外源性碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肌源性干细胞增殖的影响

背景：肌源性干细胞在体外培养过程中存在纯化、扩增、定向分化等难题,碱性成纤维细胞生长因子作为生物活性因子的一员,因其生物活性的多效性而备受关注。 目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肌源性干细胞体外增殖的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-04/07在沈阳医学院完成。 材料：健康雄性Wister大鼠5只,由沈阳医学院实验动物中心提供。碱性成纤维细胞生长因子为珠海生物制品有限公司产品。 方法：无菌条件下取大鼠左前肢肱三头肌,采用酶消化法分离肌源性干细胞,应用密度梯度离心法和差速贴壁法进行纯化。取第2代肌源性干细胞,分别用终浓度为6.25,12.50,25.00,50.00,100.00 μg/L碱性成纤维细胞生长因子进行干预;以单纯加入200 μL生长培养基作为空白对照组,以加入200 μL生长培养基+肌源性干细胞作为阴性对照组。分别于培养24,48,72,96 h加入MTT溶液。 主要观察指标：免疫细胞化学法鉴定大鼠肌源性干细胞,MTT比色法检测细胞增殖情况。 结果：肌源性干细胞多呈Sca-1阳性反应,少数呈Desmin阳性反应。①不同浓度碱性成纤维细胞生长因子对肌源性干细胞的促增殖效应：与阴性对照组比较,各浓度碱性成纤维细胞生长因子组对肌源性干细胞均有明显的促增殖效应(P < 0.05);浓度为6.25~50.00 μg/L时促增殖作用随其质量浓度升高而显著增强(P < 0.01),至50.00 μg/L时其促增殖作用接近顶峰。②碱性成纤维细胞生长因子在不同培养时间点对肌源性干细胞的促增殖效应：随培养时间的延长肌源性干细胞明显增殖,与阴性对照组比较,碱性成纤维细胞生长因子组出现显著促增殖效应(P < 0.01)的时间为培养96 h。 结论：碱性成纤维细胞生长因子可促进体外培养的大鼠肌源性干细胞增殖,且呈浓度-时间依赖性增加,50.00 μg/L与96 h为较佳的体外培养质量浓度和时间。     

碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子对脑缺血大鼠内源性神经干细胞增殖的影响

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)对大鼠局灶性脑缺血模型内源性神经干细胞增殖的影响。方法通过大脑中动脉阻塞法建立大鼠的局灶性脑缺血模型,随机分组后分别皮下注射生理盐水、bFGF、EGF以及bFGF EGF;每日1次,共3d,此后每3d1次。采用免疫组化法,以5溴脱氧嘧啶尿苷(Brdu)标记神经干细胞,观察并比较各组大鼠制模后第7d、14d、21d侧脑室室管膜下区(SVZ)和海马齿状回Brdu阳性细胞的表达。结果制模后,各组大鼠双侧SVZ和海马齿状回均出现Brdu阳性细胞,且阳性细胞数随时间递减;与对照组相比,药物干预组Brdu阳性细胞数显著增加(P<0.05～0.01);与单药组相比,bFGF EGF组(联合组)Brdu阳性细胞数增加更明显(P<0.05～0.01);各药物干预组在制模第7dBrdu阳性细胞数最多(P<0.05～0.01)。结论皮下注射bFGF、EGF可促进脑缺血大鼠模型内源性神经干细胞的增殖;bFGF和EGF联合应用对脑缺血大鼠神经干细胞的增殖效应有协同作用。     

