5-氟尿嘧啶对HepG2肝癌细胞系中膜联蛋白和血管内皮生长因子表达的影响

膜联蛋白-A2(ANX A2)是膜联蛋白家族中重要成员,在诸多肿瘤的侵袭转移机制中发挥重要作用[1,3];血管内皮生长因子(VEGF)是体内最强的一种血管生成因子,直接参与诱导肿瘤血管生成.本文通过对5-氟尿嘧啶(5-FU)干预下ANX-A2、VEGF在HepG2肝癌细胞系表达的研究,探讨两者在肝细胞性肝癌中表达的相关性及意义.     

SEPT9基因在人肝细胞癌侵袭转移中的作用

目的研究SEPT9基因对人肝癌细胞侵袭转移的影响。方法通过westernblot法筛选SEPT9蛋白高表达肝癌细胞系,慢病毒转染沉默后检测细胞SEPT9蛋白表达量,通过EdU染色检测sh-SEPT9对肝癌细胞增殖的影响;Transwell和划痕实验检测沉默SEPT9表达后肝癌细胞的侵袭能力和迁移能力;westernblot分析沉默SEPT9表达对肝癌细胞HIF-1α、Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF、Vimentin, N-cadherin、E-cadherin蛋白表达影响。结果 westernblot显示SEPT9蛋白在肝癌HepG2细胞存在高表达,慢病毒转然能够获得稳定遗传的HepG2-SEPT9-shRNA细胞系,sh-SEPT9转然后,EdU染色显示HepG2细胞增殖受到明显抑制(P0.05),细胞的侵袭能力和迁移能力显著降低(P0.05);HepG2细胞Ki67、PCNA、Vimentin、N-cadherin、HIF-1α、MMP-9及VEGF表达量明显降低,E-cadherin的蛋白水平明显上升(P0.05)。结论 SEPT9基因通过增强肝癌HepG2细胞的EMT机制,促进肝癌HepG2细胞的侵袭转移。     

p38MAPK信号传导通路调控VEGF诱导肝癌细胞黏附作用

目的:观察血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通过p38信号传导通路诱导肝癌HepG2细胞转移及其对黏附作用的影响．方法:以p38MAPK信号通路特异性阻断剂SB203580预处理肝癌HepG2细胞,采用 3H-TdR掺入及鼠尾胶黏附实验测定不同浓度 VEGF对肝癌HepG2细胞同质性和异质性黏附作用,流式细胞术检测VEGF诱导肝癌细胞 CD44v6表达．结果:1 μg／L和5 μg／L VEGF诱导HepG2细胞60 min 3H-TdR掺入实验结果(dpm／min)分别为1 758．67±289．46、1 380．03±328．55; 90 min分别为3 124．30±2 262．14、2 245．60 ±273．24;10 μg／L VEGF诱导HepG2细胞60, 90,120 min 3H-TdR掺入实验分别为1 232．32 ±201．04、2 337．50±333．04、2 236.99± 237．07,显著低于对照组的2 184．49±336．03、 3 560．00±255．17、4 337．40±377．35(P<0．05 或0．01);经SB203580预处理的HepG2细胞,60, 90,120 min后的结果为2 634．23±375．21、 3 834．82±535．79、4 398．40±564．76,VEGF 诱导肝癌细胞同质性黏附作用降低．5 μg／L和 10 μg／L VEGF诱导HepG2细胞60 min鼠尾胶黏附实验吸光度A值为0．263±0．021、0．238 ±0．034,1,5和10 μg／L VEGF诱导HepG2细胞90 min A值分别为0．269±O．023、0．373± 0．083、0．393±0．081;120 min分别为0．371± 0．061、0．390±0．074、0．433±0．122,分别高于对照组的0．130±0．025、0．143±0．036、 0．210±0．028(P<0．05或0．01);经SB203580预处理的HepG2细胞,60,90,120 min鼠尾胶黏附实验吸光度A值分别为0．201±0．035、0．347± 0．112、0．479±0．217,VEGF诱导的肝癌细胞异质性黏附作用降低．5μg／L VEGF诱导肝癌细胞2 h后CD44v6表达阳性细胞数为32．6％± 4．2％,用SB203580阻断p384信号传导通路后, CD44v6阳性细胞数(4．3％±0．54％)显著下降 (P<0．01)．结论:VEGF可以通过p384信号传导通路增加肝癌细胞异质性黏附作用以及降低肝癌细胞的同质性黏附作用,促进肝癌HepG2细胞侵袭与转移．     

