HIV-I编码病毒蛋白R基因在真核细胞中的表达及其表达蛋白对KSHV溶解性周期复制的影响

目的:构建含人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)编码病毒蛋白R(Vpr)基因的重组真核表达质粒并初步探索Vpr基因编码蛋白对卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)溶解性周期复制的影响.方法:构建pVpr-Flag重组质粒并进行酶切鉴定和序列测定;将pVpr-Flag重组质粒临时转染BCBL-1和NIH3T3细胞,采用RT-PCR、IFA和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测Vpr基因的表达情况:提取临时转染pVpr-Flag重组质粒的BCBL-1细胞总RNA,进行RT-PCR检测KSHV次要衣壳蛋白编码基因ORF26(仅在病毒裂解期表达)mRNA转录水平,初步探索HIV-1 Vpr基因编码蛋白对KSHV复制的影响.结果:克隆的Vpr基因序列与GenBank中已登记的Vpr序列100%同源.RT-PCR、IFA和Western blot结果显示Vpr基因mRNA及其编码蛋白在真核细胞中得到了转录和表达.RT-PCR结果进一步显示,Vpr基因编码蛋白能够降低KSHVORF26mRNA转录水平.结论:成功构建含Vpr基因序列的重组质粒并在真核细胞中获得正确表达:初步探索表明Vpr蛋白能够抑制KSHV溶解性周期复制.     

人类免疫缺陷病毒１型病毒复制负调控因子编码基因的克隆及在ＢＣＢＬ-１细胞和ＮＩＨ／３Ｔ３细胞中的表达

目的:分离克隆人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)编码的病毒复制负调控因子(Nagative factor,Nef)基因,并将其导入BCBL-I细胞和NIH/3T3细胞中进行表达.方法:根据GenBank登记的Nef基因核苷酸序列设计PCR引物,在其5'端分别引入EcoR I和Sal I酶切位点;以含有Nef基因的pCINL质粒为模板,扩增Nef基因,经双酶切后克隆进真核表达载体pCI-neo中.为了便于蛋白检测,在下游引物5'端引入Flag序列,构建重组真核表达质粒.重组质粒经酶切鉴定、核酸序列测定和分析后分别瞬时转染BCBL-I细胞和NIH/3T3细胞,用RT-PCR、Western blot分别从核酸和蛋白水平检测Nef基因的表达情况.结果:成功构建了含Nef基因的重组真核表达质粒,核酸序列分析显示,克隆的Nef基因序列全长651 bp,与GenBank中登记的Nef基因序列100%同源,引入的Flag序列完全正确;RT-PCR和Western blot都在Nef预期位置检测到特异性条带.结论:HIV-1 Nef基因在BCBL-1细胞和NIH/3T3细胞中获得了正确表达.     

人类疱疹病毒8型病毒干扰素调节因子编码基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的:分离、克隆人类疱疹病毒8型(HHV-8)编码的病毒干扰素调节因子(virusinterferonregulatoryfactor,vIRF)基因K9,并将其导入真核细胞中进行表达。方法:根据GenBank登记的K9基因核苷酸序列设计一对PCR引物,其5′端分别引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。以原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增K9基因,经双酶切后克隆进真核表达载体pcDNA3.1( )中,构建重组真核表达质粒pK9。为了便于蛋白检测,再设计第二对引物,上游引物不变,在下游引物5′端引入了Flag序列。以质粒pK9为模板再次PCR,扩增K9-Flag基因,并把K9-Flag序列克隆入pcDNA3.1( )中,得到重组质粒pK9F。重组质粒经酶切鉴定,核酸序列测定和分析后瞬时转染NIH3T3细胞,用RT-PCR、Westernblot分别从核酸和蛋白水平检测K9基因的表达情况。结果:PCR分离、克隆的K9-Flag序列全长1380bp,核酸序列分析显示克隆的K9基因与GenBank中己经登记的K9基因序列100%同源,引入的Flag序列完全正确;RT-PCR和Westernblot都在K9预期位置检测到特异性条带。结论:HHV-8K9基因在NIH3T3细胞中获得了正确表达。     

