玻璃体内注射谷氨酸导致大鼠视网膜Müller细胞内ERK1/2磷酸化水平增高

目的: 观察大鼠玻璃体内注射谷氨酸后视网膜Müller细胞内ERK1/2分子的磷酸化水平,为探讨ERK1/2通路的激活在谷氨酸毒性损伤视网膜时的保护作用提供形态学证据.方法: SD大鼠18只,随机分为生理盐水对照组、谷氨酸注射后3 d组和7 d组,每组6只.随机选取大鼠的一只眼进行玻璃体内注射,实验组注射谷氨酸(375 nmol) 2μL, 对照组注射等量生理盐水,注射后3或7 d后,取出眼球作冰冻切片,采用免疫组化法显示视网膜中的含磷酸化ERK1/2的阳性结构,用图像分析比较对照组和不同实验组的平均灰度值.结果: 注射谷氨酸7 d组的视网膜Müller细胞内ERK1/2表达上调,其灰度值(97.00±2.21)比对照组灰度值(128.00±3.23)和注射谷氨酸3 d组的灰度值(126.00±4.12)均低(P<0.05),与这两组的灰度值之间差异有显著性.结论: 玻璃体内注射谷氨酸导致大鼠视网膜Müller细胞激活,ERK1/2磷酸化水平增高,ERK1/2通路的激活可能在视网膜节细胞受到兴奋性毒性损伤时起到重要的保护作用.     

糖基化终产物对体外培养兔视网膜Mǖller细胞的影响

目的探讨糖基化终产物（AGEs）对体外培养兔视网膜Mǖller细胞的影响。方法培养兔视网膜Mǖller细胞，体外制备AGEs及其对照物，实验分为牛血清白蛋白AGE（AGE—BSA）作用3d组、AGE—BSA作用9d组、AGE—BSA对照3d组、AGE—BSA对照9d组、空白对照3d组及空白对照9d组。采用光镜下观察及流式细胞仪检测AGEs对Mǖller细胞凋亡发生率的影响。结果AGEs对Mǖller细胞作用3d后，与对照组相比，细胞形态和数量无明显变化，无明显细胞凋亡；而作用9d后，细胞数量明显减少，细胞凋亡率明显增高。结论AGEs可抑制视网膜Mǖller细胞的生长。     

兔视网膜Müller细胞原代培养

目的 :建立兔视网膜 Müller细胞原代培养的方法。方法 :组织块悬浮法培养兔视网膜Müller细胞 ,用电镜和免疫组织化学法对细胞进行鉴定。结果 :培养的细胞贴壁生长 ,呈长梭形 ,胞体肥大 ,胞浆丰富。电镜下可见特征性的中间丝 (直径 8～ 1 0 nm) ;免疫组织化学显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白 ( GFAP)和 S- 1 0 0阳性 ,八因子相关抗原阴性。结论 :组织块悬浮法培养兔视网膜Müller细胞是一种稳定、可靠的方法     

人视网膜Müller细胞的培养

目的:研究人视网膜Müller细胞的简易酶消化培养法。方法:使用单一酶消化法培养人视网膜Müller细胞,运用免疫荧光法和透射电镜技术进行细胞鉴定。结果:培养的Müller细胞胞浆丰富,电镜下胞浆中可见大量线粒体,粗面内质网,糖原颗粒和直径为8～10 nm的微丝,免疫荧光显示95%以上细胞可见阳性谷氨酰胺合成酶、神经胶质纤维酸性蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、中间丝波形蛋白。结论:简易酶消化法可成功用于人视网膜Müller细胞的培养。     

两种大鼠视网膜Müller细胞培养方法比较

目的比较酶消化法与组织块法培养大鼠视网膜Müller细胞的效果。方法将新生3d的SD大鼠视网膜分离为小组织块,分别采用酶消化法与组织块法进行体外培养,采用换液时机械震荡等方法获得纯化的Müller细胞。从细胞形态学、细胞增殖及免疫细胞化学染色阳性率方面比较两种细胞培养方法的效果。结果酶消化法获得的Müller细胞数量多于组织块法(t=2.264,P<0.05),且用时短。两种方法培养的纯化Müller细胞增殖速度及免疫细胞化学染色阳性率比较差异无显著意义(P>0.05)。结论酶消化法是一种高效的大鼠视网膜Müller细胞培养方法。     

