脐带间充质干细胞无血清培养体系的筛选

目的：筛选培养脐带间充质干细胞的无血清培养基。方法：采集新生儿脐带标本,将脐带剪成组织碎块,随机分为A组、B组、C组,分别加入MesenCult、Ultraculture和AM-V 3种不同的无血清培养基进行培养。观察3组脐带原代细胞游出时间和细胞形态,检测细胞的增殖能力、分化能力和表面抗原的表达。结果：A组、B组、C组原代细胞从组织块长出的平均时间分别是17 d、6 d、7 d。显微镜下观察可见,从组织块游出的细胞散在分布,呈短梭形或多角形,形态饱满,折光性好,生长融合时A组和B组细胞呈旋涡状生长,细胞折光性好,大小均一,C组细胞细长,折光性稍差,无明显的旋涡状生长的特征。3组均表达CD105、CD90、CD73抗原,不表达CD34、CD45、HLA-DR抗原;3组各标志物的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。3组间充质干细胞均具有向成脂细胞、成骨细胞分化的能力,C组分化能力弱于A组和B组。结论：B组培养体系用时较短,干细胞特性保持较好,价格适宜,可以作为大规模培养人间充质干细胞的首选培养基。     

脐带间充质干细胞无血清培养的实验研究

目的建立一种简单的体外无血清培养扩增人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）的方法。方法利用酶消化法分离hUCMSCs,在无血清干细胞培养体系下培养扩增,进行形态学观察,CCK-8法分析细胞生长曲线,流式细胞仪分析细胞表面抗原表达及细胞周期,进行成骨、成脂诱导分化。结果hUCMSCs呈典型的成纤维细胞形态,具有较强的增殖能力。CD29、CD44、CD90、CD105均呈阳性表达,而CD34、CD45呈阴性表达。3周可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论利用酶消化法和无血清的培养体系能够快速分离培养出大量hUCMSCs,该方法扩增得到的间充质细胞具备稳定的细胞标记物和生长状态,可用于各种治疗的临床试验。     

不同分离液和培养基对骨髓间充质干细胞原代培养的影响研究

目的：试图分剐用不同抽取骨髓方法、不同分离液和培养基，来筛选提高收集骨髓MSCs数量的因素。方法：取大鼠左、右肢长骨近端红骨髓为实验材料，分两组。用穿抽骨髓同时破坏部分红骨髓、Ficoll-paque分离液和IMDM培养基为实验组：穿抽骨髓不再破坏红骨髓，Percoll分离液和DMEM培养基为对照组。分别计数不同抽取骨髓方法的单个核细胞数量。计算不同分离液细胞密度，以及不同培养基的细胞贴壁率、铺展面积的平均值。结果：实验组的各项检测指标明显优于时照组。结论：穿抽破坏骨髓结构的内容物，Ficoll-paque分离液以及IMDM培养基的原代培养，都能分剐提高收集单个核细胞数量。     

人脐带间充质干细胞分离培养方法的优化

目的：优化人脐带间充质干细胞 （ umbilical cord mesenchymal stem cells, UC - MSCs）分离培养的方法。方法：无菌条件下剔除剖腹产胎儿脐带动静脉,用牙剪子剪为约lmm。但彼此相连的组织块,得到贴壁细胞,采用半量换液进行原代及传代培养。用流式细胞仪检测其免疫表型。结果：成功从人脐带中分离纯化得到UC—MSCs,呈条形和成纤维细胞样的两种形态。UC—MSCs高度表达CD105、CD73．CD44、CDg0,极少数表达CIM5、CD34-CD14和HLA—DR。结论：建立出一种快捷经济的UC—MSCs体外分离培养方法。     

血清对脐带间充质干细胞体外培养的影响

目的探讨血清对脐带间充质干细胞体外培养的影响。方法将人脐带间充质干细胞分别培养在不含血清、含灭活血清和含未灭活血清的低糖达尔伯克改良伊格尔培养基(L-DMEM)中。每天用显微镜观察脐带间充质干细胞在3种培养基中的生长情况,并计算细胞总数、统计细胞成活率。结果脐带间充质干细胞在含未灭活血清的L-DMEM中生长状况最好,在不含血清的L-DMEM中生长状况最差。结论含未灭活血清的L-DMEM是脐带间充质干细胞体外培养的最佳培养基。     