HHV-8 K13基因编码蛋白在人血管内皮细胞和前列腺癌细胞系中的表达及其对细胞增殖影响的初探

目的:研究人类疱疹病毒8型(HHV-8)K13(v-FLIP)基因编码蛋白分别在人血管内皮细胞和前列腺癌细胞中的表达及其对上述两种细胞增殖能力的影响.方法:将PEF-K13-Flag-IRES/Pure重组质粒瞬时转染人血管内皮细胞系EA.HY926细胞和前列腺癌细胞系PC-3细胞,采用Western blot方法检测...     

分泌性HIV-1 Nef-EGFP融合蛋白表达载体的构建与鉴定

目的： 构建含有人类免疫缺陷病毒I型（human immunodeficiency virus type I,HIV-1）负性调节因子（negative regulation factor,Nef）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的重组融合蛋白分泌性表达载体,并检测该融合蛋白在真核细胞中的表达及其在培养上清中分泌情况,为进一步研究Nef功能奠定基础。方法： 利用PCR扩增出HIV-1 Nef和EGFP基因,插入到分泌性表达载体pSecTag2B中。构建的pSecTag2B-Nef-EGFP融合蛋白表达质粒,转染293T细胞,荧光显微镜下观测细胞中Nef-EGFP融合蛋白的表达。收集细胞及上清液,蛋白质印迹和ELISA法分别检测Nef-EGFP融合蛋白的表达及其分泌。结果： 限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列测定证实,成功构建了含有Nef-EGFP基因的分泌性表达载体,该质粒转染293T细胞后,蛋白质印迹法能够检测到Nef EGFP融合蛋白的表达条带,ELISA法检测上清液中目的蛋白分泌量为1.7 ng/ml。结论： 成功构建含有Nef-EGFP的融合蛋白表达质粒,融合蛋白Nef EGFP在293T细胞中获得表达,并能分泌到胞外。     

人类疱疹病毒8型包膜糖蛋白编码基因K8.1的分离、克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：分离、克隆人类疱疹病毒8型(HHV-8)包膜糖蛋白K8．1编码基因，并置于大肠杆菌中作融合表达。方法：设计一对PCR引物，在引物的5′端分别引入BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点，以佛波酯(TPA)刺激的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板，PCR扩增出K8．1编码基因，克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中，构建含K8．1基因重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21感受态细胞，以异丙基硫代-β—D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果：分离、克隆的411bp序列与基因数据库中所登记的HHV-8 K8．1序列呈现100％同源性。IPTG诱导后的菌体，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，显示有一个41ku的融合表达蛋白产生。结论：HHV-8K8．1编码基因在E.coli中初步获得正确表达。     

HIV-1感染相关细胞因子激活BC-3细胞中潜伏感染的人类疱疹病毒8型的复制研究

目的:研究证实HIV-1感染相关细胞因子能够诱导原发性渗出性淋巴瘤(PEL)的另一细胞系BC-3中潜伏的人类疱疹病毒8型(HHV-8)发生可溶性周期复制。方法:将TNF-α和HIV-1感染CD4~+ T淋巴细胞常释放的细胞因子IFN-γ、HGF/SF、OSM,连续加入到BC-3细胞中作持续刺激,分别于刺激后的第3天和第7天收集BC-3细胞。采用免疫组化染色法(IHC)检测HHV-8免疫原性蛋白ORF59表达;电子显微镜观察病毒的形成;Northernblot和 定量PCR检查次要衣壳蛋白ORF26 mRNA转录。结果:IFN-γ、HGF/SF、OSM和TNF-α均能不同程度上调ORF26 mRNA表达。其中,IFN-γ刺激BC-3细胞第7天,HHV-8 ORF26 mRNA表达上升了6.1倍;ORF59蛋白表达上升到20％,与此同时,BC-3细胞中可观察到成熟的病毒粒子。另外,TNF-α刺激BC-3细胞第7天,HHV-8 ORF26 mRNA表达也上升了2.5。结论:TNF-α和HIV-1感染释放细胞因子能够诱导PEL另一细胞系BC-3中潜伏的HHV-8发生可溶性周期复制。     

