抗纤复方Ⅰ号对乙醛刺激的肝星状细胞增殖、胶原合成的干预

观察了中药抗纤复方I号(KX I)对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞(HSC)增殖、胶原合成的影响,以期阐述KX I抗酒精性肝纤维化的部分作用机制。 一、材料与方法 1.药物与药物血清的制备:KXI(主要由丹参、黄芪、红花等十味药物组成)浓缩口服制剂,每ml含生药2.7 g。按11 ml/kg给Wistar大鼠灌服中药制剂,每天1次,持续给药1     

抗纤二号药物血清对活化型肝星状细胞的影响

为了解抗纤二号的抗肝纤维化作用机制，采用动物体内给药，分离药物血清，作用于体外培养细胞的血清药理学实验方法，探讨该方对肝星状细胞（HSC）激活的标志平滑肌肌动蛋白（smooth muscle actin，SMA）表达的影响及Ⅰ、Ⅲ型胶原和转化生长因子β1（TGFβ1）及其下游信号Smad 3表达的影响，从细胞分子学水平探讨该方抗肝纤维化的作用机制。     

抗纤复方Ⅰ号对酒精性肝病大鼠肝星状细胞活化的影响

目的观察抗纤复方Ⅰ号对酒精性肝病大鼠肝星状细胞活化的影响,以探讨中药治疗酒精性肝病的机制.方法给予Wistar大鼠乙醇8～10g·kg-1·d-1,分3次灌胃,12周制备酒精性肝病大鼠模型,对照组给予等量生理盐水,中药组在给予同酒精组等量乙醇的基础上,给予抗纤复方Ⅰ号水煎剂4.0ml·kg-1·d-1,分2次灌胃,共12周.实验4、8、12周末分批处死动物,HE及VG染色观察肝脏组织学改变,电镜下观察肝星状细胞形态学改变并检测肝内透明质酸(HA)和层黏连蛋白(LN)含量.结果造模12周时,酒精组大鼠肝脏呈现重度脂肪变性,点片状肝细胞坏死及炎性细胞浸润,纤维条索形成;而中药组大鼠仅呈现轻度脂肪变,无纤维条索形成.电镜下酒精组大鼠肝细胞失去正常结构,星状细胞增多、变形,细胞外可见较多胶原纤维.中药组大鼠肝细胞及星状细胞形态基本正常,基质内亦可见少量胶原纤维.实验8周末酒精组LN浓度开始升高,12周末达到最高,与正常组及中药组比较差异有显著性意义[(37.69±5.01)vs(22.34±3.51)、(28.07±4.11),P＜0.05];肝内HA浓度8周末各组间比较无统计学差异,12周末酒精组明显升高,与正常组及中药组比较,差异有显著性意义[(74.85±9.23)vs(41.26±8.34)、(53.62±4.85),P＜0.01].结论抗纤复方Ⅰ号能降低肝内HA和LN,抑制酒精性肝纤维化形成,这与其抑制肝星状细胞活化有关.     

抗结缔组织生长因子小干扰RNA对肝星状细胞合成分泌细胞外基质的影响

目的 研究化学合成抗结缔组织生长因子(CTGF)小干扰RNA(siRNA)对肝星状细胞(HSC)CTGF基因表达及合成分泌细胞外基质(ECM)的影响。 方法 将化学合成抗CTGF siRNA以Oligofectamine包裹,转染HSC T6细胞,设空白对照,抽提孵育24、48、72 h细胞总RNA及蛋白质,并收集培养上清液,应用western blot和(或)逆转录聚合酶链反直检测HSC T6细胞CTGF及Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达,应用放射免疫法检测培养上清液中透明质酸及Ⅲ型前胶原含量。 结果 与空白对照相比,转染siRNA的HSC T6细胞CTGF及Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达水平显著下调,培养上清液中透明质酸及Ⅲ型前胶原含量24、48、72h分别降低46％±7％,52％±7％,53％±7％(F=157.45,P=0.0001)和29％±18％,29％±7％,27％±5％(F=10.77,P=0.0079)。 结论 化学合成抗CTGF siRNA能高效抑制HSC CTGF基因表达,显著减少HSC Ⅰ、Ⅲ型胶原及透明质酸等ECM的合成与分泌,抑制效应可持续72 h,提示化学合成CTGF siRNA具有预防及治疗肝纤维化的潜力并具有极好的开发前景。     