大鼠骨髓间充质干细胞最适培养基的筛选

  目的  探讨不同培养基对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)生长的影响,筛选对大鼠BMSCs生长较适宜的培养基。  方法  采用全骨髓差速贴壁分离法从SD大鼠股骨和胫骨分离BMSCs,分别选用DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12三种培养基分离培养大鼠BMSCs。倒置相差显微镜下观察不同培养基对大鼠BMSCs形态均一化程度、克隆形成时间与第14天克隆形成数量、第1次传代时间、细胞增殖率以及细胞贴壁率等的影响;流式细胞术鉴定并观察不同培养基对大鼠BMSCs表面抗原表达的影响。  结果  与其他两组相比,体外DMEM-LG培养基培养的大鼠BMSCs形态均一、克隆形成时间和第1次传代时间短、克隆形成数量多达(14±2)个、细胞贴壁率高达(47.0±2.8)%;同时,BMSCs进入对数生长期仅需4 d,且平均增殖率最高,单位时间内平均扩增数量最多,3 d总扩增数量达(2.2~2.7)×105 mL-1;采用DMEM-LG、α-MEM、DMEM/F12三种培养基分离培养的细胞均为大鼠BMSCs,且不同培养基对大鼠BMSCs表面抗原表达无明显影响。  结论  DMEM-LG培养基较适合大鼠BMSCs的生长。     

脐带血血清分离培养人胎盘间充质干细胞

目的：探讨脐带血清（UCBS）分离、培养人胎盘间充质干细胞（PMSCs）的增殖及分化能力。方法：将 UCBS 处理后用于分离、培养 PMSCs 作为实验组,同体积 FBS 分离、培养 PMSCs 作为对照组,用相差显微镜观察实验组与对照组 PMSCs 的形态、流式细胞仪检测 PMSCs 表面标志、MTT 法检测 PMSCs 的增殖能力。结果：10％ UCBS 的培养液分离纯化的 PMSCs 成梭形、增殖能力强,具有分化为成骨细胞和脂肪细胞的能力,高表达CD29、CD44及 CD105,低表达或不表达 CD34、CD45及 HLA-DR;与对照组相比,UCBS 组细胞增殖能力更强。结论：脐带血清能分离、培养及扩增 PMSCs,培养的 PMSCs 的增殖能力及分化潜能好于 FBS。     

人骨髓间充质干细胞的分离和体外培养

目的 探讨骨髓间充质干细胞的体外分离和培养方法。方法 采用密度梯度离心法和贴壁法进行骨髓间充质干细胞的分离，体外培养并观察其形态学特点。结果 细胞呈梭形或星形，4-5代内具有良好的增殖能力。结论 该方法是一种较理想的骨髓间充质干细胞培养方法。     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的探索体外分离培养人骨髓间充质干细胞的方法并观察基本生长特性，为今后研究其分化提供实验依据。方法：采用Ficoll-Paque淋巴细胞分离液分离人骨髓间充质干细胞，体外培养扩增，在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，细胞计数法绘制生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期。结果：密度梯度离心法可获得较高纯度的骨髓间充质干细胞，细胞形态呈圆形、三角形或棒杆状，48h后细胞开始贴壁，4-5d可见有集落形成，2w左右可达到基本融合。生长曲线示骨髓间充质干细胞增殖活跃，流式细胞仪检测显示约有86％的细胞处于G0、G1期。结论：人骨髓间充质干细胞在体外培养条件下生长性状稳定，增殖能力较强，可作为肝组织工程中理想的种子细胞来源。     

无血清共培养条件下脐带间充质干细胞对奶牛乳腺上皮细胞的增殖作用

目的 旨在探究无血清共培养条件下脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs）对奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary gland epithelial cells,BMECs）的增殖作用。方法 选取生长状态最佳的UC-MSCs和BMECs,将两种细胞以直接接触和间接接触两种共培养方式作为试验组,直接接触是按照UC-MSCs：BMECs分别为2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：10的浓度梯度混合共培养,间接接触则是提取UC-MSCs的上清液作为条件培养基重悬BMECs,对照组为UC-MSCs和BMECs单纯培养组,并设阴性空白对照,于0、4、8、12、24、36、48、60、72 h时观察各组细胞的生长变化,采用CCK-8法检测各组细胞增殖情况。结果 在48 h,条件培养基BMECs组A值显著高于对照组（P<0.05）,而1：2浓度组A值达到峰值,极显著高于对照组（P<0.01）,显著高于其他各浓度组和条件培养基BMECs组（P<0.05）。结论 无血清条件下,UC-MSCs和BMECs共培养可以促进BMECs增殖,直接接触促增殖效果优于间接接触,且最适比例为1：2,最佳时间是48 h。     

