促血管生成素2在胃癌中的表达及其反义基因转染对人胃癌细胞SGC-7901的影响

目的：探讨促血管生成素2（angiopoietin2,Ang2）在胃癌组织中的表达及其与肿瘤病理分期的联系;观察反义 Ang2基因转染对人胃癌细胞SGC-7901的影响。方法：用Western blot法检测Ang2蛋白在10例胃癌组织及10例正常胃黏膜组织中的表达,用免疫组化法检测53例不同病理分期的胃癌组织中Ang2蛋白的表达;应用脂质体转染法将既往实验合成[1]的 pEGFP-N1-anti Ang2转染体外培养的人胃癌细胞SGC-7901,以空载体（pEGFP-N1）转染组和未转染组作对照,RT-PCR及免疫组化检测转染后Ang2基因及蛋白的表达,MTT法和流氏细胞仪（flow cytometry,FCM）检测反义Ang2基因转染对细胞生长和细胞凋亡的影响;分别用上述3组细胞注射于裸鼠皮下,对比观察肿瘤生成的速度和肿瘤组织中的血管生成数量。结果：Ang2蛋白在正常胃黏膜组织中不表达,在不同病理分期的胃癌组织中均呈阳性表达（F=166.76,P＜0.000 1）;RT-PCR及免疫组化显示反义Ang２基因转染组无Ang2 mRNA及Ang2蛋白的表达,MTT法检测显示反义Ang2基因转染组细胞体外增殖能力明显低于其他两组（F=10.39,P=0.002 4）,FCM检测显示其活细胞比率明显低于其他两组（χ2=3 188.980 5,P＜0.000 1）;转染了反义Ang2基因的胃癌细胞成瘤速度较其它两组明显减慢[第6天（F=10.18,P=0.000 5）、第18天（F=7.8０,P=0.002 1）及第30天（F=79.58,P＜0.000 1）],肿瘤组织中血管生成的数量较其它两组明显减少[第1周（F=15.18,P＜0.000 1）、第2周（F=3.50,P=0.044 4）、第3周（F=39.02,P＜0.000 1）]。结论：胃癌组织中Ang2的表达与胃癌血管生成及胃癌侵袭能力密切相关;反义Ang2基因转染可封闭人胃癌细胞SGC-7901中Ang2 mRNA及Ang2蛋白的表达,抑制其体外生长,促进其凋亡;并对其体外成瘤性及其新生血管的生成有明显的抑制作用。     

反义促血管生成素2基因稳定转染对人胃癌细胞SGC-7901体外生长的抑制作用

目的：观察以pEGFP-N1为载体的促血管生成素2（angiopoietin2,Ang2）反义基因转染的人胃癌细胞SGC-7901中Ang2蛋白的表达,研究其对人胃癌细胞体外生长的抑制作用。方法：应用重组质粒转染反义Ang2的pEGFP-N1载体（pEGFP-N1-anti Ang2）、pEGFP-N1空载体质粒以脂质体转染法转染体外培养的人胃癌细胞株,以未转染组为对照,经G418筛选抗性克隆,扩大培养后,应用RT-PCR技术与免疫组化法检测Ang2基因及其蛋白的表达,MTT法分析细胞生长抑制作用,Annexin V-FITC和PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：RT-PCR与免疫组化均示pEGFP-N1-anti Ang2转染组无Ang2 mRNA及其Ang2蛋白的表达,MTT检测表明pEGFP-N1-anti Ang2转染组活细胞数较其它两组均低,差异有统计学意义（F=10.39,P=0.002 4）,流式细胞仪检测则显示其凋亡率较其它两组明显增高,差异有统计学意义（?字2=3 188.98,P＜0.000 1）。结论：pEGFP-N1-anti Ang2成功转染人胃癌细胞SGC-7901且可封闭Ang2 mRNA表达,使已转染pEGFP-N1-anti Ang2的人胃癌细胞Ang2蛋白的表达减少,并抑制人胃癌细胞的恶性表型。     