PAP-M6P与RGDY对肝星状细胞活化功能的联合干预作用

背景：活化的肝星状细胞（HSC）表面6-磷酸甘露糖，胰岛素样生长因子Ⅱ（M6P／IGFⅡ）受体和整合素受体显著增加。外源性含有M6P或精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸（RGD）基团的分子可干预HSC活化，但目前尚缺乏两者比较或联合应用的研究。目的：探讨人工化学合成的p-氨基苯基-6-磷酸-α-D-甘露糖（PAP—M6P）和精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-酪氨酸（RGDY）小肽对HSC活化功能的联合干预作用。方法：取培养10d的活化期HSC，分别设空白对照组、RGDY对照组、PAP-M6P低、中、高浓度组以及低、中、高浓度联合组进行干预。以甲基噻唑基四唑（MTT）法检测细胞抑制率，以逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测转化生长因子（TGF）-β1 mRNA表达，以酶联免疫吸附测定（ELISA）检测Ⅰ型胶原、透明质酸和活化的TGF-β1蛋白含量。结果：各组细胞抑制率无明显差异。中浓度联合组TGF-β1 mRNA表达和中、高浓度联合组活化的TGF-β1蛋白含量显著低于RGDY对照组和相应浓度PAP-M6P组（P〈0．05）；高浓度联合组Ⅰ型胶原、透明质酸含量显著低于RGDY对照组和各浓度PAP-M6P组（P〈0．05）。结论：PAP-M6P与RGDY联合应用能显著抑制HSC表达和激活TGF-β1,并减少细胞外基质沉积。     

银杏叶提取物对大鼠肝星状细胞细胞因子和胶原合成及细胞增殖的影响

目的研究银杏叶提取物抗肝纤维化的可能机理。方法用不同浓度(0,1,10,100,500μg·ml-1)的银杏叶提取物处理HSC-T6细胞24h和48h,采用RT-PCR法检测各组细胞转化生长因子β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA的表达;应用流式细胞仪检测细胞增殖周期的变化。结果银杏叶提取物在10,100,500μg·ml-1浓度能明显抑制TGF-β1、CTGF、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA的表达(P<0.01或P<0.05),在一定范围内呈剂量和时间依赖性,影响HSC-T6的细胞周期,降低其增殖活性。结论银杏叶提取物可明显抑制HSC-T6细胞的增殖,抑制细胞因子及细胞外基质成分基因的表达,由此发挥抗肝纤维化的作用。     