人脐血间充质干细胞体外分离、培养与鉴定

目的 建立体外分离和培养人脐血间充质干细胞的方法,并探讨脐血间充质干细胞是否具有与骨髓间充质干细胞相一致的免疫表型.方法 无菌条件下采集正常产胎儿脐血,用相对密度为1.077的淋巴细胞分离液分离脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCB-MSCs),采用贴壁培养法获得MSCs,体外培养并对其增殖进行观察.用流式细胞仪检测细胞周期状态和白细胞表面抗原.结果 来源于脐血的MSCs在含有15%胎牛血清和低糖DMEM培养基中可以贴壁,并表现为间充质样细胞;传3代后,此类细胞可以纯化、扩增;其细胞倍增时间为60h左右.流式细胞分析细胞周期显示大部分细胞(85%)处于G0/G1期;此类细胞稳定地表达相关的抗原标记CD29、CD44、CD54、CD105,但不表达造血细胞系的表面标记CD34、CD45.结论 脐血中可培养出非造血干细胞,其白细胞表面抗原表达与骨髓间充质干细胞有较强的一致性.     

人脐血间充质干细胞分离培养方法的改良

目的探讨一种新的能提高脐血间充质干细胞体外分离培养成功率的方法。方法利用Ficoil分离脐血,采用改良的密度梯度两步离心法分离脐血单个核细胞,接种于含20％胎牛血清和5％人脐血血清的原代培养液中,在倒置相差显微镜下进行形态观察,直接免疫荧光法检测人脐血间充质干细胞相关抗原CD29的表达。加入成骨诱导剂体外诱导脐血间充质干细胞10d碱性磷酸酶染色鉴定其成骨分化能力。结果本实验方法成功分离培养出人脐血间充质干细胞。原代培养第4天即可见到有成纤维样细胞贴壁,10d左右集落形成,约25d进行传代。传代后生长加速,一周左右即可长满,免疫荧光检测显示脐血间充质干细胞相关抗原CD29呈阳性表达,成骨诱导10d碱性磷酸酶染色阳性。结论利用改良的密度梯度离心法可获得人脐血间充质干细胞．     

人脐血间充质干细胞的改良分离培养

目的探讨人间脐血来源的充质干细胞在体外分离培养与扩增的方法。方法用重力离心-密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离细胞,用含15%FBS的DMEM低糖培养基培养并传代,流式细胞仪检测P3代间充质干细胞的表面标志。结果脐血来源的单个核细胞24 h即开始贴壁,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞。经自然纯化法传代后,可得到形态单一的长梭形间充质干细胞。流式细胞仪检测结果显示该细胞表达CD44。结论脐血来源的MSCs可以在体外分离培养和扩增,细胞表面标记与骨髓来源间充质干细胞一致。     

非病毒诱导体系高效诱导脐带来源间充质干细胞向胰岛细胞分化

目的探讨非病毒法诱导脐带来源间充质干细胞(UC-MSC)向胰岛素分泌细胞分化的可行性,为胰岛细胞移植治疗糖尿病提供临床移植数量级的细胞。方法从人脐带分离间充质干细胞,体外分阶段诱导分化为胰岛细胞。采用RT-PCR方法比较胰岛细胞分化过程中转录因子foxa2、sox17、pdx1、ngn3、pax4、insulin和glut-2在诱导组和非诱导组中的表达水平;免疫荧光染色方法检测胰岛素和C-肽在诱导终末阶段细胞中的表达定位;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测胰岛素及C-肽的分泌以及细胞对葡萄糖刺激的反应性。结果诱导第1阶段末,诱导后细胞foxa2和sox17的表达明显高于未诱导细胞(P均<0.05);诱导第2阶段末,诱导细胞pdx1、ngn3和pax4的表达明显高于未诱导细胞(P均<0.05);诱导第3阶段末,诱导细胞的insulin和glut-2表达明显高于未诱导细胞(P均<0.05)。免疫荧光染色结果显示,胰岛素和C-肽均表达于诱导终末分化阶段的细胞,效率可达90%以上。ELISA检测结果显示,诱导第3阶段末细胞胰岛素总量为(346.3 739±32.5 149)μU/ml,明显高于未诱导细胞的(17.69...     