胰岛素样生长因子Ⅰ和碱性成纤维细胞生长因子对人类牙乳头间充质细胞增殖和分化的影响**☆

背景：研究表明,胰岛素样生长因子Ⅰ和碱性成纤维细胞生长因子对细胞的增殖分化有重要作用,但对人类牙乳头间充质细胞生物学特性有何影响尚不清楚。 目的：观察胰岛素样生长因子Ⅰ和碱性成纤维细胞生长因子对体外培养人类牙乳头间充质细胞增殖和分化能力的影响。 方法：在建立人类牙乳头间充质细胞培养模型的基础上,①分别用含体积分数为1%或10%胎牛血清的DMEM/F12培养基将两种生长因子配制成不同的实验终浓度,取第4代生长良好的人类牙乳头间充质细胞,分别加入含0,0.1,1,10,100 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和0,25,50,75,100 μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ的培养基(0 μg/L作对照),培养96 h后四甲基偶氮唑盐法测增殖活性。②设10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子组、100 μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ组、碱性成纤维细胞生长因子+胰岛素样生长因子Ⅰ组和对照组。同上述方法每孔分别加含相应质量浓度生长因子的培养液,分别在培养1,3,5,7 d后,四甲基偶氮唑盐法测细胞增殖活性,改良酶动力学法测定细胞碱性磷酸酶活性。 结果与结论：在0~100 μg/L质量浓度范围时,两种生长因子对人类牙乳头间充质细胞增殖具有促进作用,碱性成纤维细胞生长因子的促增殖作用比胰岛素样生长因子Ⅰ大,联合作用时有协同促增殖作用。碱性成纤维细胞生长因子的最大有效质量浓度为10 μg/L,胰岛素样生长因子Ⅰ的最大作用质量浓度为100 μg/L。在0~7 d时,碱性成纤维细胞生长因子对人类牙乳头间充质细胞的碱性磷酸酶活性影响不明显,随时间的增加,胰岛素样生长因子Ⅰ对细胞碱性磷酸酶活性影响增加,与碱性成纤维细胞生长因子联用时,对增加碱性磷酸酶的活性有协同作用。     

外源性碱性成纤维细胞生长因子对缺血大鼠脑内源性碱性成纤维细胞生长因子表达的影响

目的 研究外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)缩小局灶性脑缺血梗死灶的机制。方法 用免疫组化ABC法检测在局灶性脑缺血模型上给予生理盐水或bFGF后早期生长反应蛋白-1(Egr-1)，bFGF，碱性成纤维细胞生长因子受体(bFGFR)的动态表达。结果 给药组在3h～3d各时间段梗死灶均有不同程度的缩小。对照组和给药组Egr-1表达均表现为3～6h的增强过程，但给药组更强于对照组。对照组12h见有bFGF表达增强，而bFGFR表达3h到达高峰，6h起下降，12h时bFGFR的表达已恢复至正常水平(出现了配体和受体表达时相上不匹配)。给药组bFGF表达提前且增强，3h即见有bFGF表达增强，6h时出现第一峰，从而与bFGFR 3～6h的表达增强过程相吻合。结论 外源性bFGF能缩小梗死灶，该神经保护作用是通过Egr-1蛋白高表达使内源性bFGF的表达增高且提前，从而与bFGFR的表达增强过程重叠而实现的。     

FGF和EGF对神经干细胞增殖及分化的影响

胚胎和成年哺乳动物脑内均存在神经干细胞.成纤维细胞生长因子(FGF)和表皮生长因子(EGF)对神经干细胞的增殖及分化有一定影响.FGF和EGF及其受体在胚胎期和成年期表达各异.FGF和EGF能促进神经干细胞增殖,在不同的条件下对分化的作用不同.     

转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ及其协同作用对人皮肤成纤维细胞增殖的影响

背景：皮肤成纤维细胞注射移植为颜面部皱纹及微小凹陷等治疗提供了一种全新的方法,然而成纤维细胞的获取及体外快速扩增往往需要较长时间,以至于不能满足临床需要。 目的：观察转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ及两者协同作用对体外培养人皮肤成纤维细胞增殖的影响。 方法：人皮肤成纤维细胞原代培养,取第3代细胞种入96孔板,加入不同质量浓度的转化生长因子β1或胰岛素样生长因子Ⅰ作用于细胞,分别作用3,6,9 d采用MTT法检测细胞增殖情况。同法设4个组,分别为：阴性对照组、转化生长因子β1最佳效应浓度组、胰岛素样生长因子Ⅰ最佳效应浓度组、两者最佳效应浓度联用组,作用3,6,9 d采用MTT法检测增殖情况。 结果与结论：作用6 d和9 d,10.0 μg/L转化生长因子β1、50.0 μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ组与对照组相比均有促细胞增殖效应(P < 0.05),此即为各生长因子最佳效应浓度。作用6 d和9 d,转化生长因子β1与胰岛素样生长因子Ⅰ各浓度实验组与相应对照组相比,差异均有显著性意义(P < 0.05)。10.0 μg/L转化生长因子β1与50.0 μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ联合作用9 d可显著促进细胞增殖,与其他组相比,差异有显著性意义(P < 0.05)。提示转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ均可体外促进人皮肤成纤维细胞增殖,最佳效应浓度联用促增殖效果优于各自单独使用。     