HIV-1 Ta填核表达载体的构建及在Huh-7细胞中表达

目的构建1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)反式激活因子(Tat)基因真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞中的有效表达。方法以含有HIV-1全长基因的质粒pNL4-3为模板,通过PCR扩增HIV-1tat第一外显子,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入真核表达质粒pCDNA3.1( ),构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-tat,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入人体肝癌细胞系Huh-7细胞。RT-PCR检测其基因转录情况,Westernblot鉴定其是否能够表达相应的目的蛋白质。结果成功扩增了Tat基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pCDNA3.1-tat,RT-PCR和Westernblot方法证实该质粒能在Huh-7真核细胞中有效表达HIV-1Tat目的蛋白质。结论成功构建了HIV-1Tat基因的真核表达质粒载体,并在Huh-7细胞中表达,为在Huh-7细胞模型中研究Tat的功能奠定了基础。     

妊娠激素对HIV-1体外感染MT-2细胞及复制的影响

目的研究妊娠激素对HIV-1体外感染MT-2细胞及复制的影响.方法检测终浓度为1×106U/L的重组人绒毛膜促性腺激素(hCG)和终浓度为10-7mol/L(相当于妇女分泌期外周血水平)、10-6mol/L(相当于妊娠妇女外周血水平)和10-5mol/L(相当于母胎界面局部浓度)的雌二醇(E2)和孕酮(P4)对HIV-1介导荧光标记的HIV-1ⅢB/H9与未标记荧光的MT-2细胞融合的影响;ELISA法检测感染HIV的MT-2细胞培养上清p24抗原含量来探讨妊娠激素对HIV-1复制的影响.结果10-5mol/L的E2和P4可以明显抑制HIV-1介导的细胞融合,合胞体形成数分别为14.87±2.18和16.52±3.20,与对照组(28.93±4.22)比较有极显著性差异(P＜0.01),hCG和10-6mol/L的E2也能抑制HIV-1ⅢB/H9和MT-2细胞的融合,融合数分别为22.18±3.87和24.16±4.25,与对照组比较有显著性差异(P＜0.05).hCG及10-5mol/L E2和P4能明显降低感染细胞培养上清中p24抗原含量,依次为(42.61±2.97)pg/ml、(44.28±3.42)pg/ml和(45.37±2.88)pg/nl,与对照组(57.22±3.10)pg/ml比较有显著性差异(P＜0.05).结论妊娠激素hCG、E2和P4体外可以抑制HIV-1感染MT-2细胞及在其内复制.     

人类8型疱疹病毒小衣壳蛋白ORF65基因的原核表达及其生物信息学分析

目的：构建人类8型疱疹病毒（HHV-8）小衣壳蛋白（ORF65）基因重组原核表达质粒并诱导表达,获得其重组融合蛋白。方法：软件设计引物,在引物两端添加特异性酶切位点,以pGEM-Teasy/ORF65为模板,PCR扩增基因序列,克隆入原核表达载体pET-41a中,构建原核表达质粒pET41a-ORF65,转化大肠杆菌（E.coli）DH5x,经酶切、测序鉴定其插入序列的正确性,转入E.coli BL21（DE3）,并诱导表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法以及序列分析软件DNAMAN 5.0、Vector NTI Suite 6、Primer Primier 5对表达蛋白进行生物信息学分析。结果：测序结果表明所构建pET41a-ORF65原核表达质粒连接正确,SDS-PAGE表明ORF65基因获得成功表达,生物信息学分析显示该蛋白含有1个N糖基化位点,2个蛋白激酶C磷酸化位点,4个胆碱激酶Ⅱ磷酸化位点,4个N肉豆蔻酰化位点,1个酰胺化位点。BlastP数据库的相似性检索发现有与之有较高同源性的蛋白。结论：成功表达HHV-8病毒小衣壳蛋白ORF65,该蛋白与疱疹病毒衣壳蛋白的同源性较高,是疱疹病毒衣壳蛋白家族中的一员。     