血管内皮生长因子-C在胃癌中的表达及其反义基因转染对人胃癌细胞SGC-7901的影响

目的:探讨胃癌组织中血管内皮生长因子-C(VEGF-C)的表达与肿瘤新生淋巴管形成的关系。观察以pCI-neo为载体的反义血管内皮生长因子-C(Anti-VEGF-C)转染的人胃癌细胞SGC-7901中VEGF-C蛋白的表达,及其对人胃癌细胞生长的抑制作用。方法:取72例胃癌标本的癌旁组织,通过RT-PCR检测VEGF-C的mRNA表达;免疫组化检测VEGFR-3,计算出微淋巴管的密度并行相关统计分析。以脂质体转染法转染既往试验合成的重组质粒pCI-neo-anti VEGF-C到体外培养的人胃癌细胞株,以未转染组为对照,用免疫组化和Western blot分析VEGF-C基因及蛋白的表达,最后用MTT法及流式细胞仪分析其对细胞生长的抑制作用。结果:淋巴结转移阳性组中VEGF-C mRNA阳性表达85.7%,高于阴性组的20.0%(P<0.05);VEGF-C mRNA表达阳性组淋巴管密度6.36±1.66,阴性组3.95±1.52(P<0.05);淋巴结转移阳性组淋巴管密度6.65±1.57,阴性组3.75±1.47(P<0.05)。重组质粒pCI-neo-anti VEGF-C转染体外培养的人胃癌细胞株后,免疫组化和Western blot均显示pCI-neo-anti VEGF-C转染组无VEGF-C mRNA及其蛋白的表达,MTT检测表明pCI-neo-anti VEGF-C转染组活细胞数较其它各组均低(P<0.05)。结论:VEGF-C能促进癌旁微淋巴管增生、提高胃癌侵袭力;反义VEGF-C转染可封闭人胃癌细胞SGC-7901VEGF-C mRNA,减少其VEGF-C蛋白的表达,抑制其体外生长。     

外源性反义血管内皮生长因子-C基因稳定转染对人胃癌细胞SGC-7901体外生长的影响

目的:观察以pCI-neo为载体的血管内皮生长因子-C(Vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)反义基因转染的人胃癌细胞SGC-7901中VEGF-C蛋白的表达,并研究其对人胃癌细胞体外生长的影响.方法:应用重组质粒pCI-neo-antiVEGF-C和pCI-neo空载体质粒,以脂质体转染法转染体外培养的人胃癌细胞株,以未转染组为对照,经G418筛选抗性克隆,扩大培养后,再用免疫组化和Western-blot分析VEGF-C基因及蛋白的表达,最后用MTT法分析其对细胞生长的抑制作用.结果:免疫组化和Westem-blot均显示pCI-neo-anti VEGF-C转染组无VEGF-C mRNA及其蛋白的表达,MTT检测表明pCI-neo-anti VEGF-C转染组活细胞数较其它各组均低(P＜0.05).结论:pCI-neo-anti VEGF-C成功转染人胃癌细胞SGC-7901且可封闭VEGF-C mRNA,使已转染pCI-neo-anti VEGF-C的人胃痛细胞VEGF-C蛋白的表达减少,并能抑制胃癌细胞SGC-7901的体外生长,为进一步研究VEGF-C的生物学功能及胃癌的基因治疗研究创造了条件.     

谷氨酰胺酶反义基因诱导胃癌细胞凋亡的作用研究

目的 利用反义核酸技术封闭胃癌细胞的谷氨酰胺酶基因,观察反义GAcDNA能否对胃癌细胞的恶性表型有所逆转,为肿瘤的基因治疗探索一条新途径,也为后续研究及临床应用奠定基础.方法 将含有GAcDNA片段的反义真核表达载体pcDNA3.0/GA,通过脂质体介导转入胃癌细胞SGC-7901,经筛选、鉴定,命名为SGC-7901GA,采用TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况,观察反义核酸转染后胃癌细胞凋亡的改变.结果 pcDNA3.0/GA通过脂质体介导转染胃癌细胞SGC-7901,PCR证实GAcDNA目的 片段已经整合到了SGC-7901细胞基因组,获得的G418抗性细胞命名为SGC-7901GA.检测胃癌细胞的凋亡情况表明重组质粒转染后SGC-7901GA的TUNEL阳性细胞数量显著上升,与对照组比较差异有统计学意义.结论 本实验通过含有GAcDNA片段的反义真核表达载体pcDNA3.0/GA转染胃癌细胞株,发现胃癌细胞的凋亡指数增加,提示肿瘤细胞恶性程度有所降低,反义核酸技术封闭谷氨酰胺酶基因可能成为肿瘤基因治疗的一条新途径.     