重组转化生长因子β3基因对大鼠肝星状细胞Ⅰ型胶原表达的影响

目的观察转化生长因子D3基因（TGFβ3）对大鼠肝星状细胞株（HSC—T6）Ⅰ型胶原合成的影响。方法TGFβ3表达质粒[pcDNA3．1（＋）-TGFβ31和TGFβ1表达质粒[pcDNA3．1（＋）-TGFD11的构建。通过脂质体介导方法，将pcDNA3．1（＋）-TGFβ1、pcDNA3．1（＋）-TGFβ3分别及共同转染体外培养的HSC—T6细胞，荧光定量PCR法及Westernblot法分别检测转染后TGFβ1、TGFD3、Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达。将pcDNA3．1（＋）-TGFD1转染HSC—T6细胞，经G418筛选建立高表达TGFD1的HSC～T6细胞克隆，pcDNA3．1（＋）-TGFD3转染克隆细胞，荧光定量PCR法检测转染后TGFβ3、TGFβ1及Ⅰ型胶原mRNA的表达，Westernblot法检测TGFβ1、Ⅰ型胶原蛋白的表达情况。结果构建的pcDNA3．1（＋）TGFD3、pcDNA3．1（＋）-TGFD1质粒可转染HSC—T6细胞，转染率28．2％。pcDNA3．1（＋）TGF侈3转染细胞后，Ⅰ型胶原mRNA及蛋白的表达较空白组及对照组增加，以72h增高最为明显（P〈0．05）；共转染组Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达较pcDNA3．1（＋）-TGFβ1转染组明显降低（P〈0．05）。TGF侈3转染克隆细胞后，TGFD1mRNA表达较克隆组无明显改变（P〉0．05），而蛋白质表达明显下降（P〈0．05），Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质表达均较克隆组明显降低（P〈0．05）。结论TGFD3基因转染正常培养的HSC—T6细胞，增加Ⅰ型胶原的表达；转染高表达TGFβ1的克隆组HSC—T6细胞，Ⅰ型胶原表达明显降低，提示TGFβ3对肝纤维化的发生有抑制作用。     

瘦素对乙醛诱导肝星状细胞活化过程中Ⅰ型胶原及α-平滑肌肌动蛋白表达的影响

目的:观察瘦素对乙醛诱导肝星状细胞(HSC)活化过程中α-SMA和I型胶原表达的影响,旨在从体外探讨瘦素在酒精性肝病中的可能作用。方法:采用SD大鼠肝脏原位灌流消化的方法获得并原代及传代培养HSC,分乙醛(200μmol/L)处理组,瘦素(100nmol/L)处理组及联合处理组(乙醛200μmol/L加瘦素100nmol/L)。用实时荧光定量PCR方法检测各组细胞TGF-β1、Ⅰ型胶原及α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)mRNA表达水平,Western blot检测各组细胞α-SMA表达量,ELISA法检测培养上清中TGF-β1及Ⅰ型胶原含量。结果:①乙醛处理组中TGF-β1和Ⅰ型胶原基因及蛋白表达量明显高于空白对照组(P<0.05),α-SMA表达量与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05);②瘦素处理组TGF-β1、Ⅰ型胶原及α-SMA表达量与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05);③联合处理组TGF-β1、Ⅰ型胶原及α-SMA表达量明显高于对照组(P<0.05),但TGF-β1、Ⅰ型胶原表达量与乙醛处理组相比差异无显著性意义(P>0.05)。结论:在乙醛诱导肝星状细胞活化过程中,瘦素能协同上调α-SMA的表达;但对TGF-β1及Ⅰ型胶原的表达无影响,Ⅰ型胶原和α-SMA的表达可能是依赖于不同的调控机制来实现。     

内毒素刺激Kupffer细胞对肝星状细胞前胶原基因表达的影响

背景：肠源性内毒素血症对肝纤维化具有启动作用,肝星状细胞（HSC）活化是肝纤维化发生、发展的中心环节。目的：探讨内毒素刺激Kupffer细胞对HSC前胶原基因表达的影响及其可能机制。方法：改良链酶蛋白酶、胶原酶原位灌流和密度梯度离心分离大鼠肝脏Kupffer细胞和HSC。以RNA斑点杂交检测脂多糖（LPS）、Kupffer细胞、LPS与Kupffer细胞共培养和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对HSC前胶原mRNA表达的影响,放射免疫法检测LPS对Kupffer细胞和HSC产生TNF-α的影响,RNA印迹法检测LPS和TNF-α对Kupffer细胞和HSC转化生长因子-β（TGF-β）mRNA表达的影响结果：经低浓度（0.5、1、5μg/ml）LPS处理的Kupffer细胞培养上清可增加HSCⅠ、Ⅲ、Ⅳ型前胶原mRNA表达,经高浓度（10、15、20μg/ml）LPS处理的Kupffer细胞培养上清、单独LPS、未经处理的Kupffer细胞培养上清、单独TN-α均无此作用。Kupffer细胞培养上清中的TNF-α含量随LPS浓度梯度的增加而递增,HSC培养上清中的TNF-α含量则无明显变化。TNF-α不能增加HSC TGF-βmRNA表达,但能增加Kupffer细胞TGF-βmRNA表达;经LPS或TNF-α处理的Kupffer细胞培养上清能增加HSC TGF-βmRNA表达。结论：低浓度内毒素能上调HSC前胶原基因表达,该作用有赖于内毒素激活Kupffer细胞所产生的活性介质的参与。     