人类免疫缺陷病毒-1 Rev蛋白调控卡波济肉瘤相关疱疹病毒的裂解性周期复制与潜伏感染

目的:研究人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)Rev蛋白的表达水平对原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞BCBL-1中卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)裂解性周期复制与潜伏的影响?方法:自表达质粒pCI-neo-Rev中扩增出Rev基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen中构建成慢病毒载体pLenti-Rev,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞?荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(IZsGreen)表达;收集培养上清经0.45 μm滤器过滤后即获得病毒悬液?梯度稀释法测定病毒滴度并感染细胞,RT-PCR和Western blot检测Rev在293T细胞中的表达?用慢病毒感染BCBL-1细胞,同时将表达质粒pCI-neo-Rev转染该细胞,采用Western blot分别检测Rev以及KSHV Rta和vIL-6蛋白的表达;Real-time PCR进一步从mRNA水平上定量验证Rev对KSHV复制的影响?结果:限制性内切酶酶切反应和基因测序证实成功构建了携带Rev基因的慢病毒表达载体,病毒滴度为2×107 TU/ml?重组慢病毒感染BCBL-1细胞72 h后,能够检测到Rev蛋白的表达?Western blot结果显示,低水平表达的Rev能够上调KSHV裂解期蛋白Rta?vIL-6的表达,而高水平表达的Rev则能够抑制Rta和vIL-6的表达?Real-time PCR进一步验证了该结果,表明高水平表达的Rev能够显著抑制BCBL-1中Rta的mRNA转录,96 h尤为明显?结论:成功构建了含Rev基因的慢病毒表达载体,获得的病毒能够有效感染BCBL-1细胞,并在其中大量表达Rev蛋白?Rev蛋白的表达水平对KSHV的复制与潜伏可能起到复杂的调控作用?     

含HIV-1 Vif基因重组慢病毒表达载体的构建及其对KSHV裂解性周期复制影响的初探

目的:利用慢病毒表达载体将HIV-1Vif基因导入原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞BCBL-1中使之持续表达目的蛋白Vif,并检测Vif对其中潜伏KSHV裂解性周期复制的影响。方法:自表达质粒pCI-neo-Vif中扩增出Vif基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen中构建成慢病毒载体pHAGE-Vif,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞。荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达情况;收集培养上清经0.45μm滤器过滤后即获得病毒悬液。梯度稀释法测定病毒滴度,感染293T细胞,48h或72h后进行RT-PCR和Western blot检测Vif基因的转录和表达情况。以MOI为1.0的病毒量感染靶细胞BCBL-1,利用Westernblot技术检测Vif蛋白的表达,同时检测KSHVvIL-6和Rta的蛋白表达水平,初步探讨Vif对KSHV复制的影响。结果:限制性内切酶检测和基因测序证实成功构建了携带Vif基因的慢病毒表达载体,滴度为4×107efu/ml。以MOI为1.0的重组慢病毒感染靶细胞BCBL-172h后,能够检测到外源基因Vif的...     

HIV-1 Tat对KSHV感染SK-N-SH细胞的影响

目的:初步探索人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)反式激活蛋白(Tat)对卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)感染人神经母细胞瘤细胞系SK-N-sH细胞(SK细胞)的影响.方法:将原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-I细胞与SK细胞共培养.观察SK细胞的细胞病变效应(CPE)并采用Real-time PCR检测KSHV在SK细胞中的复制.重组质粒Tat+pcDNA3.1(+)和空载体pcDNA3.1(+)分别转染SK细胞,经G418筛选获得抗性克隆,以RT-PCR和Western blot检测Tat基因的表达.通过BCBL-1细胞与SK-Tat/SK-vector细胞共培养,采用Real-time PCR检测SK-Tat/SK-vector细胞中KSHV裂解期基因ORF50和26的mRNA表达.结果:细胞共培养后,SK细胞出现CPE且SK细胞中检测到KSHV的基因.RT-PCR和Western blot均在Tat预期位置检测到特异性条带.Real-time PCR检测显示Tat降低KSHV ORF50和26 mRNA转录水平.结论:初步探索表明,在细胞共培养过程中Tat蛋白抑制KSHV在SK细胞中的复制.     