胃癌裸鼠移植瘤生长过程中反义血管内皮生长因子-C的作用

目的:通过观察胃癌裸鼠移植瘤的生长过程,研究反义血管内皮生长因子-C(Anti-sense vascular endothelial growth factor-C,Anti-sense VEGF-C)基因转染胃癌细胞后对其在裸鼠的成瘤性和肿瘤脉管生成中的作用.方法:将30只裸鼠随机分成3组,将转染了anti-sense VEGF-C基因、转染空白质粒及未转染质粒的人胃癌细胞系SGC-7901 3种细胞的细胞悬液,分别接种于3组裸鼠皮下,使之在裸鼠皮下产生肿瘤结节,观察肿瘤生成的速度并对肿瘤组织中的微淋巴管及微血管进行检测.结果:转染anti-sense VEGF-C基因裸鼠肿瘤生长速度明显减慢且瘤体较小(P＜0.05).第1、2、3周,转染anti-sense VEGF-C组肿瘤组织中微淋巴管密度较其他2组明显减少(P＜0.05):转染anti-sense VEGF-C组分别为4.0±2.2/HF、6.0±3.1/HF和9.0±2.7/HF;转染空白质粒组分别为6.0±8.7/HF、9.0±3.5/HF和18.0±7.2/HF;未转染质粒组分别为7.0±4.9/HF,9.0±6.4/HF和19.0±6.5/HF.但新生血管生成的数量3组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论:anti-sense VEGF-C转染对人胃癌细胞SGC-7901裸鼠成瘤性及肿瘤淋巴管生成有明显的抑制作用,但对肿瘤新生血管的形成影响不大.VEGF-C可能参与了胃癌新生淋巴管的形成过程.     

胃癌细胞环氧合酶-2的表达对内皮细胞生物学行为的影响

目的 以环氧合酶-2(cyclooxygenase,COX-2)高表达的胃癌细胞系SGC7901及其反义核酸转染细胞为模型,观察胃癌细胞COX-2的改变对体外培养的内皮细胞迁移及其管状形成能力的影响,初步探讨COX-2的表达在胃癌血管发生过程中的作用.方法 通过半定量RT-PCR和Western bloc检测SGC7901、7901-P(空栽体对照)、7901-AS(反义COX-2转染细胞)细胞中COX-2的蛋白及mRNA表达水平.采用半定量RT-PCR技术检测3组细胞中内皮细胞特异性血管发生因子的表达;然后收集其条件培养基刺激内皮细胞,观察不同条件下内皮细胞迁移的数目及其所形成管腔样结构的长度.结果 反义核酸转染后.COX-2 mRNA及蛋白表达水平均较亲本细胞及其空载体转染细胞降低;胃癌细胞VEGF、Ang-1的表达明显下调,其条件培养基刺激内皮细胞后,内皮细胞的迁移能力及管状形成能力均较亲本细胞和空载体转染细胞下降(P<0.01).结论 抑制COX-2表达可降低内皮细胞的血管生成能力.COX-2的过度表达可能通过提高血管发生因子的水平来影响内皮细胞的迁移和血管形成,从而促进肿瘤的发生、发展及其转移.     

