日本血吸虫Calpain蛋白免疫原性研究

目的：探讨日本血吸虫疫苗候选分子Calpain蛋白的抗原性及其所诱导的免疫应答类型。方法：用Genetyx—MAC9．0分析Calpain肽链的亲水性，在亲水性区域以9个氨基酸为肽链单位的固相重叠肽链库(每相邻两个肽链之间仅有一个氨基酸不同)被Auto—spot Robot制备，用Dot—ELISA在合成的肽链库上筛选B细胞表位，含有B细胞表位的肽链免疫BALB／c小鼠，ELISA鉴别特异性IgG抗体亚类的产生。结果：由758个氨基酸组成的日本血吸虫Calpain蛋白含有两个主要的亲水区，其存在区域分别在氨基酸229～375和555～613；测定合成的肽链文库，在亲水区内筛选出4个B细胞的表位，分别是氨基酸234～251(YAHISGGT)；290～297(CLMGCSIH)；338～346(PWGDSHEW)：358～364(AWCDGA PQ)；与对照组比较，免疫组鼠血清中IgG1、IgG2a和IgG2b特异性抗体有显著性意义的上升。结论：日本血吸虫Calpain是一个具有免疫原性的蛋白，能够激发宿主产生高水平的免疫球蛋白，提示Calpain可以发展成为日本血吸虫病的诊断抗原和日本血吸虫疫苗候选分子。     

日本血吸虫铁蛋白基因的筛选,克隆与表达

采用Ｓｊ未成熟虫卵抗原超免疫兔血清对Ｓｊ成虫ｃＤＮＡ文库进行筛选，并对可能具有抗日本血吸虫生殖／卵胚发育潜能的抗原汾子进行克隆，表达。常规法免疫筛选Ｓｊ成虫文库，获得单个阳性克隆，ＰＣＲ扩增后琼脂糖电泳测定基因大小，ＤＮＡ测序，基因库搜索，找出同源基因。共鉴定出６个不同的基因克隆，选择其中的铁蛋白基因亚克隆于ｐＧＭＣ载体，重组蛋白以ＧＭＣＳＦ（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）－ＳｊＦｅｒ融合蛋白的形成     

修饰后日本血吸虫Sjc-97基因的真核表达及其免疫原性

目的:研究日本血吸虫大陆株副肌球蛋白基因第3区域片段(Sjc-97f3)毕氏酵母表达产物的免疫原性.方法:根据毕氏酵母密码子使用频率重新设计Sjc-97核苷酸序列,依据不对称PCR原理人工合成Sjc-97f3,并在毕氏酵母中表达.表达产物通过Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析方法纯化,再分别与ISA720和Al(OH)3佐剂乳化后,免疫C57BL/6和昆明小鼠,通过尾蚴膜反应和ELISA反应检测特异性抗体.结果:Sjc-97f3基因在毕氏酵母中获得了高水平分泌表达,其表达产物能与日本血吸虫免疫血清进行特异性免疫反应.经与佐剂乳化后,该蛋白具有良好的免疫原性.ELISA结果显示重组蛋白在小鼠体内可激发明显的抗体反应,但2种佐剂所诱导的抗体水平以ISA720佐剂为高; 该抗原在不同品系小鼠中的抗体水平存在显著差异(P<0.01),昆明鼠的抗血清滴度远高于C57BL/6小鼠.小鼠免疫血清能识别日本血吸虫表面抗原,产生特异的尾蚴膜反应. 结论:密码子优化的Sjc-97f3在毕氏酵母中获得高效表达,其产物具有良好的免疫原性.     

日本血吸虫TGF-β受体Ⅰ基因胞外段的克隆与表达

目的获得日本血吸虫TGF-β受体I胞外段(SjTβRIout)的序列,行原核克隆和表达,并分析其蛋白的免疫学功能。方法应用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法获得SjTβRI基因cDNA部分序列,用RT-PCR方法扩增SjTβRI胞外段(SjTβRIout)基因,构建pET28a(+)重组原核表达载体,并测序鉴定。将质粒转入大肠埃希菌,IPTG诱导表达,并使用Ni离子亲和层析并透析处理获得纯化重组蛋白。使用纯化蛋白与弗氏佐剂共同免疫SD大鼠获得抗血清,使用ELISA方法检测血清中SjTβRIout特异抗体IgG含量。结果成功构建SjTβRIout原核表达载体。测序鉴定显示SjTβRIout包含399bp,编码133个氨基酸,并且与曼氏血吸虫TGF-β受体I的同源性较高。重组蛋白经SDS-PAGE分析,显示其相对分子质量约为20000,与目的基因编码蛋白的预测分子量相符。经重组蛋白免疫的SD大鼠产生高效价(>1:100000000)的抗原特异性IgG抗体。结论首次获得pET28a(+)-SjTβRIout的重组蛋白,并且证明其具有良好的免疫原性。     