Somatostatin inhibits pro-inflammatory cytokine secretion from rat hepatic stellate cells.

BACKGROUND/AIMS: Activated hepatic stellate cells (HSCs) have been implicated in hepatic fibrosis. Somatostatin (SOM) has an immunomodulatory role. The aim of this study was to assess the secretion of pro-inflammatory cytokines by HSCs and to determine the effect of SOM on the secretion of these mediators. METHODS: Activated rat HSCs were evaluated for their secretion of IL-1beta, IL-8, and TNF-alpha using ELISA. RNA protection assay was used to determine cytokine mRNA levels. The expression of chemokine and cytokine mRNA and the secretion of these mediators were assessed following incubation with SOM or octreotide. RESULTS: HSCs spontaneously secreted IL-1beta, IL-8, and TNF-alpha. This secretion was augmented following stimulation by IL-1beta and TNF-alpha. SOM inhibited the spontaneous and TNF-alpha-induced secretion of IL-1beta, IL-8, and TNF-alpha and suppressed the expression of IL-1beta and TNF-alpha mRNA. Octreotide suppressed the secretion of IL-1beta and IL-8. CONCLUSIONS: These observations indicate that SOM exerts an inhibitory immunomodulatory effect on HSCs.     

Regulation of matrix metallo-proteinase expression by extracellular matrix components in cultured hepatic stellate cells

Hepatic stellate cells (HSC) changed their morphology and function including production of matrix metalloproteinases (MMPs) in response to extracellular matrix (ECM) component used as a substratum in culture. We examined in this study the regulatory role of ECM component on expression of MMPs and tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP) in rat HSCs cultured on polystyrene, type I collagen-coated surface, type I collagen gel, or Matrigel, respectively. When cultured on type I collagen gel, HSCs showed the asteroid cell shape and MMP-1 activity, as detected by in situ zymography. Expression of MMP-1 protein and mRNA were examined by using immunofluorescence staining and RT-PCR analysis in HSCs cultured on type I collagen gel. Active form of MMP-2 was detected by gelatin zymography in the conditioned medium of HSCs cultured on type I collagen gel, whereas it was not detected when HSCs were cultured on polystyrene, type I collagen-coated surface, or Matrigel. Increased MMP-2 mRNA was detected by RT-PCR in HSCs cultured on type I collagen gel. Increased MT1-MMP proteins were shown to localize on the cell membrane by using immunofluorescence staining in HSCs cultured on type I collagen gel. Elevated expression of membrane-type matrix metallproteinase-1 (MT1-MMP) mRNA and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2) mRNA was detected by RT-PCR in HSCs cultured on type I collagen-coated surface or type I collagen gel. These results indicate that expression of MMPs and TIMP-2 is regulated by ECM components in cultured HSCs, suggesting an important role of HSCs in the remodeling of liver tissue.     