下调胃癌细胞PDGF-D表达对共培养HUVECs生长和功能的影响

目的：探讨通过RNA干扰下调血小板源性生长因子-D（PDGF-D）基因在胃癌SGC-7901细胞中的表达对与其共培养的脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）生长和功能的影响.方法：构建靶向PDGF-D的短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体,转染胃癌SGC-7901细胞后,通过RT-PCR,Western Blot检测干扰前后PDGF-D的表达;用ELISA法检测培养液上清中血管内皮生长因子（VEGF）的含量;将胃癌细胞SGC-7901与HUVECs共培养后,细胞计数法检测细胞生长变化,流式细胞术测量细胞周期变化,血管形成实验检测HUVECs的血管形成能力.结果：PDGF-D-shRNA1,PDGF-D-shRNA2重组载体均能使SGC-7901细胞中PDGF-D基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调（P〈0.05）,且后者抑制效果更好;干扰后胃癌细胞培养液上清中的VEGF下降;与转染后的SGC-7901细胞共培养的HUVECs生长速度明显变慢,且无管状结构形成.结论：重组真核载体能有效抑制SGC-7901细胞的PDGF-D表达,并通过减少VEGF的表达来抑制HUVECs生长和血管形成能力.     

重组质粒pEGFP-N1-EMMPRIN对胃癌SGC-7901细胞侵袭和迁移的影响

目的 构建人细胞外金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN）重组质粒,观察其在胃癌SGC-7901细胞中的表达及对细胞侵袭和迁移的影响。方法 从结肠癌细胞株SW-480中提取总RNA,通过RT-PCR获得EMMPRIN基因,连接至载体pEGFP-N1,构建重组质粒pEGFP-N1-EMMPRIN,通过脂质体Lipofectamine 2000转染胃癌SGC-7901细胞;RT-PCR和Western blotting分别检测EMMPRIN mRNA和蛋白在SGC-7901细胞中的表达,Transwell实验检测EMMPRIN对SGC-7901细胞侵袭和迁移的影响。结果 重组质粒pEGFP-N1-EMMPRIN构建成功,并在SGC-7901细胞中表达,RT-PCR和Western blotting检测示转染后SGC-7901细胞中EMMPRIN mRNA和蛋白表达均增加,Transwell实验检测示转染后SGC-7901细胞的侵袭和迁移能力均显著增强。结论 EMMPRIN可显著增强肿瘤细胞的侵袭与迁移能力。     

胃癌组织和SGC-7901细胞中nucleostemin基因表达的实验研究

目的检测nucleostemin(NS)基因在胃癌组织和胃癌SGC-7901细胞中的表达情况。方法21例胃癌手术标本,提取胃癌组织和胃癌SGC-7901细胞株总RNA,用半定量RT-PCR方法检测胃癌组织和SGC-7901中NS基因的表达情况。用脂质体法将PCDNA4/C-NS-silencer质粒及空载体PCDNA4/C-vector质粒分别转染SGC-7901细胞,分别命名为silencer组和vector组,未转染的SGC-7901细胞记为normal组,RT-PCR方法检测NS基因表达量。用MTT法检测3组细胞的生长增殖情况。结果胃癌组织和SGC-7901细胞中皆有NS基因表达。定性分析显示,与vector组和normal组比较,silencer组细胞趋于分化,NS基因表达量下降。细胞培养24 h、48 h、72 h后,si-lencer组和vector组细胞增殖抑制率间差别均有统计学意义(P<0.01)。结论胃癌组织和SGC-7901细胞中有NS基因表达;NS基因特异性RNA干扰使NS基因表达量下降,抑制SGC-7901细胞株体外增殖。     

环氧合酶-2在胃癌组织中的表达及其意义

目的探讨环氧合酶-2(COX-2)在胃癌组织中的表达及其意义.方法应用免疫组化法检测40例胃癌石蜡标本及10例正常胃组织中COX-2的表达.结果 COX-2在正常胃组织中没有表达,而胃癌组织中表达阳性率为60%,其阳性表达与肿瘤TNM分期及淋巴结转移有关(P＜0.05).结论 COX-2表达与胃癌的发生、发展及转移有关.     

