应用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌

目的 探讨应用多重PCR技术快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的可靠性.方法 根据结核分枝杆菌种的MTP40基因序列(396bp),分枝杆菌属的32kD基因序列(506bp),结核分枝杆菌复合体群的IS6110序列(984bp),采用3对特异性引物(PT1,T2;MT1,T2;IS5,S6)在同一反应体系和条件下对92株结核杆菌临床分离株和5株非结核分枝杆菌临床分离株进行扩增,并与标准菌株进行比较.结果 92株结核分枝杆菌临床分离株中,0株扩增出与结核分枝杆菌H37RV标准株相同的396bp、506bp、984bp 3条DNA片段,敏感性达97.8%,特异性为100%;5株非结核分枝杆菌临床分离株均扩增出506bp DNA片段,敏感性达100%,特异性为100%.结论 应用多重PCR方法,对结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌进行鉴定,结果快速、准确、可靠,为临床结核病与非结核分枝杆菌病的快速诊断提供了有效的手段,具有很好的临床应用价值.     

两种培养基对结核分枝杆菌分离鉴定的比较

与世界总体水平相比 ,目前我国的结核病发病率仍然较高。为了选择检测效果好、成本低的培养基对结核分枝杆菌进行分离与鉴定 ,我们采用匡铁吉[1] 琼脂培养基与Ｌ ｗｅｎｓｔｅｉｎ[2 ] 培养基对痰标本中的结核分枝杆菌进行分离、鉴定 ,结果显示匡铁吉琼脂培养基临床效果较优。1　材料和方法1 1　痰标本与前处理　从我院住院肺结核患者中留取 12 7份痰标本 ,每份大约 10ｍｌ,收集在一个10 0ｍｌ的干净厂口玻璃瓶内。按痰标本量的 2 5倍体积加入 2 %氢氧化钠 (ＮａＯＨ)溶液 ,用玻璃棒反复搅拌 ,以使浓痰液化均匀 ;作用 2 0ｍｉｎ后即可用于…     

结核分枝杆菌耐药机制研究进展

结核病是严重危害人民身体健康的传染性疾病。耐药结核杆菌尤其是耐多药结核杆菌（MDR—TB）的出现和传播是导致结核病发病率升高的重要原因。结核杆菌无法通过质粒的介导从其他细菌获得耐药性，因此染色体介导的耐药是结核杆菌产生耐药的分子基础。目前对结核杆菌耐药机制的研究主要集中在药物作用靶位及相关基因的突变上。     

结核分枝杆菌潜伏感染现状及防控对策

结核潜伏感染(LTBI)是结核病发病的蓄水池,也是持续不断的新发患者的来源。5%～10%的LTBI者一生中会发展为活动性结核病,在LTBI高危人群中发病风险更高。LTBI是结核病疫情难以控制的主要原因之一。2018年,第一次联合国大会结核病高级别会议呼吁重点关注LTBI的管理,控制和减少LTBI者由于重新激活而导致结核病的发病。本文就LTBI的疾病负担、流行现状、发病风险、患者管理及防治策略等进行系统论述,为制定我国LTBI的防治策略提供参考。     

结核分枝杆菌耐药基因快速检测研究进展

耐药结核是重大的公共卫生问题并且成为控制结核病的一大障碍［1］。2015年10月28日,WHO 2015年全球结核病报告［2］中指出,2014年全球新发的结核病病例约960万,其中新发耐多药结核（multidrug-resisi-tant tuberculosis MDR-TB）病例48万,新发的MDR-TB中不到13万病例得到检测和报告,而开始接受MDR-TB治疗的病例约为11万。中国每年耐多药结核病患者达到近10万人,其中初治患者耐多药结核为5.7%,复治患者高达25.6%［3］。在很多地区,因为传统的结核药敏实验受生物安全、培养时间长等因素影响,不能常规进行耐药结核检测,甚至最基本的结核菌培养都不能开展,这表明大多数的耐多药结核病例仍然不能确诊,导致临床上的治疗无针对性。目前,具有生物安全要求级别低、检测时间短、敏感性较高等特点的耐药结核分子生物学诊断方法日益受到重视,现就结核分枝杆菌的基因快速检测研究进展综述如下。     