日本血吸虫卵壳蛋白编码基因的扩增和克隆

目的　克隆日本血吸虫卵壳蛋白基因 ,以研究其在诊断和作为候选疫苗分子的作用。方法　设计合成引物 ,以日本血吸虫雌性成虫cDNA第一链为模板 ,用PCR法扩增日本血吸虫卵壳蛋白 (SchistosomajaponicumeggshellproteinSjEP)基因编码序列 ,并克隆入pGEM T质粒载体。结果　PCR法扩增出大小为 62 4bp的单一条带 ,将其克隆入载体获重组质粒 pGEM T SjEP ,经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增 ,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段。结论　日本血吸虫卵壳蛋白的编码基因重组质粒的成功构建 ,为进一步研究提供了条件。     

日本血吸虫thioredoxin基因的克隆和表达

目的 结合分子生物学和生物信息学方法筛选鉴定日本血吸虫新基因。方法 从日本血吸虫(Schistosoma japonicum，大陆株)成虫cDNA库中获取表达序列标签(expressed sequence tag，EST)，用电子拼接的方法延伸序列，用NCBI提供的BLAETx程序和Genbank数据库进行同源性分析以筛选基因；设计特异性引物从日本血吸虫成虫mRNA中扩增筛选基因并预测和分析；扩增产物克隆到原核表达载体并表达。结果 筛选出日本血吸虫Thioredoxin全长基因并对其进行了序列分析，克隆全长cDNA至PET原核载体并表达成功。结论 结合EST、电子延伸和传统的分子生物学方法是高效筛选S.jiaponicum功能基因的有效策略。     

日本血吸虫P7蛋白基因免疫诊断价值的初步研究

目的为了寻找血吸虫病新的免疫学诊断候选分子,在大肠杆菌中克隆、表达日本血吸虫(Sj P7)蛋白,建立纯化重组抗原间接ELISA方法(r Sj P7-ELISA)诊断日本血吸虫病。方法设计引物,用PCR法扩增出日本血吸虫P7样蛋白基因编码基因序列,T载体连接,再将其亚克隆入p ET28a(+)表达载体中,经酶切、测序证实正确后,用IPTG对该重组菌诱导表达,SDS-PAGE和Western blot验证表达量和免疫活性。结果 PCR法扩增出一条大小约为423 bp大小的Sj P7样蛋白的DNA片断,将其克隆亚表达质粒p ET28a(+),测序证实具有完整的ORF。结论日本血吸虫P7蛋白在血吸虫病免疫诊断上具有较大的应用潜能。     

日本血吸虫Mf2基因的亚克隆表达与免疫保护效果研究

目的 在大肠杆菌中高效表达日本血吸虫(Schistosoma japonicum，Sj）Mf2蛋白，并对表达产物进行免疫保护效果测定。方法 将SjMf2基因亚克隆至pCEX—5X—3原核表达载体，以GST融合蛋白的形式在ER2688中表达，表达产物免疫小鼠，免疫用抗原剂量为50μg/次.鼠，对照组分别注射FCA或PBS，在0、2、6周共免疫3次。第3次免疫后2周进行攻击感染，42d后杀鼠，观察减虫和减卵效果。结果 在IPTG诱导下，表达载体中的SjGST基因与重组的SjMf2基因在大肠杆菌中得以高效表达，形成了SjGST—Mf2融合蛋白，用这种融合蛋白免疫小鼠，诱导产生了27．75％的减虫率和45．7％的每雌肝组织虫卵减少率(LEPF)。结论 SjMf2基因亚克隆至pGEX—5X—3载体后可在大肠杆菌中高效表达，表达产物能诱导小鼠产生一定程度的抗日本血吸虫保护性免疫力。     

日本血吸虫新基因的克隆及分析

目的：克隆并分析日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）新基因,提供有效的疫苗候选分子。方法：用Sj雄虫可溶性抗原免疫家兔血清为探针筛选Sj成虫cDNA文库,将所获阳性克隆的插入片断进行PCR扩增并测序,通过互联网NCBI GenBank和蛋白质分析软件进行分析。结果：共筛选得11个阳性克隆,经分析有2个新基因,分别是Sj-P8（GenBank注册号AF517843）和Sj肌球蛋白cDNA序列（GenBank注册号AY770506）,分别编码含75个氨基酸的跨膜蛋白和含212个氨基酸的蛋白片断。结论：Sj-P8和Sj肌球蛋白cDNA序列可能为日本血吸虫疫苗的研究提供有价值的材料。     