Importin α1与HIV-1整合酶相互作用及其对病毒复制的影响（英文）

目的研究HIV-1整合酶与细胞蛋白Importinα1（Impα1）的相互作用及其对HIV-1复制的影响。方法采用化学发光免疫共沉淀系统定量检测细胞内HIV-1整合酶与Impα1蛋白的相互作用,同时利用基因沉默技术下调CD4＋C8166 T细胞中Impα1的表达,以研究Impα/β入核转运途径对HIV-1复制的影响。结果当T细胞内Impα1表达下降时,HIV-1对其感染性显著减弱。Real-time PCR分析结果显示,尽管病毒逆转录未受到影响,但其2-LTR DNA（入核指标）及整合DNA的形成受到了抑制,提示Impα1的下调明显影响HIV-1入核转运过程。结论该研究为HIV-1整合酶与Impα1蛋白之间的相互作用及其在病毒感染中的影响提供了重要的实验依据。     

人类8型疱疹病毒K8.1基因原核表达重组质粒的构建

目的：构建人类8型疱疹病毒（HHV-8）K8.1基因原核表达重组质粒,获得HHV-8外壳蛋白重组融合蛋白,为制备检测抗原建立平台。方法：根据基因库K8.1全长基因序列和pET41a载体的多克隆位点设计引物,分别在引物两端添加特异酶切位点,以pGEM-Teasy/K8.1质粒为模板,PCR扩增K8.1基因全长序列,克隆入原核表达载体pET-41a,构建原核表达质粒pET41a-K8.1;转化大肠杆菌DH5α,经酶切、测序鉴定其插入序列的正确性。结果：酶切鉴定表明在约500bp处可见酶切片段,测序结果表明构建的pET41a-K8.1原核表达质粒连接正确,插入的K8.1基因片断为494bp。结论：成功构建了pET41a-K8.1原核表达质粒,为获得重组融合HHV-8外壳蛋白建立了平台。     

转录因子NF-κB在HIV-1表达中的作用

NF-κB／Rel转录因子是由P50和P65组成的同源二聚体以及异源二聚体。它参与许多基因产物的表达和激活，NF—κB／Rel蛋白家族在炎症反应(如调控合成多种炎症细胞因子，趋化因子，粘附因子，细胞表面受体，急性期蛋白等)、免疫、应激、细胞生长及癌症发生与生长等诸多生物学过程中的作用受到越来越多的关注。近年来，人们     

RNAi真核表达载体上报告基因的构建及其在人结肠癌HCT-8细胞中的表达

目的:构建携带绿色荧光蛋白报告基因的pSilencer3.1-H1真核表达载体,并转染真核细胞稳定表达,为进一步应用于RNAi相关研究奠定了基础。方法:应用PCR方法从pEGFP-C1标准质粒中获得GFP基因片段,在克隆载体中鉴定、测序;用DNA重组技术将片段定向插入RNAi常用载体pSilencer3.1-H1质粒中,构建pSilencer3.1-H1/GFP重组表达载体,经PCR及酶切鉴定后,通过脂质体介导转染HCT-8真核细胞;荧光显微镜观察GFP在细胞内的表达。结果:真核表达载体pSilenc-er3.1-H1中正确插入了GFP基因片段,并在人结肠癌HCT-8真核细胞中稳定的表达。结论:成功构建了pSilencer3.1-H1/GFP真核表达载体。