偏头痛模型大鼠三叉神经脊束核磷酸化ERK1/2水平变化

目的 探讨ERK1/2在偏头痛中枢发病机制中的作用.方法 6只SD大鼠随机数字表法分为：正常组（N组）、假手术组（C组）、偏头痛模型组（M组）、二甲基亚砜组（DMSO）（D组）和ERK1/2抑制剂PD-98059组（PD组）,每组n=12.进行三叉神经脊束核神经元放电记录和ERK1/2磷酸化水平检测.结果 （1）放电频率变化百分比：造模后,三叉神经脊束核细胞外放电频率增加,造模后2h为造模前的（325.88±47.32）％;M放电频率（325.9±47.3）％高于N组（100.0±0.0）％和C组（107.3±16.4）％.D组放电频率（319.3±42.5）％与M组（325.9±47.3）％相比,差异无统计学意义;PD组放电频率（218.5±31.7）％低于M组（325.9±47.3）％和D组（319.3±42.5）％.（2）磷酸化水平：M组、D组ERK1/2磷酸化水平高于N组和C组;D组与M组相比,磷酸化水平无明显变化;PD组磷酸化水平低于其余四组.结论 偏头痛中枢敏感化过程中,三叉神经脊束核神经元兴奋性和ERK1/2磷酸化水平增加,ERK1/2抑制剂PD-98059能减少神经元兴奋性和ERK1/2磷酸化水平,说明ERK1/2可能参与大鼠偏头痛中枢敏感化的形成.     

大鼠视网膜Müller细胞的培养与鉴定

目的:仿照前人建立的方法,优化SD大鼠视网膜Müller细胞体外培养的技术和方法,为后续相关研究建立实验室条件.方法:使用胰蛋白酶消化的方法分离新生SD大鼠视网膜Müller细胞,以DMEM为培养基体外培养,光镜观察.采用电镜观察及荧光免疫组织化学染色的方法进行鉴定.结果:培养的细胞贴壁生长,原代细胞胞体狭长,细胞质丰富,折光性好.电镜下可见特征性的中间丝(直径8～10 nm),细胞器丰富;荧光免疫组织化学显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和谷氨酰胺合成酶(GS)阳性.结论:酶消化法培养SD大鼠视网膜Müller细胞是一种稳定、可靠的方法.     

视网膜Müller细胞病变与糖尿病视网膜病关系的研究进展

糖尿病视网膜病(DR)是糖尿病的主要微血管病变之一,可导致视力下降甚至失明,其发病机制尚未完全明了.该病典型的病理改变为视网膜水肿和新生血管生成.近年来,随着对视网膜Müller细胞的深入研究,发现Müller细胞可参与多种病理和生理过程,并且在糖尿病视网膜病进展中起了重要作用.本文就视网膜Müller细胞与糖尿病视网膜病进展之间的联系以及目前对Müller细胞研究的最新进展作一综述.     

α1-抗胰蛋白酶抑制高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞凋亡实验研究

目的:探讨α1-抗胰蛋白酶(AAT)抑制高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞凋亡的效果与机制.方法:大鼠视网永生化膜Müller细胞系在高糖培养基上培养,分为三组:模型组、试验A组、试验B组,分别加入不同浓度的外源性AAT 100μl(加药浓度分别为0、10、100 pg/ml),处理不同时间点换回高糖培养基进行培养.采...     

AO/EB染色法检测缺氧条件下视网膜Müller细胞凋亡

目的 观察不同时间的缺氧条件下视网膜Müller细胞凋亡情况.方法 缺氧3h、6h、12h、24h、48h、72h条件下培养视网膜M ü l l e r细胞,A O/E B染色后共聚焦显微镜观察.结果 缺氧3h、6h、12h、24h、48h、72h细胞凋亡率分别为4%、7%、10%、13%、17%、23%,随着缺氧时间的延长,凋亡细胞逐渐增多.结论 为了确保缺氧条件下一定的活细胞数量,排除过多的细胞凋亡因素对实验结果的影响,缺氧条件下视网膜M ü l l e r细胞的研究应选择凋亡细胞20%以下的缺氧时间(48h内)作为进一步研究的时间范围.     