链霉素对结核分枝杆菌sRNA表达影响的研究

目的：研究链霉素对结核分枝杆菌非编码sRNA表达量的影响,探讨sRNA是否参与细菌与药物的相互作用。方法基于结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的高通量测序结果,选出表达量估计值较高的4个sRNA作为研究对象,根据链霉素的最小抑菌浓度（MIC）对标准菌株H37Rv进行不同浓度和不同时间的链霉素诱导,提取各组菌液的总RNA,通过实时定量逆转录聚合酶链反应（ qRT－PCR）检测4种sRNA在各组中的表达量,比较不同抑菌浓度和不同时间的链霉素作用下sRNA的表达量差异。结果当链霉素浓度在1／2MIC时对结核分枝杆菌的生长产生明显抑制作用;在4种sRNA中,MTS2823表达量最高,F6表达量相对较低;MTS1338在4MIC浓度的链霉素处理18 h即出现表达上调;在4MIC浓度链霉素作用6 d后,MTS1338和mcr11表达量分别出现（4．80±1．14）倍和（2．91±0．86）倍上调,而MTS2823表达下调。在各组药物处理组中F6表达量的变化均不明显。结论链霉素对结核分枝杆菌sRNA的表达可产生促进或抑制作用,提示sRNA可对某些基因进行转录后调控,促进或拮抗链霉素对结核分枝杆菌的作用。     

结核分枝杆菌异烟肼依赖性的初步调查

目的 调查临床结核菌分离株对异烟肼的依赖状况.方法 采用匡氏琼脂培养基分离痰结核菌并进行结核菌药敏试验,采用匡氏双向琼脂培养基检测结核菌药物依赖性.结果 184例临床分离结核菌株异烟肼依赖包括4种类型.A型:含药管结核菌的生长较对照管明显粗大旺盛,且高浓度管菌落生长优于低浓度管者占6.52%(12/184);B型:含药管结核菌的生长较对照管明显粗大旺盛,且低浓度管菌落生长优于高浓度管者占5.43%(10/184);C型:低浓度管结核菌的生长较对照管明显粗大旺盛,而高浓度管菌落生长劣于对照管者占8.15%(15/184);D型:高浓度管结核菌的生长较对照管明显粗大旺盛,而低浓度管菌落生长劣于对照管者占2.17%(4/184).统计结果显示具有异烟肼依赖特征的临床分离株占全部菌株的22.28%(41/184).结论 结核菌临床分离株中存在异烟肼依赖株,并显示出不同的依赖特征.     

磷霉素银的制备及其体外抑菌试验

目的：制备磷霉素银并测定其抑菌活性。方法：采用复分散法制备磷霉素银,并经体外抑菌试验比较了磷霉素银与磺胺啶银和磷霉素钙的抗菌活性。结果：磷霉素银的各剂量组抑菌圈均大于磷霉素银磺胺啶银。结论：磷霉素银的抗菌作用强于磷霉素钙和磺胺嘧啶银。     

新的氟哌酸衍生物合成及其体外抑菌实验

合成了5个新的氟哌酸衍生物,其中2个肉桂酸偶氮化合物(1、m—NFCA;2、P—NFCA),1个苯磺酸偶氮化合物(3、NFSA)及2个葡萄糖甙化合物(4、NFTAG;5、NFG)。体外抑菌实验表明,所合成的5个化合物对大肠杆菌、金葡球菌、绿脓杆菌均具有显著的抑菌作用,其中NFTAG对大肠杆菌,m—NFCA,P—NFCA,NFSA对金葡球菌的MIC及NFSA对绿脓杆菌的MIC均小于氟哌酸。     

非结核分枝杆菌肺病的 MSCT 表现及诊断

目的：探讨非结核分枝杆菌（NTM）肺病的CT表现特点。方法回顾性分析在本院经MSCT扫描,并经双相培养基菌群鉴定明确诊断为NTM肺病的患者42例（NTM肺病组）,与随机抽取的同期结核菌培养阳性并经菌群鉴定为肺结核的初治患者60例（肺结核组）的资料进行对照,并对9种C T征象检出及病灶分布特点进行分析、总结。对结果进行统计学分析,P＜0．05为差异有统计学意义。结果 NTM肺病组女性多见（χ2＝5．500,P＝0．019）,平均年龄高于肺结核组,差异有统计学意义（ t＝3．456, P＝0．001）。NTM肺病组在中叶、舌段检出率明显高于肺结核组（χ2＝8．361,P＝0．004）。 Logistic回归分析结果显示支气管扩张和支气管狭窄或闭塞是NTM肺病的独立危险因素,是与肺结核区分的重要征象。结论 NTM 肺病CT表现有一定的特点,对临床诊断有提示作用。     