胰岛素样生长因子Ⅰ对豚鼠巩膜成纤维细胞增殖的影响☆

目的：研究表明，体内一定浓度的生长因子是保证眼球正常发育的必要条件，过少或过量都会引起巩膜的异常改变。实验拟进一步验证胰岛素样生长因子Ⅰ对体外培养的豚鼠巩膜成纤维细胞生长的影响。 方法：实验于2006-09/2007-03在郑州大学基础医学院省肿瘤病理学重点实验室完成。①实验材料：出生3 d内3色豚鼠后部巩膜组织由郑州大学基础医学院动物实验中心提供；实验用胰岛素样生长因子Ⅰ 为Sigma公司产品。②实验过程及评估：采用器官组织块培养法获取原代巩膜成纤维细胞，选取传3，4代的豚鼠巩膜成纤维细胞用于实验；采用倒置相差显微镜下观察细胞形态并采用免疫化学染色法进行细胞鉴定；应用四甲基偶氮唑盐比色法和流式细胞仪分析技术,观察不同质量浓度胰岛素样生长因子Ⅰ (0.1，0.5，5，10，50 μg/L )对体外培养的豚鼠巩膜成纤维细胞增殖和细胞生长周期的影响。 结果：①巩膜成纤维细胞鉴定：倒置相差显微镜下观察,细胞透亮呈梭形，在细胞密度较低时细胞排列成网状,密度较高时呈束状；波形蛋白染色阳性。胞浆内可见棕黄色阳性反应产物, 证实所培养的细胞为巩膜成纤维细胞。②体外培养的豚鼠巩膜成纤维细胞增殖和细胞生长周期：0.5，5，10 μg/L的胰岛素样生长因子Ⅰ能促进豚鼠巩膜成纤维细胞增殖,呈剂量依赖性(F = 84.510，P =0.000 < 0.05)，最佳质量浓度为10 μg/L。流式细胞仪结果显示, 胰岛素样生长因子Ⅰ处理48 h后,与对照组比较，巩膜成纤维细胞G0~G1期百分比降低（78.2%下到64.5%，P < 0.05）,而S期百分比显著升高（10.4%上升到16.4%，P < 0.05）,增殖指数百分比增高（27.8%增高到56.5 %，P < 0.05）。 结论： 在一定浓度范围内外源性胰岛素样生长因子Ⅰ可以促进体外培养的豚鼠巩膜成纤维细胞增殖。     

碱性成纤维生长因子等诱导间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的　体外定向诱导成人骨髓间质干细胞 (MSC)分化为神经元样细胞。方法　采用Ficoll Paque液 (10 77g/L)离心分离成人MSC ,体外扩增 ,分别采用含碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)和叔丁对甲氧酚 (BHA)或硫代甘油等试剂的无血清DMEM诱导MSC分化为神经元。免疫组化鉴定神经元烯醇化酶 (NSE)、神经丝蛋白 (NF)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)、巢蛋白 (nestin)的表达。结果　成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得 5× 10 5,10代可获得 2× 10 10 个细胞。加入bFGF和BHA等诱导剂或硫代甘油诱导后 ,MSC胞体收缩 ,突起伸出 ;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF、nestin表达阳性 ,GFAP阴性。结论　成人骨髓间质干细胞在体外可以分化为神经元样细胞。     

转化生长因子β1对长波紫外线照射皮肤成纤维细胞胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子表达的影响*☆