一种改良的Sprague Dawley新生大鼠视网膜Müller细胞培养方法

目的改良Sprague Dawley(SD)新生大鼠视网膜Müller细胞培养方法。方法取新生1～2 d的SD,分2 d完成视网膜Müller细胞的提取,第1天将眼球浸泡于含体积分数1%双抗的无血清高糖达尔伯克改良伊戈尔培养基(DMEM)中,置于37℃、含体积分数5%CO2的培养箱内过夜;第2天,去培养基,以2. 5 g·L-1胰蛋白酶消化眼球1 h,分离视网膜组织,加入含体积分数1%双抗和体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基,制备细胞悬液接种培养; 24 h后换液,6～8 d后传代,传至第4代,细胞免疫荧光染色法鉴定Müller细胞纯度。结果 Müller细胞贴壁生长良好,细胞体宽大,细胞质丰富,细胞核呈圆形或椭圆形,无神经元共生长,Müller细胞纯度> 95%。结论改良的SD新生大鼠视网膜Müller细胞培养方法操作简单,细胞纯度高。     

贝母素乙对肺纤维化大鼠肺组织MEK1/2、ERK1/2及其磷酸化的影响

目的探讨贝母素乙对博莱霉素致肺纤维化大鼠肺组织MEK1/2、ERK1/2及其磷酸化的影响。方法大鼠麻醉后,经气管软骨环间隙向心端穿刺,注入博莱霉素5mg/kg建立大鼠肺纤维化模型,假手术组大鼠在同样麻醉条件下气管内注入等容积生理盐水。术后第2天开始每天灌胃给药,假手术组和模型组给予蒸馏水,地塞米松组给予等容积地塞米松蒸馏水溶液,贝母素乙A组、B组分别给予等容积贝母素乙5、2.5mg/kg蒸馏水溶液。灌胃28d后,麻醉并颈动脉取血后处死大鼠,肺组织固定,包埋切片,常规脱蜡,行免疫组化SABC法检测肺组织MEK1/2、ERK1/2水平,Western blot法检测p-MEK1/2、pERK1/2水平。结果贝母素乙可显著降低肺纤维化大鼠的肺组织ERK1/2、MEK1/2水平(P0.01),与地塞米松作用相似(P0.05),贝母素乙A组、B组之间比较未见明显差异(P0.05)。贝母素乙可以显著降肺纤维化大鼠的肺组织p-MEK1/2、p-ERK1/2水平(P0.01),较地塞米松更为显著(P0.01),贝母素乙B组较贝母素乙A组更为显著(P0.01)。结论贝母素乙减轻博莱霉素致肺纤维化大鼠的MEK1/2、ERK1/2及其磷酸化水平可能是其抗纤维化的作用机理之一。     

高浓度葡萄糖和高浓度胰岛素对体外培养视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i的影响

目的 探讨高浓度葡萄糖、高浓度胰岛素对体外培养的视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i的影响.方法 采用荧光探针技术,应用激光共聚焦显微镜动态、定量测定细胞外高钙、钙拮抗剂条件下,正常、高浓度葡萄糖、高浓度胰岛素、高浓度葡萄糖+高浓度胰岛素培养的视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i的变化.结果 高浓度葡萄糖、高浓度胰岛素、高浓度葡萄糖+高浓度胰岛素培养的视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i明显升高,在细胞外高钙条件下各组[Ca2+]i均降低,在细胞外钙拮抗剂条件下各组[Ca2+]i均再次下降.结论 高浓度葡萄糖和高浓度胰岛素均能使视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i明显升高,而钙拮抗剂通过干扰细胞外钙离子进入细胞来降低[Ca2+]i.     

早期糖尿病大鼠血清抑制视网膜Müller细胞增殖

目的 :观察早期糖尿病大鼠血清对培养视网膜M櫣ｌｌｅｒ细胞 (retinalM櫣ｌｌｅｒｃｅｌｌｓ,RMCs)增殖的影响 .方法 :将链脲霉素 (streptozotocin ,STZ)诱导糖尿病大鼠病程 2wk时的血清 ,以DMEM培养基稀释 (5 0 ,10 0及 2 0 0mL·L-1)后作用于体外培养的大鼠RMCs,采用四唑盐 (tetrazolium ,MTT)还原比色法 ,测定MTT反应的吸光度 (A值 ) .结果 :大鼠血清能促进RMCs增殖 ,并呈现浓度依赖性 ,而早期糖尿病大鼠血清较对照组血清 (正常同龄大鼠的同浓度血清 )有显著的抑制增殖的作用 (P <0 .0 5 ) ,并随着血清浓度的增加 ,抑制率增加 ,5 0 ,10 0及 2 0 0mL·L-1时 ,其A值分别为 0 .2 0 8± 0 .0 2 0vs 0 .2 31± 0 .0 2 0 ,0 .2 6 7± 0 .0 13vs 0 .30 4± 0 .0 14和 0 .32 7± 0 .0 2 1vs 0 .380± 0 .0 2 4 ,其抑制率分别为 10 .0 % ,12 .2 %和 13.9% .结论 :早期糖尿病大鼠血清对RMCs的增殖有显著的抑制作用 .     