Grb2 与mTOR在胃癌中的表达

目的 探讨胃癌组织中Grb2 与mTOR的表达及其与胃癌临床病理因素和预后的关系。方法 应用免疫组织化学法观察326例胃癌组织Grb2 与mTOR的表达特点,结合临床病理资料进行统计学分析。结果 Grb2 和mTOR在正常胃粘膜上皮和管状腺瘤组织中未见阳性染色或仅少量细胞呈淡黄色。167例(51.2%)胃癌组织Grb2 染色阳性,其中79例Grb2 高表达,Grb2 表达与胃癌肿瘤大小、浸润深度及临床分期呈正相关（P<0.05）。175例（53.7%）胃癌组织mTOR染色阳性,其中高表达92例, mTOR表达与胃癌肿瘤大小、浸润深度、分化程度、淋巴结转移及临床分期呈正相关（P<0.05）。两者表达具有高度的一致性（P<0.01）,且均与预后有关。结论 Grb2 和mTOR在胃癌中出现异常表达,两者共同促进了胃癌的发生及发展,可作为胃癌治疗的靶点。     

环氧化酶-2和survivin在胃癌组织中的表达及其意义

目的:检测环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)及抑制凋亡基因家族成员survivin在胃癌组织中的表达,并探讨其意义。方法:利用半定量RT-PCR法检测82例胃腺癌及对应的正常胃组织中COX-2和survivin的表达。结果:①COX-2及survivin在正常胃组织中均不表达,在胃癌组织中的表达阳性率分别为51.2%及62.2%。②COX-2和survivin表达量与肿瘤的分化程度有关,分化程度越低两者表达量越高,高分化胃腺癌与低分化胃腺癌比较,差异有显著性统计学意义(P<0.05)。结论:COX-2和survivin在胃癌中的表达高于正常组织,与肿瘤的分化程度有关。     

胃癌组织hMSH2基因突变的检出

[目的]研究hMSH2基因表达及其突变在胃癌发生中的作用。[方法]应用反转录一聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测24例胃癌组织及15例癌旁组织的hMSH2mRNA表达情况。[结果]胃癌组的hMSH2mRNA检出率为50％（12／24）,高于癌旁胃黏膜组的20％（3／15）;胃癌组织突变检出率为20．8％（5／24）,高于癌旁胃黏膜的0％（0／15）;5例突变中,杂合性突变2例,纯合性突变3例。在配对的15例中,仅胃癌组检出突变3例,均为纯合性突变。[结论]胃癌的发生伴随着hMSH2基因的表达上调,这种表达上调可能与该基因突变有关。     

胃癌螺旋CT诊断与癌组织中环氧合酶-2蛋白的测定

目的:探讨螺旋CT 对胃癌的诊断价值及螺旋CT征象与癌组织中环氧合酶-2(COX-2)蛋白表达间的关系.方法:胃癌患者55例(男39例,女16例;TNM分期:Ⅰ期5例,Ⅱ期13例,Ⅲ期20例,Ⅳ期17例;浸润深度:T2 9例,T3 29例,T4 17例;淋巴结转移:N0 18例,N1 11例,N2 26例)行低张力水充盈螺旋CT三期增强扫描,术后采用免疫组织化学SP法检测肿瘤组织中COX-2的表达,并将螺旋CT结果与病理、COX-2表达进行对比分析.结果:螺旋CT三期增强扫描对55例胃癌患者T分期诊断的准确性为83.6%(46/55),N分期的准确性为78.2%(43/55),TNM分期的准确性为80.0%(44/55).55例胃癌组织中COX-2阳性表达率为63.7%(35/55),与螺旋CT征象的浆膜浸润、淋巴结转移及TNM分期均相关(χ2＝4.243,P＝0.039;χ2＝10.228,P＝0.001;χ2＝14.556,P＝0.000).结论:螺旋CT可较准确反映胃癌的浸润、转移及TNM分期,螺旋CT与COX-2测定相结合,可以提高对胃癌浸润、转移的诊断准确性.     