背景：研究认为衰老和光老化状态下生长因子的表达不一定一致,生长因子与皮肤老化的关系越来越受到重视。 目的：验证转化生长因子β1对长波紫外线照射体外培养的皮肤成纤维细胞胰岛素样生长因子1、角质细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子表达的影响 。 设计、时间及地点：以体外培养细胞为观察对象,随机重复实验,于2006-07/2008-03在解放军第四军医大学全军整形外科研究所进行。 材料：成纤维细胞来自解放军第四军医大学整形外科门诊患者包皮,采用组织块法培养获得。 方法：通过酶联免疫法(ELISA)使用不同剂量长波紫外线 (0,5 ,10,20 J/ cm2)照射体外培养的皮肤成纤维细胞,测定上清液中胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子、 血管内皮细胞生长因子的质量浓度;以长波紫外线15 J/ cm2为照射剂量,选择不同剂量转化生长因子β1即小剂量组(0.1 μg/L)、中剂量组(1 μg/L)、大剂量组(10 μg/L)对培养的皮肤成纤维细胞进行干预。 主要观察指标：不同剂量长波紫外线照射、以及转化生长因子β1处理后皮肤成纤维细胞胰岛素样生长因子1、血管内皮细胞生长因子、角质形成细胞生长因子的表达。 结果：长波紫外线照射体外培养的皮肤成纤维细胞导致胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子分泌水平下降,血管内皮细胞生长因子分泌升高;转化生长因子β1处理后,转化生长因子β1剂量依赖性地提高长波紫外线照射体外培养的皮肤成纤维细胞分泌的3种细胞因子的水平。转化生长因子β1大剂量组胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子含量明显高于长波紫外线照射组(P < 0.01)。 结论：长波紫外线照射抑制体外培养成纤维细胞中胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子表达, 促进血管内皮细胞生长因子表达。转化生长因子β1可提高长波紫外线照射体外培养的皮肤成纤维细胞分泌胰岛素样生长因子1、角质形成细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子3种细胞因子的水平,有利于真皮内结构的恢复和重建。     

胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子、转化生长因子β1对

背景：生长因子可调整椎间盘细胞的增殖、分化及基质代谢,用于椎间盘退变的生物学治疗,既往的研究偏重于成骨性生长因子对髓核细胞的作用,对纤维环细胞的研究相对较少。 目的：观察体外培养条件下胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子、转化生长因子β1对人退变纤维环细胞生物学活性的影响。 设计、时间及地点：对照观察实验,于2007-11/2008-12在解放军南京军区福州总医院完成。 材料：腰椎间盘手术患者的纤维环组织。 方法：结合酶消化法和组织块培养法,体外单层培养人退变纤维环原代细胞。传代后通过免疫组织化学染色鉴定细胞。对传3代细胞分别采用不同生长因子干预,分为 100 μg/L胰岛素样生长因子1组、10 μg/L 血小板源性生长因子组、10 μg/L 转化生长因子β1组、100 μg/L 胰岛素样生长因子 1+ 10 μg/L 血小板源性生长因子组、100 μg/L 胰岛素样生长因子1+ 10 μg/L 转化生长因子β1组、10 μg/L 血小板源性生长因子+10 μg/L 转化生长因子β1组、100 μg/L 胰岛素样生长因子1+10 μg/L血小板源性生长因子+10 μg/L 转化生长因子β1组,以不加生长因子为对照组。 主要观察指标：免疫组织化学染色观察传3代细胞。干预3,6 d后,采用MTT法测定传3代细胞增殖,ELISA法测定细胞培养上清液中Ⅰ、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖质量浓度。 结果：传3代细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性。胰岛素样生长因子1促进人退变纤维环细胞增殖,轻度抑制细胞合成Ⅰ型胶原,促进合成Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖,促Ⅱ型胶原合成作用轻度强于转化生长因子β1。血小板源性生长因子促进细胞增殖,作用强于胰岛素样生长因子1,其抑制细胞合成Ⅰ型胶原,轻度促进合成Ⅱ型胶原,无促合成聚集蛋白聚糖作用。转化生长因子β1抑制细胞增殖,促进合成Ⅰ、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖,促聚集蛋白聚糖合成作用强于胰岛素样生长因子1。多种因子联合作用较单种未见明显优势,未能呈现协同效应。 结论：胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子、转化生长因子β1明显改变人退变纤维环细胞的生物学活性,可应用于对人类椎间盘退变的生物学治疗。     