日本血吸虫SJCHGC02377蛋白部分片段的克隆与表达

目的:克隆和表达日本血吸虫SJCHGC02377蛋白。方法:采用RT-PCR从日本血吸虫成虫总RNA中扩增出编码SJCHGC02377蛋白的基因片段;经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pET-23 a(+),转化大肠埃希菌BL21,菌落PCR和双酶切鉴定;阳性菌株经IPTG诱导表达SJCHGC02377蛋白部分片段,亲和层析予以纯化。结果:RT-PCR扩增出SJCH-GC02377蛋白基因片段;获得的阳性克隆序列与GenBank中登录的日本血吸虫SJCHGC02377蛋白的基因序列一致;SJCH-GC02377蛋白基因被亚克隆到原核表达载体pET-23 a(+),在BL21中获得了表达,表达的蛋白经亲和层析获得纯化。结论:成功构建了日本血吸虫SJCHGC02377蛋白的重组表达质粒,在大肠埃希菌中获得表达。     

人脑源性神经营养因子成熟肽基因克隆及表达

目的构建表达人脑源性神经营养因子hBDNF的基因工程菌。方法人工合成1对含EcoRI和BamHI限制性酶切位点的特异引物，以人血白细胞基因组DNA为模板。应用PCR技术扩增hBDNF成熟肽基因。用A-T克隆法与pUCm-T载体连接后，再定向插入原核表达载体pBV220，将重组体pBV220．hBDNF转化大肠杆菌DH5a，经42℃热诱导表达。结果经限制性酶切和DNA测序证明重组入载体中的DNA片段确为hBDNF，并成功表达出hBDNF蛋白。结论该研究成功地克隆出hBDNF基因编码序列并在大肠杆菌中获得稳定表达，表达效率达25％，为今后生物学活性的研究和神经系统疾病的基因治疗奠定了基础。     

猪Calsarcin-2基因编码区的克隆及组织表达谱分析

目的克隆猪Calsarcin-2（Cs-2）基因,并探讨其在猪组织中的表达特点。方法利用RT—PCR方法扩增猪Cs-2基因编码区的序列;采用Northern杂交和半定量RT—PCR方法在猪不同组织和不同部位骨骼肌中分析Cs-2基因表达情况及转录本个数、大小。结果猪Cs-2基因片段长934bp,含有1个897bp的开放阅读框（ORF）,编码298个氨基酸,与已报到的人Cs-2基因氨基酸序列相似性为93％;猪Cs-2基因仅在骨骼肌中表达,不同骨骼肌中表达量有所不同,以背最长肌最高;此基因在骨骼肌中只有一个转录本,大小为1．26kb。结论猪Cs-2基因序列与已报道的人、鼠Cs-2基因具有高度同源性,主要在骨骼肌中特异表达。     

人CD40基因的克隆及其胞外段的原核有效表达

目的克隆人CD40基因并原核高效表达其胞外段。方法采用RT-PCR法,从高表达人CD40抗原的XG-2细胞中扩增CD40全长基因,并将其插入pMD18-T载体中进行测序验证。用特异引物扩增CD40抗原分子的胞外段基因（可溶性CD40、sCD40基因片段）,再亚克隆至原核表达载体pGEX-5x-3,将测序正确的重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,Western blot检测目的蛋白。结果 RT-PCR能从XG-2细胞总RNA中扩增出特异的目的基因,测序结果显示与GenBank中登录的完全一致,构建的原核表达重组载体pGEX-5x-3/hCD40ECD在表达宿主菌BL21（DE3）中经IPTG诱导能获得有效表达,Western blot证实了目的蛋白条带的特异性。结论获得了人CD40分子的基因及其胞外段原核表达产物,为进一步研究CD40分子的功能和sCD40的应用奠定了良好的基础。     