Ang-2、MVD在胃癌中的表达及其临床意义

目的探讨血管生成素-2（Ang-2）在人胃癌组织中表达及其与微血管密度（MVD）和临床病理特征的关系。方法应用免疫组化两步法检测51例人胃癌组织中Ang-2、CD34的表达，并以24例正常胃黏膜标本作为对照。对CD34阳性血管进行MVD计数，并结合临床资料进行统计学分析。结果胃癌组织中Ang-2的表达明显高于正常胃组织（P〈0．01），Ang-2的表达与MVD呈明显正相关（r=0．71，P〈0．01），Ang-2表达与胃癌的大小、有无淋巴结转移、浸润深度、TNM分期有关（P〈0．01）。胃癌组织中的MVD明显高于正常胃组织（P〈0．01）。结论胃癌组织中Ang-2过度表达可能在肿瘤的血管生成和进展过程中起着重要作用。     

细胞周期蛋白E2基因mRNA在胃癌组织中的表达

目的了解细胞周期蛋白E2（Cyclin E2）基因mRNA在胃癌组织中的表达情况及Cyclin E2与临床肿瘤病理的关系，探讨Cyclin E2在胃癌发生、发展、侵袭与转移中的作用。方法收集40例手术切除并经病理检查证实的胃癌组织标本，用于RNA提取。按Lauren方案分为肠型胃癌11例，弥漫型胃癌29例；按有无胃周围淋巴结转移分为转移组28例，非转移组12例。临床分期采用UICC的TNM方案，Ⅰ、Ⅱ期13例，Ⅲ、Ⅳ期27例。用RT-PCR法检测胃癌组织Cyclin E2基因mRNA表达。结果肿瘤组织表达Cyclin E2 mRNA均明显高于正常对照组织（P〈0.05）。在肿瘤组织中可见Cyclin E2 mRNA在有淋巴结转移的肿瘤组织表达明显高于非淋巴结转移的肿瘤组织（P〈0.01），TNM分期中Ⅲ、Ⅳ期者Cyclin E2 mRNA表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期者（P〈0.05）。肿瘤组织中Cyclin E2 mRNA表达与性别及Lauren分型无关（P〉0.05）。结论Cyclin E2基因可能促使胃癌转移，其表达水平可能有助于临床分期。     

COX-2蛋白在胃粘膜癌前病变与胃癌中表达的意义

目的探讨环氧合酶2(COX2)蛋白在胃粘膜肠上皮化生、非典型增生及胃癌中的表达情况。方法选择幽门螺杆菌(Hp)感染的具有不同病变胃粘膜的胃癌手术切除标本,根据病理结果分组为肠上皮化生、不典型增生、肠型胃癌(各51例)和弥漫型胃癌32例。用免疫组化方法测定各组中COX2蛋白表达情况。比较COX2蛋白在上述各组中的表达强度并与正常粘膜对照。结果正常粘膜和弥漫型胃癌COX2蛋白表达均为阴性。肠上皮化生、非典型增生、肠型胃癌COX2蛋白阳性率分别为58.82%(30/51)、64.71%(33/51)、84.31%(43/51),表达强度组间均有显著性差异(P<0.05)。结论COX2在Hp感染的肠型胃癌发展的早期阶段即开始表达,且在肠型胃癌的发生发展过程中表达水平逐渐增高。     

环氧合酶-2蛋白在胃癌发生发展中的表达

目的研究环氧合酶-2（COX-2）蛋白在胃癌、癌前病变、淋巴结转移灶等组织中的表达。方法应用免疫组化SP法和RT—PCR法检测甘肃省河西地区90例胃癌,及其80例增生性病变,22例正常胃黏膜上皮和29例淋巴结转移灶中COX-2的表达。结果免疫组化结果提示正常胃黏膜上皮、增生病变及原位癌中均未发现有COX-2的表达;无淋巴结转移的胃癌原发灶中COX-2的阳性表达率是46％,有淋巴结转移的胃癌原发灶中阳性表达率是72％,淋巴结转移灶中阳性表达率是90％。在鳞状细胞浸润癌中COX-2呈低表达（14％）,在浸润性腺癌中高表达（78％）。RT-PCR结果与免疫组化结果相似。结论COX-2的表达与胃癌的浸润、淋巴结转移有关,其表达具有组织选择性。