目前结核分枝杆菌感染中重要免疫细胞和细胞因子作用的研究进展

清楚认识结核分枝杆菌感染引起的免疫反应机制十分重要,因此近年来有关这方面的研究较多。本文主要对参与结核分枝杆菌感染自然免疫的巨噬细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞;获得性免疫反应的T淋巴细胞(CD4,CD8);以及-γ干扰素、白介素4,12,10,12,肿瘤坏死因子等细胞因子进行了介绍。     

结核分枝杆菌特异PE/PPE蛋白家族研究进展

结核分枝杆菌（Mycobacterium. tuberculosis,MTB）是结核病的病原菌。富含甘氨酸的独特蛋白质家族——PE/PPE蛋白家族编码基因约占整个MTB菌基因组的10%,该蛋白家族可能是细菌毒力和抗原变异的主要来源,对其结构和生物学功能的研究将对结核感染的血清学诊断和结核菌苗的开发具有重要意义。     

重组结核分枝杆菌多表位肽的免疫原性研究

目的探讨纯化的重组结核分枝杆菌多表位肽激发细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Tlymphocyte,CTL)免疫应答的能力,为新型结核疫苗的设计打下基础。方法通过细胞增殖和细胞毒性实验,研究纯化的重组表达多表位肽刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生的增殖反应和细胞毒活性,初步鉴定重组多表位肽的免疫原性。结果以刺激系数(SI)>3为界,多表位肽(10μmol)能刺激全部10例HLA-A*0201阳性(A2+)结核菌素阳性(PPD+)健康个体的PBMC发生增殖,SI为46.2±5.6;增殖反应明显高于单肽(平均SI为10.2±2.3)以及PPD(平均SI为15.6±3.6)引起的细胞增殖反应(P<0.01)。在多表位肽诱导的CTL细胞毒活性分析中以负载抗原肽(10μmol)的T2细胞作为靶细胞,多表位肽诱导的CTL作为效应细胞,多表位肽能诱导全部的10例A2+PPD+健康个体中CTL杀伤活性,平均活性分别为(86.2±9.6%),显著高于单肽[平均为(25.4±3.6)%]和PPD[平均为(22.6±2.8)%](P<0.01)。结论重组优化多表位肽在细胞水平具有较好的免疫原性,能有效刺激PBMC产生细胞增殖反应和细胞毒活性。     

2017-2021年菏泽地区非结核分枝杆菌菌种分布及耐药性观察

目的 观察2017～2021年菏泽地区非结核分枝杆菌(NTM)菌种分布及耐药性情况。方法 选取2017年1月～2021年12月菏泽地区传染病医院分离出的NTM菌株72株,采取荧光PCR熔解曲线技术进行菌种鉴定,利用微量液体培养基最低抑菌浓度法展开药敏试验。结果 菏泽地区2018年非结核分杆菌的感染率与2017、2016年相比虽有所增高,P>0.05;胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分枝杆菌占比前三位,分别为64.13%、18.48%、5.43%;72例非结核分枝杆菌对常用抗菌药物药敏试验结果显示,NTM对异烟肼耐药率高达100%,脓肿分枝杆菌对8种常用抗菌药物耐药性高达80%以上,其次为龟分枝杆菌耐药性较高。结论 2018年后菏泽地区非结核分枝杆菌菌种分布以上升趋势为主,最为常见菌种为胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌,不同NTM菌种在常见7种抗菌药物耐药率上存在差异,而对于常规抗结核药物整体耐药性高。     