姜黄素对氧化应激中肝星状细胞活化及细胞外基质分泌的影响

目的观察姜黄素对氧化应激中大鼠肝星状细胞系HSC-T6活化及细胞外基质分泌的影响。方法将HSC-T6分成对照组、模型组、干预组。对照组正常培养,模型组加入100 mU/mL葡萄糖氧化酶（glucose oxidase,GO）干预2 h,制备细胞氧化应激模型,干预组分别加入15μmol/L和30μmol/L姜黄素分别干预3 h,然后给予100 mU/mL GO干预2 h。免疫荧光法观察HSC-T6中desmin和α-SMA的表达,分光光度法检测细胞丙二醛（malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）水平,放射免疫法检测细胞内透明质酸（hyaluronic acid,HA）,层粘连蛋白（laminin,LN）,Ⅲ型前胶原（procollagenⅢ,PCⅢ）,Ⅳ型胶原（collagenⅣ,CⅣ）水平的变化。结果模型组MDA较对照组显著升高（P〈0.01）,姜黄素15μmol/L干预组MDA较模型组有所降低（P〈0.05）,姜黄素30μmol/L干预组MDA较模型组明显降低（P〈0.01）;模型组GSH较对照组显著升高（P〈0.01）,姜黄素干预组GSH均较模型组显著升高（P〈0.01）,姜黄素30μmol/L的作用优于15μmol/L;对照组中α-SMA无明显表达,模型组中α-SMA大量表达,干预组中α-SMA的表达明显减少,其中姜黄素30μmol/L的作用优于15μmol/L;模型组HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平较对照组显著升高（P〈0.01）,姜黄素15μmol/L干预组细胞内HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平较模型组有所降低（P〈0.05）,姜黄素30μmol/L干预组HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平较模型组明显降低（P〈0.01）。结论姜黄素在低浓度内能够呈浓度依赖性地降低星状细胞内氧化应激水平,抑制星状细胞活化进而减轻细胞纤维化。     

抑制细胞因子RhoA的表达对肝星状细胞株HSC-T6胶原分泌的影响

目的:观察并比较两种方法抑制RhoA的表达对细胞外基质成分,如Ⅰ型胶原、透明质酸以及层粘连蛋白合成的影响,为肝纤维化的基因治疗寻求新的途径.方法:设计并合成针对RhoA相同靶点的反义寡核苷酸和小干扰RNA.分别转染肝星状细胞株HSC-T6,逆转录PCR技术检测细胞中RhoA和Ⅰ型胶原mRNA的表达:Western blot检测细胞中RhoA蛋白质的表达;ELISA检测培养上清中透明质酸(HA)、层黏蛋白(LN)及PIIIP的含量.结果:转染RhoA反义寡核苷酸和小干扰RNA Ratl质粒后.HSC-T6中RhoA mRNA的表达分别由0.892±0.051、0.937±0.044降为0.113±0.024、0.212±0.042;蛋白质表达水平均明显下调;细胞内Ⅰ型胶原mRNA的表达分别由0.709±0.067、0.695±0.087降为0.436±0.037、0.201±0.044;细胞外基质成分如HA、LN及PIIIP的表达水平明显下降.两者相比,小干扰RNA具有更强的生物学效应.结论:靶向抑制细胞因子RhoA的表达可明显减少肝星状细胞株HSC-T6细胞外基质的合成,且小干扰RNA的效果明显优于针对同一靶点的反义寡核苷酸,显示RNAi技术应用于肝纤维化基因治疗的良好前景.     

洛伐他丁对肝星状细胞增殖及细胞外基质分泌的影响

目的 观察洛伐他丁对肝星状细胞增殖及细胞外基质分泌的影响,并探讨其作用机制。方法 用不同浓度的洛伐他丁和胆固醇合成过程中产生的非脂性中间产物香叶基香叶基焦磷酸处理大鼠肝星状细胞株;用MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,ELISA检测细胞外基质IV型胶原和层粘连蛋白,免疫细胞化学结合计算机图文分析系统检测c—jun、c-fos基因表达。结果 洛伐他丁可剂量依赖性地抑制肝星状细胞增殖（对照组A值24 h和48 h分别为0.736±0.090和0.972±0.097,洛伐他丁浓度在10μmol/L时24h和48h分别为0.602±0.049和0.785±0.028,两组比较差异有显著性）,影响其细胞周期,使G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,并明显抑制c-jun、c—fos表达（洛伐他丁浓度在 50μmol/L时分别较对照组降低51.5％和 54.5％）,抑制IV型胶原和层粘连蛋白分泌（P<0.01）。而香叶基香叶基焦磷酸可部分拮抗洛伐他丁的上述抑制作用。结论 洛伐他丁可显著抑制肝星状细胞增殖及细胞外基质分泌,其机制可能与抑制香叶基香叶基焦磷酸产生而阻止信号转导有关。     