Trim9调控视网膜Müller细胞向神经节细胞定向分化

目的：青光眼是不可逆性致盲性眼病的主要病因,目前尚无有效疗法逆转青光眼的视觉系统损害。最近发现干细胞疗法有望使受损的视网膜神经元修复和再生,但是在干细胞来源方面仍然存在较大挑战。本研究探寻一种将视网膜Müller细胞去分化为视网膜干细胞,进一步高效定向分化为视网膜神经节细胞的方案,以期为青光眼的干细胞治疗提供新的细胞获取途径。方法：用表皮细胞生长因子和成纤维细胞生长因子2诱导大鼠视网膜Müller细胞去分化为视网膜干细胞。构建Trim9过表达慢病毒(PGC-FU-Trim9-GFP),感染由Müller细胞诱导去分化而来的视网膜干细胞,通过荧光显微镜观察和流式细胞术评估病毒感染效率。用视黄酸和脑源性神经营养因子处理过表达或未过表达Trim9的视网膜干细胞以诱导其分化为神经元和神经胶质细胞。采用免疫荧光、PCR/real-time RT-PCR和蛋白质印迹法检测各细胞标志物(GLAST、GS、rhodopsin、PKC、HPC-1、Calbindin、Thy1.1、Brn-3b、Nestin、Pax6)的表达。结果：表皮细胞生长因子和成纤维细胞生长因子2处理后的大鼠视网膜Müller细胞...     

鞘内注射ERK1/2抑制剂对骨癌痛大鼠的镇痛作用研究

目的 研究鞘内注射细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）抑制剂（SCH772984）对骨癌痛Sprague-Dawley（SD）大鼠疼痛行为学及脊髓背角Fos蛋白表达的影响,探讨ERK-P90RSK-Fos信号通路在骨癌痛中的作用。方法 取鞘内置管后5天的雌性SD大鼠40只,随机分成5组（n=8）,包括Sham假手术组和BNP模型组（分别为对照组,SCH772984给药组SCH 0.1组,SCH 1组,SCH 10组）。在造模后第9天,Sham组不给药,BNP模型组鞘内分别给5% DMSO 10μl、SCH772984抑制剂 0.1、1.0、10μg（SCH772984抑制剂溶于10μl 5%的DMSO中）。测定造模前1天、造模后3、6、9、12、15、18天以及给药后1、3、6、9、12、18、24h的机械缩足阈值（MWT）、热缩足潜伏期（PWL）以及2min自发缩足次数。取鞘内置管后5天的SD大鼠40只,随机分为5组（n=8）,其中B1、B2、B3组在造模后第9天,鞘内注射SCH772984抑制剂10μg后分别于1、9、24h取材,M组为模型对照组,鞘内注射5% DMSO后9h取材,S组为空白对照组。通过免疫印迹（Western blot）法及免疫荧光测定脊髓背角p-ERK、p-p90RSK以及Fos蛋白表达情况。结果 鞘内注射ERK1/2抑制剂（SCH772984）对骨癌痛大鼠有镇痛作用,并且该效应随着剂量的增加而增大;鞘内注射ERK1/2抑制剂（SCH772984）10μg可明显减少脊髓背角Fos蛋白的表达。结论 ERK-p90RSK-Fos通路可能影响骨癌痛。     