人脐带间充质干细胞经添加B27的无血清培养基诱导后分化成神经元样细胞

目的 评价人脐带间充质干细胞（HUCMSCs）经添加B27的无血清培养基诱导后向神经元样细胞分化的能力和效率。方法 将第4代HUCMSCs分为4组：A组：血清培养基（SCM）处理14 d;B组：给予SCM+20 ng/mL神经生长因子（NGF）+10 ng/L碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）治疗14 d;C组：无血清培养基（SFM）处理14 d;D组：SFM+20 ng/mL NGF+10 ng/mL bFGF处理。每3 d更换各组细胞培养液。倒置显微镜观察神经球生长情况,流式细胞术分析细胞标记物。巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、人重肽神经丝蛋白（NEFH）、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）通过qRT-PCR和Western blotting进行定量。结果 在诱导前,HUCMSCs表现出丰富的间充质干细胞表面标志物（CD29、CD44和CD105分别为99.5%、49.6%和77.7%）的表达。在第7、10、14天观察神经元样细胞的形成,D组最优,其次是C、B、A组。qRT-PCR和Western blotting结果显示,A、B、C、D组Nestin和GFAP表达逐渐减少,NEFH和NSE表达逐渐增加,A组与其他3组的GFAP、NEFH、Nestin和NSE表达差异有统计学意义（P<0.05）。结论 添加B27的SFM可以有效地将HUMSCs分化为神经元样细胞,添加细胞因子（NGF和bFGF）使分化效 果更显著。     

足月胎儿脐血间充质干细胞体外培养方法的比较

目的 比较30%血清浓度的L-DMEM与Mesencult培养基对人类足月胎儿脐血间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)体外培养的效果.方法 采集妊娠时间为36～40周的胎儿脐带血,共20份,分离单个核细胞,每份脐血的单个核细胞平均分入2组进行MSC培养,即30%血清浓度的L-DMEM培养基组和Mesencult培养基组.观察2组培养过程、出现情况以及贴壁细胞形态变化.流式细胞仪检测细胞表面标志和两组细胞的细胞周期,诱导MSC向成骨细胞、脂肪细胞分化,细胞化学染色检测诱导后的细胞变化.结果 30%血清浓度的L-DMEM组的MSC出现率(35%)高于Mesencult培养基组(5%)(χ2=4.16,P＜0.05);30%血清浓度梯度组中破骨样细胞贴壁现象明显被抑制;流式细胞仪检测细胞表面抗原:CD29、CD44、CD105、CD166阳性表达,CD13、CD19、CD34、CD45阴性表达;两组的第8代MSC的G0/G1期细胞比例为(87.67±1.21)%、(89.48±1.24)%,无显著差别(n=6,t=1.782,P＞0.05);30%血清浓度梯度组第8代MSC可被诱导为成骨细胞、脂肪细胞,未见自发分化.结论 应用30%胎牛血清浓度L-DMEM培养基体外培养人足月脐血MSC,可使培养成功率提高至35%,明显优于Mesencult培养基.     

大鼠骨髓间质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的建立大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)最佳的体外分离培养方法,并研究其基本的生物学特性。方法采用密度梯度离心和贴壁培养两种方法分离大鼠的MSCs,进行形态学观察及增殖生长方面的测定;免疫细胞化学染色鉴定表面标志。结果大鼠MSCs体外培养呈梭形;细胞生长曲线为“S”型;密度梯度离心法原代培养15d达到80%～90%的融合,而改良的直接贴壁法只需要5d;细胞周期显示G0/G1期88.29%;免疫细胞化学染色显示CD44表达阳性,CD34、CD45为阴性。结论两种方法均可获得骨髓间质干细胞,但贴壁培养法操作更简便、快速,具有对细胞活性影响较小,更利于其贴壁和增殖的优点。MSCs体外培养条件下生长性状稳定,适于做组织工程的种子细胞。