎性细胞浸润,气道可见粘液分泌物,气道周围可见胶原增生。OVA/RSV组小鼠肺组织有明显炎性细胞浸润,肺泡腔明显狭窄,毛细血管扩张充血,气道可见明显粘液分泌物,气道周围胶原增生明显。结论 呼吸道合胞病毒感染能明显增加重哮喘模型小鼠肺部组织炎症反应同时气道阻力明显增高。     

心得安与乙酰甲胆碱气道反应性的对比观察

作者采用气道吸入不同浓度DL-盐酸心得安测定12例哮喘患者的气道反应性,并与乙酰甲胆碱吸入激发试验进行了对比。结果表明:12例对乙酰甲胆碱激发呈阳性反应,其中11例对心得安也呈阳性反应,阳性率为91.7％,心得安PC_(20)与乙酰甲胆碱PC_(20)无关(r=0.3770,P>0.05),与基础FEV_1也无相关性(r=0.1765,P>0.05),但乙酰甲胆碱PC_(20)与基础FEV_1呈正相关(r=0.6223,P<0.05)。以上结果提示,心得安吸入激发试验可作为非特异性气道反应性测定方法,为哮喘的诊断提供客观依据。其激发机制与乙酰甲胆碱不同,因而在哮喘发病机理和治疗的研究中有不同的意义。     

The antiviral role of Toll-like receptor 7 in BALB/c mice infected with respiratory syncytial virus

目的 探讨呼吸道合胞病毒(RSV) 感染BALB/c鼠后,肺内Toll样受体7(TLR7)的水平变化及其介导所产生的I型干扰素(IFN)抗病毒作用.方法 48只BALB/c鼠,随机分为正常对照组、RSV感染组、咪喹莫特干预组.以RSV活病毒滴鼻感染BALB/c鼠,诱导急性肺炎模型,并预先给予TLR7特异性激动剂咪喹莫特处理,分别于感染后4、8、12和24 h不同时间点,用半定量RT-PCR法检测鼠肺TLR7、IFN-α/β、RSV融合蛋白 (RSV F蛋白)的mRNA表达,HE染色观察肺的病理学改变.结果 ① RSV感染早期,TLR7、IFN-α/β、RSV F蛋白的mRNA表达均升高,并与RSV感染之间存在时间依赖性关系;肺的炎性细胞浸润及肺泡结构破坏程度与RSV感染时间相关;② 咪喹莫特干预组预先给予TLR7激动剂咪喹莫特处理后,再行相同RSV感染,TLR7、IFN-α/β的mRNA表达量进一步升高,但RSV F蛋白的mRNA表达下降;肺的炎性细胞浸润程度及肺泡结构破坏较RSV感染组明显减轻.结论 RSV感染可活化上调BALB/c鼠肺组织中TLR7表达,其表达量与感染之间存在时间依赖关系;其介导产生的Ⅰ型IFN起着抗病毒作用,在一定程度上可抑制病毒的增殖水平,使肺部炎症减轻.     

呼吸道合胞病毒感染BALB/c鼠活化Toll样受体7介导的抗病毒作用研究

目的探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染BALB/c鼠后,肺内Toll样受体7(TLR7)的水平变化及其介导所产生的I型干扰素(IFN)抗病毒作用。方法 48只BALB/c鼠,随机分为正常对照组、RSV感染组、咪喹莫特干预组。以RSV活病毒滴鼻感染BALB/c鼠,诱导急性肺炎模型,并预先给予TLR7特异性激动剂咪喹莫特处理,分别于感染后4、8、12和24 h不同时间点,用半定量RT-PCR法检测鼠肺TLR7、IFN-α/β、RSV融合蛋白(RSV F蛋白)的mRNA表达,HE染色观察肺的病理学改变。结果①RSV感染早期,TLR7、IFN-α/β、RSV F蛋白的mRNA表达均升高,并与RSV感染之间存在时间依赖性关系;肺的炎性细胞浸润及肺泡结构破坏程度与RSV感染时间相关;②咪喹莫特干预组预先给予TLR7激动剂咪喹莫特处理后,再行相同RSV感染,TLR7、IFN-α/β的mRNA表达量进一步升高,但RSV F蛋白的mR-NA表达下降;肺的炎性细胞浸润程度及肺泡结构破坏较RSV感染组明显减轻。结论 RSV感染可活化上调BALB/c鼠肺组织中TLR7表达,其表达量与感染之间存在时间依赖关系;其介导产生的Ⅰ型IFN起着抗病毒作用,在一定程度上可抑制病毒的增殖水平,使肺部炎症减轻。     