丹参-人参组分配伍对肺癌A549细胞侵袭迁移及ERK1/2磷酸化水平的影响

目的?研究丹参-人参组分配伍对肺癌A549细胞侵袭迁移以及ERK1/2磷酸化水平的影响。方法?采用细胞划痕实验和高内涵细胞成像系统分析丹参-人参组分配伍对肺癌A549细胞迁移的影响;应用实时细胞传感电阻仪Transwell实验动态检测丹参-人参组分配伍对肺癌A549细胞侵袭的影响;通过纳米级超微量蛋白质分析系统检测丹参-人参组分配伍对肺癌A549细胞ERK1/2磷酸化水平的影响。结果?丹参-人参组分配伍可显著增加划痕空白区域的距离（P<0.01）,且呈一定的时间依赖性;显著降低细胞迁移的面积（P<0.01）,且呈一定的剂量依赖性;对A549细胞侵袭有抑制作用（P<0.01）,且呈一定的时间依赖性;能够显著降低肺癌A549细胞ERK1/2磷酸化水平（P<0.01）。结论?丹参-人参组分配伍能显著降低肺癌A549细胞迁移侵袭的能力,其作用机制可能与降低肺癌A549细胞ERK1/2磷酸化水平有关。      

牛磺酸对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞凋亡的防护研究

目的 观察高糖培养条件及牛磺酸干预视网膜Müller细胞的凋亡变化,探讨牛磺酸对早期糖尿病视网膜Müller细胞的保护作用.方法 取出生后3 d的SD大鼠视网膜,分离纯化培养视网膜Müller细胞;经预实验选取25 mmol/L葡萄糖作为高糖培养条件,实验分为6组:正常组;高糖 0.1 mmol/L牛磺酸组;高糖 1 mmol/L牛磺酸组;高糖 5 mmol/L牛磺酸组;高糖 10 mmol/L牛磺酸组,用原位缺口末端标记法(TUNEL)法检测视网膜Müller细胞凋亡并观察牛磺酸的防护效应.结果 神经胶质酸性蛋白(glia1 fibrillary acid protein, GFAP)和S-100荧光双染鉴定纯化培养的视网膜Müller细胞均被双染;牛磺酸干预后TUNEL阳性细胞数量明显减少,并呈一定剂量的关系效应,1～10 mmol/L牛磺酸干预TUNEL阳性细胞显著低于高糖培养组(P＜0.01).结论 牛磺酸能够呈剂量依赖性地抑制高糖所致视网膜Müller细胞凋亡.     

牛磺酸对糖尿病大鼠视网膜Mller细胞凋亡的防护研究

目的观察高糖培养条件及牛磺酸干预视网膜Mller细胞的凋亡变化,探讨牛磺酸对早期糖尿病视网膜Mller细胞的保护作用。方法取出生后3d的SD大鼠视网膜,分离纯化培养视网膜Mller细胞;经预实验选取25mmol/L葡萄糖作为高糖培养条件,实验分为6组:正常组;高糖 0.1mmol/L牛磺酸组;高糖 1mmol/L牛磺酸组;高糖 5mmol/L牛磺酸组;高糖 10mmol/L牛磺酸组,用原位缺口末端标记法(TUNEL)法检测视网膜Mller细胞凋亡并观察牛磺酸的防护效应。结果神经胶质酸性蛋白(glia1fibrillary acid protein,GFAP)和S-100荧光双染鉴定纯化培养的视网膜Mller细胞均被双染;牛磺酸干预后TUNEL阳性细胞数量明显减少,并呈一定剂量的关系效应,1～10mmol/L牛磺酸干预TUNEL阳性细胞显著低于高糖培养组(P<0·01)。结论牛磺酸能够呈剂量依赖性地抑制高糖所致视网膜Mller细胞凋亡。     

糖基化终产物对体外培养兔视网膜Müller细胞的影响

目的 探讨糖基化终产物(AGEs)对体外培养兔视网膜Müller细胞的影响.方法 培养兔视网膜Müller细胞,体外制备AGEs及其对照物,实验分为牛血清白蛋白AGE(AGE-BSA)作用3 d组、AGE-BSA作用9 d组、AGE-BSA对照3 d组、AGE-BSA对照9 d组、空白对照3 d组及空白对照9 d组.采用光镜下观察及流式细胞仪检测AGEs对Müller细胞凋亡发生率的影响.结果 AGEs对Müller细胞作用3 d后,与对照组相比,细胞形态和数量无明显变化,无明显细胞凋亡;而作用9 d后,细胞数量明显减少,细胞凋亡率明显增高.结论 AGEs可抑制视网膜Müller细胞的生长.