姜黄素对肝星状细胞增殖及分泌细胞外基质的影响

观察姜黄素对大鼠肝星状细胞 (HSC)增殖及分泌细胞外基质的影响。用不同浓度的姜黄素处理大鼠肝星状细胞 ;以MTT比色法测定细胞的增殖 ;放射免疫法测定透明质酸和层粘连蛋白 ;酶联免疫吸附法 (ELISA)测定Ⅰ型胶原的水平。姜黄素可剂量依赖性地抑制HSC增殖 ,不同程度抑制Ⅰ型胶原、透明质酸和层粘连蛋白分泌。姜黄素可显著抑制HSC的增殖及分泌细胞外基质。     

维生素E对大鼠肝星状细胞增殖及细胞外基质的影响

目的 观察维生素E（VE）对大鼠肝星状细胞（HSC）过氧化脂质和细胞外基质（ECM）产生的影响。方法 采用原位灌注方法分离大鼠HSC。结果 新分离的大鼠HC培养1w时具有增殖和ECM分泌的活性。VE可有效抑制大鼠HSC^3H-胸腺嗜啶（^3H-TdR）、^3H-脯氨酸（^3H-Pro）的掺入和Ⅲ型前胶原（PCⅢ）及透明质酸（HA）的分泌，VE作用后HSC产生丙二醛（MDA）下降，与分泌PCⅢ的抑制呈正相关。结论 VE可抑制大鼠HSC增殖和减少ECM的分泌。     

黄芩甙抗肝星状细胞增殖及胶原合成的作用

目的研究黄芩甙对大鼠肝星状细胞活化、增殖及细胞外基质合成的作用,探讨黄芩甙抗肝纤维化的机制。方法采用胶原酶循环灌流法和密度梯度离心法分离肝星状细胞。不同浓度黄芩甙作用后,通过观察细胞贴壁及细胞形态变化情况来检测细胞活化：采用MTT法检测细胞增殖;免疫细胞化学法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原及层粘连蛋白的合成。结果黄芩甙（75～1200μg/mL）可抑制HSC活化,MTT法示75μg／mL、150μg／mL、300μmL、600μg／mL、1200μg／mL黄芩甙作用于HSC的A值分别为（0．060±6．53）×10^-2、（0．052±7．38）×10^9、（0．036±1．26）×10^-3、（0．023±1．72）×10^-3、（0．013±4．01）×10^-3,空白对照组A值为（0．065±1．32）×10^4,F值=1147．611,P〈0．05。黄芩甙可抑制活化的HSC增殖,减少HSCⅠ、Ⅲ型胶原及层粘连蛋白合成。结论黄芩甙抗肝纤维化作用主要机制可能为黄芩甙抑制肝星状细胞活化、增殖,抑制细胞胶原蛋白及糖蛋“等细胞外基质合成.     

龙血素B对肝星状细胞增殖及细胞外基质分泌的影响

目的观察龙血素B对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖及细胞外基质分泌的影响。方法用不同浓度的龙血素B处理大鼠HSC;MTT法计算药物的抑制率;放射免疫法测定细胞上清中透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)和Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)。结果随药物浓度的升高,龙血素B对HSC-T6增殖的抑制作用逐渐增强,有明显的量效关系。细胞上清中HA、LN和Ⅳ-C的含量与对照组相比降低,其中龙血素B浓度为0.300μg/μL时降低最明显。结论龙血素B可抑制HSC-T6增殖,并不同程度抑制HA、LN和Ⅳ-C的分泌。