体外局部微环境下小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞的定向诱导分化***★

背景：周围微环境能够调节胚胎干细胞在体外的诱导分化情况，可能与多种信号通路及细胞因子作用有关。 目的：观察局部微环境对体外培养的小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞定向诱导分化的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2005-10/2006-04在上海第二医科大学发育生物学研究中心实验室完成。 材料：清洁级孕13.5 d的C57BL/6昆明鼠6只，由中科院上海实验动物中心提供。携带LacZ标记基因的小鼠胚胎干细胞株S8由上海市发育生物学研究中心提供。 方法：取孕鼠胚胎，采用组织块消化法制备小鼠胚胎成纤维细胞，经丝裂霉素C处理得到滋养层细胞。将携带LacZ标记基因的小鼠胚胎干细胞株S8解冻复苏，加入含白血病抑制因子的高糖DMEM培养基体外扩增培养，将细胞克隆吹打成单细胞悬液，加到滋养层细胞上，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。胚胎干细胞传代后，再加入含全反式维甲酸的高糖DMEM培养基，以单纯加入高糖DMEM培养基作为空白对照，调整细胞浓度为3×108 L-1，吹打法悬浮培养48 h，收集悬浮液，反复离心去上清，移入铺有明胶的培养皿中，培养9 d。 主要观察指标：诱导前后细胞形态及生长状态变化，RT-PCR检测诱导后细胞向神经前体细胞的分化情况。 结果：胚胎干细胞在含有白血病抑制因子的高糖DMEM培养基中能够保持未分化状态，克隆生长良好；换用含全反式维甲酸的高糖DMEM培养基悬浮培养后，4.0~5.0 h聚集成团，形成圆球状的类胚体。加入全反式维甲酸的诱导组内胚层细胞呈多边形且数量较多，对照组内胚层细胞呈长梭形且数量少。诱导后细胞表达神经干细胞特异性标志巢蛋白，神经细胞特异性标志微管相关蛋白2呈弱表达，不表达神经胶质细胞特异性标志胶质纤维酸性蛋白。 结论：体外培养的小鼠胚胎干细胞可保持未分化状态，具有不断增殖的能力，经白血病抑制因子与全反式维甲酸两步诱导后可分化为神经前体细胞。     

富血小板血浆对人骨髓间充质干细胞成骨诱导的影响*

背景：富血小板血浆是经过特殊方法提取的血小板含量丰富的血浆,相较普通血清含有更丰富的细胞因子,如血小板衍生因子、转化生长因子β、血管内皮生长因子等。 目的：观察富血小板血浆对成骨诱导人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响,拟探讨促进人骨髓间充质干细胞的增殖与诱导成骨细胞的培养方法。 设计、时间及地点：配对样本对比观察,于2007-03/2008-03在中山大学组织工程实验室完成。 对象：18名健康志愿者,男12名,女6名,平均年龄27.5岁。随机分为3组：富血小板血浆组、胎牛血清组、无血清对照组,每组6人。 方法：抽取18名健康志愿者自体外周静脉血获取富血小板血浆。采用密度梯度离心法获取健康志愿者骨髓间充质干细胞,常规原代培养,传代诱导培养时根据分组情况,分别采用10%AB型血清、10%自体富血小板血浆与无血清,配比高糖DMEM培养基、50 mg/L抗坏血酸、10-8 mol/L地塞米松、10-3 mol/L β-甘油磷酸钠。 主要观察指标：倒置相差显微镜、扫描电镜观察各组细胞形态,MTT法检测细胞增殖情况,细胞碱性磷酸酶活性、骨钙素水平。 结果：3组细胞均在接种后12~24 h开始贴壁,并由圆形逐步变化为梭型、多角形、有多个突起的不规则形状等。细胞传代诱导培养后,富血小板血浆组与胎牛血清组细胞生长迅速,明显快于无血清对照组（P < 0.05）。从传代培养第2、4、6代的细胞生长看,随着培养时间的延长富血小板血浆组细胞增殖明显快于胎牛血清组。３组细胞碱性磷酸酶活性与骨钙素随诱导时间的延长而增高,培养第3,6,9,12天胎牛血清组碱性磷酸酶活性较富血小板血浆组低,培养第15天两组无明显差异。培养第3,6,9天富血小板血浆组细胞内骨钙素含量与胎牛血清组无明显差别,12 d后明显高于胎牛血清组。无血清对照组碱性磷酸酶活性及骨钙素含量较富血小板血浆组变化程度明显减小,并且各时间点碱性磷酸酶活性与骨钙素含量均低于富血小板血浆组（P < 0.01）。 结论：自体富血小板血浆能够有效加快人骨髓间充质干细胞的增殖,并能有效促进诱导培养的人骨髓间充质干细胞成骨特性表达。     