匡氏琼脂PNB培养基用于分枝杆菌直接鉴定效果调查

 目的 调查匡氏琼脂PNB培养基用于痰分枝杆菌直接鉴定的效果.方法 采用匡氏琼脂PNB培养基直接鉴定痰标本中的结核菌和非结核分枝杆菌;并采用琼脂PNB培养基和多重PCR技术对分离物重鉴定.结果 281例痰标本,110例培养阳性,经匡氏PNB培养基直接鉴定,非结核分枝杆菌感染3例(3/110,2.7%),结核菌和非结核分枝杆菌混合感染7例(7/110,6.4%),结核菌感染100例(100/110,90.9%).匡氏琼脂PNB培养基痰菌直接鉴定法对结核菌和非结核菌感染病例的灵敏度和特异性达100%.结论 匡氏琼脂PNB培养基痰菌直接鉴定法,能快速准确鉴定非结核菌感染和混合感染,操作简易,适合推广应用.     

检测耐利福平结核分枝杆菌寡核苷酸芯片的研制及应用

目的：探讨用寡核苷酸芯片检测结核分枝杆菌耐利福平株的rpoB基因突变的可行性。方法：制备了检测耐利福平结核分枝杆菌寡核苷酸芯片，并且通过优化引物比例和杂交温度以获得最佳结果。应用该寡核苷酸芯片检测6例结核分枝杆菌的rpoB基因突变，并与测序结果比较。结果：不同引物比例PCR产物经热变性后杂交，杂交结果无明显差异。杂交温度可以影响杂交结果的特异性和杂交信号的强度。引物比例1：1，杂交温度50℃为最佳条件。6例标本的芯片检测结果显示其中有1例野生型标本，5例突变标本：516位GAC→AAC，GTC，TAC，GAG，531位TCG→TTG。其结果与测序结果完全相符。结论：寡核苷酸芯片可以推广应用到临床作为耐药结核病快速诊断的一种有效方法。     

广东口岸结核分枝杆菌生物样本库的建设

目的 利用实验室资源优势,建立菌种来源丰富、信息完整、保存妥善、管理规范的结核分枝杆菌菌种库,为结核病研究提供基础。方法 收集广东口岸检出的出入境结核病患者流行病学资料、结核分枝杆菌分离株、菌种DNA及菌种生物学信息资源,通过样本管理软件对菌种及信息进行科学管理,定期对菌种保存质量进行抽检。结果 初步建立了广东口岸结核分枝杆菌菌种生物样本库,库存结核分枝杆菌菌种863株,DNA 863份,定期抽检菌种保存质量良好。结论 菌株有效保存是菌种库建立的基础,菌种信息资源的完整收集是菌种库使用的前提,科学有效的管理是菌种库运行的保障。     

结核分枝杆菌脂多糖抗原的提取及血清学诊断价值研究

 目的 建立结核分枝杆菌脂多糖的提取方法,评价其在结核病血清学诊断巾的价值,寻找更有效的结核病诊断试剂.方法 将火活的结核分枝杆菌经超声破碎,热酚法去除蛋白,乙醇沉淀去除DNA、RNA,透析得到结核分枝杆菌多糖.将其作为抗原,通过酶联免疫吸附试验( ELISA)方法 检测470例血清中抗结核抗体.结果 结核分枝杆菌脂多糖用于血清标本检测,敏感性为49.5％;特异性为93.5％,其巾健康对照组阳性率为5.2％,非结核对照组阳性率为10.3％.结论 结核分枝杆菌脂多糖抗原可作为结核病血清学诊断的组合抗原之一,提高阳性标本检出的阳性率和特异性.     

结核分枝杆菌Rv2389c基因的克隆和原核表达

目的:克隆并原核表达结核分枝杆菌Rv2389c基因。方法:培养结核分枝杆菌,提取其基因组,PCR扩增出485bp的Rv2389c基因,克隆入pSP73载体,测序分析。将该目的基因亚克隆入pGEX-4T-2表达载体,测序证实正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),待大肠杆菌增菌至A600nm值为0.6时,用0.3 mmol/L IPTG在30℃诱导表达重组蛋白。结果:测序结果证实获得了Rv2389c基因,其序列与GenBank中报道完全一致。构建了重组表达质粒,表达的蛋白以12%SDS-PAGE分析,在Mr约42KD处出现一条新生蛋白带,经凝胶薄层扫描检测,表达量约占菌体蛋白的26.8%。结论:成功克隆了结核分枝杆菌Rv2389c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究其活性和功能奠定了基础。