利巴韦林对呼吸道合胞病毒感染哮喘加重小鼠胸腺基质淋巴细胞生成素分泌的影响

目的 明确利巴韦林(RIB)在呼吸道合胞病毒(RSV)感染哮喘加重治疗中的作用.方法 (1)细胞试验:人支气管上皮细胞16HBE随机分为RSV组、RSV/RIB组、RIB组和对照组,每组8瓶.感染细胞用RSV病毒液的感染复数(MOI)为2;RIB浓度为50 μg/ml.蛋白质印迹法检测各组细胞胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)蛋白表达.(2)动物实验:雌性BALB/c小鼠随机分为卵清蛋白(OVA)组、OVA/RSV组、OVA/RSV/RIB组和对照组,每组8只.应用OVA腹腔注射致敏、OVA雾化吸入结合RSV病毒液滴鼻激发哮喘,RIB 10 mg/kg肌内注射.动物肺功能分析系统检测各组小鼠气道反应性;酶联免疫吸附试验检测小鼠血清白细胞介素4(IL-4)、IL-5、IL-13、干扰素γ(IFN-γ)和支气管肺泡灌洗液(BALF)TSLP浓度;取肺组织观察炎症反应和气道上皮细胞TSLP表达水平.结果 细胞试验显示RSV、RSV/RIB、RIB和对照组TSLP蛋白表达量分别为1.97±0.22、1.16±0.19、0.99±0.17和0.89±0.08,RSV/RIB组明显低于RSV组(P＜0.01).动物实验显示OVA/RSV/RIB组小鼠气道反应性明显低于OVA/RSV组(P＜0.01);血清IL-4、IL-5、IFN-γ和BALF中TSLP浓度分别为(109.7±41.9)、(220.8±30.9)、(13.0±3.4)和(1945±82)pg/ml,均明显低于OVA/RSV组[分别为(274.2±103.7)、(293.3±46.1)、(30.1±5.7)、(2127±46)pg/ml,均P＜0.01];气道炎症细胞浸润和气道上皮细胞TSLP表达均明显少于OVA/RSV组.结论 RIB可以抑制RSV感染引起的TSLP分泌增加和哮喘加重.     

应用基因缺失小鼠研究TLR4在LPS诱导的急性肾衰竭中的作用

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)在脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肾衰竭(ARF)肾脏中的作用机制。方法:以TLR4基因缺失的C3H/HeJ小鼠和其野生正常对照的C3H/HeN小鼠为实验对象。实验分TLR4+(C3H/HeN)组、TLR4-(C3H/HeJ)组,单次性腹腔注射LPS(15 mg/kg)诱导小鼠ARF模型。24 h后检测血清肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)值来评估肾功能;Nomura评分法对肾组织病理改变进行半定量评分;免疫组织化学SABC法检测TLR4在两组小鼠肾组织中的表达、RT-PCR法检测肾组织总TLR4 mRNA的表达变化、免疫蛋白印迹检测肾组织总TLR4蛋白水平;TUNEL法检测肾脏组织的凋亡情况。结果:TLR4+(C3H/HeN)组的Cr、BUN分别为(202.26±11.08)μmol/L(、20.36±1.52)mmol/L,TLR4-(C3H/HeJ)组的Cr、BUN分别为(109.67±13.32)μmol/L(、6.42±0.41)mmol/L,差异有显著性(P<0.01);TLR4-(C3H/HeJ)组的肾组织结构正常,无明显的病理改变,而TLR4+(C3H/HeN)组小鼠肾小管呈轻中度的病理改变,主要表现为近端肾小管管腔扩大、空泡形成等;与TLR4-(C3H/HeJ)组相比,TLR4+(C3H/HeN)组的TLR4蛋白及mRNA表达明显上调;TUNEL法显示凋亡小体主要出现在TLR4+(C3H/HeN)组小鼠肾脏的近端小管及管周围,肾小球无明显凋亡小体出现,TLR4-(C3H/HeJ)组小鼠肾组织中未检测到凋亡小体,二者平均吸光度值分别为(0.117±0.008)和(0.038±0.003),差异有显著性(P<0.001)。结论:TLR4在LPS诱导的小鼠急性肾功能衰竭的发病中起一定作用。LPS可能通过激活TLR4信号转导途径引起肾组织中肾小管上皮细胞凋亡过度,肾小管上皮细胞数量减少,从而导致急性肾功能衰竭的发生。     

TLR4在晚发型新生儿败血症患儿群体中的表达与监测价值

目的：研究Toll样受体4(TLR4)在晚发型新生儿败血症患儿群体中的表达作用与监测价值。方法回顾性分析2015年1月至2016年2月于我院收治的33例晚发型新生儿败血症患者(观察组)的临床资料,另取同期33例健康体检儿作为对照组。观察组患儿根据感染病原体不同分为革兰氏阳性菌感染组(阳性组20例),革兰氏阴性菌感染组(阴性组13例)。分别对比三组受检者的TLR4 mRNA含量以及C反应蛋白(CRP)水平,并用Spearman法作TLR4 mRNA与CRP的相关性分析。结果观察组新生儿TLR4 mRNA表达为(1.83±0.25),明显高于对照组的(0.31±0.08),差异有统计学意义(P<0.05);阳性组新生儿TLR4 mRNA表达为(1.74±0.25),明显低于阴性组的(1.95±0.26),差异有统计学意义(P<0.05);阳性组和阴性组CRP水平分别为(53.42±23.11) mg/L及(46.87±18.56) mg/L,均明显高于对照组的(2.79±1.94) mg/L,差异均有统计学意义(P<0.05);TLR4 mRNA含量与CPR水平呈显著正相关(r=0.832,P=0.000)。结论临床中通过监测TLR4有利于早期诊断晚发型新生儿败血症,特别是在诊断革兰阴性菌感染所致的败血症中具有更高的临床诊断价值。