神经干细胞与脑胶质瘤干细胞☆

所有的肿瘤组织并不是由均一的肿瘤细胞所组成的,不同的细胞具有不同的增殖、浸润和转移能力,亦即肿瘤的异质性。其中存在少数担当着干细胞角色的肿瘤细胞,具有干细胞的基本特性,包括自我更新能力、无限的增殖能力和多向分化潜能,为肿瘤干细胞。神经干细胞具有很强的自我更新机制,获得较少突变即有可能恶性转化,而且干细胞存活时间较长,这意味着干细胞比成熟细胞发生细胞复制的错误几率更大,因外界环境的刺激而发生突变的机会更多,最终形成脑胶质瘤干细胞,同时调节神经干细胞增殖和自我更新的基因在脑胶质瘤的脑胶质瘤干细胞中也表达,这也是支持神经干细胞是脑胶质瘤干细胞来源的;也有推测认为它可能起源于已分化的细胞,由这些细胞突变发生去分化得来,并通过基因突变而获得了干细胞自我更新的特性,从而形成脑胶质瘤干细胞。通过探讨神经干细胞与脑胶质瘤干细胞,为脑胶质瘤的治疗提供依据。     

脐血间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞的定向诱导*

背景：骨髓间充质干细胞存在取材困难、供体有限、可能病毒污染等缺陷,限制了其临床应用,而目前已证实间充质干细胞不仅存在于骨髓,还存在于外周血,尤其是脐血。 目的：探讨人脐血间充质干细胞的体外分离、扩增纯化方法及其神经分化潜能。 设计、时间及地点：应用研究,体外细胞学观察,于2005-10/2007-10在南方医科大学神经生物学教研室完成。 材料：新鲜脐血来自南方医科大学南方医院足月剖宫产新生儿脐带,取脐血前征得新生儿监护人的知情同意。 方法：无菌条件下收集脐血,去除红细胞,采用低糖DMEM/F12进行培养;取扩增第3或4代的人脐血间充质干细胞,培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和全反式维甲酸。 主要观察指标：用流式细胞仪检测贴壁细胞的表面标志;用免疫组化法检测诱导后细胞神经元特异性烯醇化酶、巢蛋白、神经元特异性核内抗原和神经丝蛋白表达。 结果：人脐血间充质干细胞强表达CD13、CD 29、CD44和CD105,弱表达CD106,不表达CD34、CD11a、CD14、CD33和CD45。培养基添加神经营养因子诱导后的细胞呈现典型的神经元样表型,诱导后高表达巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经元特异性核内抗原和神经丝蛋白。 结论：人脐血富含间充质干细胞,分离培养后于培养基添加神经营养因子能够分化为神经元样细胞。     

不同细胞因子组合体外诱导人脐血干细胞向胰岛样细胞分化

背景：由干细胞分化而来的胰岛样细胞存在数量少、胰岛素分泌量少以及能否达到临床移植要求等问题。 目的：观察不同细胞因子组合对人脐血干细胞体外向胰岛样细胞诱导分化的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2007-05/09在辽宁省血液中心输血医学研究所细胞研究中心完成。 材料：脐血来源于足月分娩的健康产妇,由沈阳市德济医院提供。 方法：密度梯度离心法体外分离人脐血单个核细胞,诱导1组首先以低糖DMEM培养液进行培养,添加20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和20 μg/L表皮生长因子,培养成巢蛋白阳性细胞后改为高糖DMEM培养液,添加2% B27和10 mmol/L尼可酰胺。诱导2组直接以高糖DMEM培养液进行培养,添加20 mmol/L尼可酰胺、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L肝细胞生长因子、2% B27及0.1 mmol/Lβ-巯基乙醇。对照组只添加与诱导组相同的培养液,不加入任何细胞因子。 主要观察指标：诱导分化后对贴壁细胞进行形态学观察、胰岛素抗体的细胞免疫荧光染色及双硫腙染色鉴定。 结果：体外培养的人脐血干细胞通过细胞因子组合诱导后,可见散在的胰岛样细胞或成群的胰岛样细胞群,呈Insulin阳性反应。诱导1组细胞散在或成群分布,诱导2组则多为散在分布的胰岛样细胞,且细胞相对较小,几乎没有胰岛细胞团。双硫腙染色后诱导1组有少部分较大的胰岛样细胞呈阴性,诱导2组细胞均呈棕红色阳性表达,未诱导的对照组细胞呈阴性。 结论：人脐血干细胞通过不同细胞因子组合诱导后具有向胰岛样细胞分化的潜能,但诱导1组中部分细胞可能是非胰岛素细胞,而诱导2组胰岛样细胞均一性较差,可能与胰岛细胞种类较多、大小不一有关。     