SARS病毒M蛋白编码基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：克隆SARS冠状病毒膜蛋白M胞外区编码序列，并将其置于大肠杆菌作融合表达。方法：从GenBank获得SARS病毒BJ01株膜蛋白M编码基因序列，人工合成其氨基端129-base-pair(bp)双向单链DNA序列，在5’和3’端分别引入BamHⅠ、Ⅰ酶切位点，退火后形成双链DNA，常规法将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，构建含M蛋白编码基因的重组原核表达质粒。重组质粒经酶切鉴定，核酸序列测定和分析后转化大肠杆菌(E．co如)BL21感受态细胞，以异丙基硫代一B—D一半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果：核酸序列测定与分析的结果表明，克隆的129bp基因序列与基因数据库中所登记的BJ01毒株序列呈现100％同源性。IPTG诱导后的菌体，经SDs-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，显示有一个大小为30．1ku的融合表达蛋白产生。结论：M蛋白氨基端胞外区129bp编码基因在E.coli中获得正确表达。     

鸡Tie-2受体胞外片段的原核表达及目的蛋白免疫原性的研究

目的研究鸡Tie-2受体胞外片段(配体结合域)的原核表达以及目的蛋白对小鼠的抗原性。方法用PCR方法从既往构建的包含鸡Tie-2受体胞外段基因的表达质粒扩增目的片段,进而构建PQE原核表达载体并诱导其目的蛋白的表达,将目的蛋白进一步纯化、复性并免疫小鼠,获得抗血清,用ELISA和Western blotting检测抗血清中抗体的存在。结果经酶切分析及测序鉴定表明获得了鸡Tie-2受体胞外目的片段的PQE原核表达载体,能高效表达目的蛋白,将其免疫小鼠可产生抗重组蛋白的抗体。结论用原核表达的方式可成功的获得鸡Tie-2受体胞外目的片段的蛋白,并对小鼠产生免疫原性。     

大肠杆菌guaC基因的克隆及高效表达

以E.coli MC4100染色体DNA为模板使用PCR扩增技术克隆了鸟苷酸还原酶基因guaC，该基因全长1044bp，编码相对分子质量为37ku的蛋白质。将该基因直接克隆于PET—16b质粒的T7启动于下游，得到质粒pEXP1。转化E．coli BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，获得了高效的表达。含表达质粒的菌体胞内粗提液经酶活分析表明，鸟苷酸还原酶的活性为不含质粒的宿主菌的80-85倍。     

人血管紧张素转换酶2基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆人血管紧张素转换酶2基因(ACE2),并构建其真核表达载体。方法用Trizol试剂从人肺组织提取总RNA,然后经逆转录得到人ACE2的cDNA。半巢式PCR方法扩增人ACE2基因后,先进行T-A连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,接种含IPTG和x-Gal平板筛选重组子,并进一步亚克隆至真核表达质粒载体pcDNA3.1( )。经PCR扩增、酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。结果获得了人ACE2的编码基因,并成功构建了其真核表达载体。结论人血管紧张素转换酶2是SARS冠状病毒的功能受体,与SARS冠状病毒Spike蛋白上的受体结合域相结合,在SARS冠状病毒感染和传播中起重要作用,本工作为研究SARS冠状病毒感染及跨种属传播机制奠定了基础。     

中国汉坦病毒H82O5株G2糖蛋白基因的克隆及在真核细胞中的瞬时表达

从感染病毒乳鼠脑组织提取总RNA，采用RT－PCR和分子克隆技术将扩增到的G2糖蛋白基因插入含CMV启动子的pcDNA3.1/His质粒载体中，通过脂质体介导转染COS－7细胞，用SDS－PAGE、Western-blot及IFIA方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果证明获得正向插入的G2－pcDNA3.1/His重组表达质粒，表达产物的相对分子量为56ku，与理论预期大小一致，并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体起特异反应。表明构建的G2－pcDNA3.1/His重组质粒所表达的蛋白为中国汉坦病毒株特有，能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性，重组质粒可应用于汉坦病毒的DNA疫苗研究。     

人胶质细胞源性神经营养因子(hGDNF)成熟肽基因的克隆及原核表达

目的分离人胶质细胞源性神经营养因子(hGDNF)成熟肽基因，并在E．coil中获得表达。方法以人的白细胞基因组DNA为模板，合成特异引物，采用PCR技术分离得到hGDNF成熟肽基因，并构建表达载体pET-21a( )-hGDNF，转化大肠杆菌BL21(DE3)，分别用IPTG和乳糖诱导表达，SDS-PAGE电泳检测hGDNF蛋白表达。结果PCR扩增出了400bp的DNA片段，构建的表达载体pET-21a( )-hGDNF经酶切、PCR鉴定均出现400bp左右的条带，测序结果正确，用IPTG或乳糖诱导转化菌均有15kd大小的目的条带，表达的目的蛋白占菌体总蛋白30％以上，以包涵体形式存在。结论克隆得到人GDNF成熟肽基因并在大肠杆菌中得到了高效表达。