骨髓间充质干细胞成骨分化中转化生长因子受体的表达

背景：机体受创后尤其是骨折发生后，骨髓间充质干细胞将启动成骨分化，其表面多种生长因子如碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、骨形态发生蛋白的受体表达将发生变化。 目的：观察骨折损伤后不同时相骨髓间充质干细胞表面转化生长因子受体的表达变化。 设计、时间及地点：对照观察实验，于2002-02/2003-11在解放军第三军医大学预防医学院复合伤研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。 材料：选用健康成年兔，建立成兔桡骨骨折模型。 方法：在造模当日及造模后1，5，10，15，20 d抽取实验兔骨髓液，取骨髓有核细胞，纯化间充质干细胞，成骨分化培养基诱导培养。 主要观察指标：通过Western-blot法检测转化生长因子β1，β2受体在间充质干细胞上的表达。 结果：造模后1 d转化生长因子β1受体表达与造模当日比较无明显差异（P > 0.05）；造模后5 d，其表达显著高于造模当日（P < 0.05）；造模后10 d与5 d比较无明显差异（P > 0.05），但显著高于造模当日（P < 0.05）；造模后15，20 d的转化生长因子β1受体表达显著高于造模当日及造模后5，10 d（P < 0.01）。造模后1，5 d转化生长因子β2受体表达与造模当日无明显差异（P > 0.05）；造模后10，15 d，其表达显著高于造模当日（P < 0.05）；造模后20 d转化生长因子β2受体的表达显著高于造模当日及造模1，5，10，15 d（P < 0.01）。 结论：创伤后体内骨髓间充质干细胞成骨分化过程中转化生长因子β1，β2受体的表达呈现逐渐增高的趋势。     

合成成骨生长肽对人骨髓间充质干细胞成骨转化的促进

背景：成骨生长肽在体内外细胞培养中具有明显的促成骨活性,这种促成骨作用的分子机制还不清楚,现已通过人工方法成功制备了合成成骨生长肽。 目的：探讨合成成骨生长肽对体外培养的人骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的作用。 设计、时间及地点：基因和蛋白水平的细胞学体外观察,于2006-07/2007-12在福建省医学科学研究所基因工程实验室及复旦大学附属中山医院中心实验室完成。 材料：骨髓标本来源于福建省立医院骨一科收治的男性髂骨植骨患者,合成成骨生长肽由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所崔大敷教授惠赠,ERK1/2抑制剂U0126为美国CST公司产品。 方法：密度梯度离心法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,单纯矿化液组加入由10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50 mg/L L-抗坏血酸组成的矿化液;10-7,10-9,10-11 mol/L合成成骨生长肽组分别加入对应浓度的合成成骨生长肽,再加入矿化液;常规培养组加入含体积分数为0.1胎牛血清的低糖DMEM。 主要观察指标：倒置显微镜观察细胞形态变化,RT-PCR法和免疫组织化学染色检测成骨标志物的表达,Western-blot法分析合成成骨生长肽对ERK1/2信号通路的影响,观察U0126对合成成骨生长肽作用的干预。 结果：加入合成成骨生长肽后,骨髓间充质干细胞体积增大,突起增多,呈多角形,胞浆含有较多颗粒状物质,出现致密细胞结节。合成成骨生长肽在mRNA和蛋白水平均能促进成骨标志物碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素的表达,定量分析结果显示10-9 mol/L合成成骨生长肽促成骨作用最强。加入合成成骨生长肽后能够引起ERK1/2信号通路的持续性激活,经U0126预处理后几乎完全阻断了合成成骨生长肽对骨髓间充质干细胞的促成骨作用。 结论：合成成骨生长肽可明显促进人骨髓间充质干细胞向成骨方向的转化,在10-9 mol/L浓度下促成骨能力最强,其促成骨作用可能是通过激活MAPK家族ERK1/2途径实现的。     

星形胶质细胞条件培养液体外诱导胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景：在神经干细胞移植治疗神经系统退行性变及修复神经系统功能损伤过程中,有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的定向诱导分化尤为关键。 目的：以星形胶质细胞条件培养液为诱导剂,观察胎鼠室管膜前下区神经干细胞体外向多巴胺能神经元的分化。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2006-12/2007-08在解放军第三军医大学新桥医院实验中心完成。 材料：清洁级新生2 d龄KM小鼠15只,孕16 d Wistar大鼠40只,均由解放军第三军医大学实验动物中心提供。 方法：采用差速黏附法和振荡分离法纯化培养KM小鼠星形胶质细胞,收集传至第3代、培养5 d的星形胶质细胞条件培养液,-20 ℃冻存待用。体外分离Wistar胎鼠室管膜前下区神经干细胞,加入含B27和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12无血清培养基进行原代培养,传至第3代后按0.5×108 L-1密度接种,设立2组：对照组单纯加入含体积分数0.1为胎牛血清的DMEM/F12培养基予以自然分化,实验组加入已制备的星形胶质细胞条件培养液进行诱导分化。 主要观察指标：免疫细胞化学染色鉴定胎鼠室管膜前下区神经干细胞,流式细胞仪检测胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元分化的阳性率。 结果：培养的神经球细胞表达巢蛋白,可分化为神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。诱导分化7 d后,实验组可见酪氨酸羟化酶阳性细胞,胞体呈圆形或椭圆形,酪氨酸羟化酶位于胞质及突起中;对照组酪氨酸羟化酶阳性细胞在数量、细胞成熟形态上均未达到实验组水平。实验组酪氨酸羟化酶阳性细胞分化率明显高于对照组（t=35.296,P < 0.01）。 结论：在体外星形胶质细胞条件培养液可显著促进胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元分化。     

无血清培养大鼠胚胎向神经干细胞的分化

背景：体外培养扩增获取大量、高纯度的神经干细胞是其移植应用的前提,无血清培养主要目的是去除血清中可能诱导神经干细胞分化的生长因子等干扰因素。 目的：在无血清条件下体外分离培养大鼠胚胎神经干细胞,并观察其生物学特性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2005-03/2006-03在河北医科大学第三医院中心实验室完成。 材料：14~16 d龄SD胎鼠2只,由河北医科大学实验动物中心提供。 方法：无菌条件下取胎鼠大脑皮质,剪碎后机械分离法制作单细胞悬液,加入含B27神经营养添加剂的无血清MEM/F12培养基进行培养,1周后传代。 主要观察指标：免疫荧光染色鉴定神经干细胞巢蛋白的表达及传代能力,加入含血清的MEM/F12培养基诱导分化1周后免疫组化检测细胞分化情况。 结果：培养48~72 h细胞聚集悬浮生长,形成典型的神经球,呈神经干细胞特异性抗原巢蛋白阳性表达。传代的神经干细胞置于BrdU培养液中5~7 d形成次代神经球,呈BrdU阳性,表明次代神经球中绝大部分细胞为传代后细胞分裂而来,具有传代能力,传代后加入含血清的培养基后可以分化为微管相关蛋白2阳性细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。 结论：利用无血清培养技术可成功从胎鼠脑皮质中分离培养出具有分裂增殖能力及多向分化潜能的神经干细胞。     

干细胞在皮肤组织工程中的应用

目前还没有一种理想的组织工程皮肤能满足临床严重皮肤缺损患者的需求,其重要原因之一是无合适的种子细胞来源。干细胞在皮肤组织工程中的应用已取得了很大进展,但仍存在一些问题需要解决。基于此,文章重点介绍了胚胎干细胞、表皮干细胞和间充质干细胞等有代表性的干细胞的分离、培养以及在皮肤组织工程中的应用现状,并提出了存在的问题和下一步的研究方向,以期研制出更理想的组织工程皮肤替代物。