肝组织及血ANXA2表达异常对肝癌诊断与鉴别的价值

目的分析乙肝病毒(HBV)感染相关原发性肝癌(PHC)组织及血膜联蛋白亚组分(annexin A2,ANXA2)水平及其临床价值。方法以自身配对法分别收集HBV相关肝癌术后的癌、癌旁和远癌组织,以免疫组化法分析肝组织ANXA2蛋白表达与细胞分布、荧光定量PCR检测ANXA2mRNA表达,以ELISA法定量肝病患者血ANXA2水平。结果肝癌组织ANXA2表达见于胞浆和胞膜,癌旁组织见于胞浆;癌组织ANXA2表达无论在蛋白还是mRNA水平都显著高于癌旁组织(P<0.001);肝癌患者血ANXA2水平显著高于良性肝病(F=498.221,P<0.001);伴肝外转移、门静脉癌栓患者血ANXA2明显异常;与中分化、低分化程度显著相关;HBV感染与非感染组间差异非常明显(t=6.820,P<0.001);如以血ANXA2≥18ng/ml为界,与AFP联合诊断肝癌阳性率达96.5%。结论 ANXA2过表达有助于PHC的诊断与鉴别。     

IL-6对肝癌细胞HepG2浸润迁移能力的影响

目的观察肝癌细胞系HepG2自身分泌的白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)对其浸润迁移能力的影响。方法 RNA干扰技术沉默IL-6,同时设空白对照组(不加转染试剂)、正常对照组(转染空脂质体)、无义对照组(转染无义对照siRNA)、实验对照组(转染沉默IL-6的siRNA)。进行细胞划痕损伤实验检测细胞的迁移能力。结果 RT-PCR检测各组IL-6 mRNA的表达分别为100±7.87、303±19.95、160±10.95、23±7.02;IL-6在沉默组细胞的浸润迁移能力受到抑制,正常对照组(转染空脂质体)、无义对照组(转染无义对照siRNA)细胞的浸润迁移能力增强。结论 IL-6被沉默能抑制肝癌细胞系HepG2的迁移,肝癌细胞系HepG2IL-6表达增高能促进其自身发生迁移。     

稳定高表达CYP2E1基因肝癌HepG2细胞系的构建

目的构建稳定高表达CYP2E1基因的肝癌HepG2细胞系。方法通过NCBI查询CYP2E1的编码序列,设计并构建表达质粒p LV(Exp)-Puro-CMVm-CYP2E1,用载体对应的慢病毒包装质粒(p MDLg/pRRE、pRSVREV和p MD2.G)共同转染293T细胞。利用携带CYP2E1基因的慢病毒(Lenti-CYP2E1-e GFP-Puro)感染HepG2细胞系,采用嘌呤霉素抗性筛选方法构建高表达CYP2E1肝癌HepG2细胞系。增强绿色荧光蛋白检测转染情况,荧光定量PCR及Western blotting检测HepG2、空载及转染CYP2E1基因的HepG2细胞系中CYP2E1 mRNA和蛋白。结果 HepG2细胞系均成功转染CYP2E1基因。HepG2、空载及转染CYP2E1基因的HepG2细胞系中CYP2E1mRNA相对表达量分别为1.02±0.06、1.06±0.05、7.42±0.07,蛋白相对表达量分别为0.26±0.02、0.29±0.01、1.61±0.08,转染CYP2E1基因的HepG2细胞系与前两者比较,P均<0.05。结论通过慢病毒转染成功构建了稳定高表达CYP2E1基因的肝癌HepG2细胞系。     

姜黄素对缺氧条件下HepG2细胞VEGF表达的影响

目的:研究姜黄素对缺氧条件下人肝癌细胞HepG2中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法:姜黄素(0、1、2、5、10.mol/L)处理缺氧条件下的HepG2细胞6 h后,采用四唑盐(MTT)法观察HepG2细胞活性的变化,Western blot观察VEGF的蛋白水平变化,RT-PCR检测VEGF mRNA表达水平变化.结果:HqaG2细胞经1、2、5、10 μmol/L的姜黄素处理后,VEGF蛋白和mRNA水平与对照组(0μmol/L姜黄素处理)比较明显降低(蛋白:2.12±0.23,1.59±0.13,0.82±0.11,0.33±0.05 vs 2.85±0.37,P<0.05或P<0.01:mRNA:0.60±0.05,0.54±0.04,0.16±0.02,0.06±0.01 vs 0.81±0.07,均P<0.01),且降低程度随着姜黄素处理浓度的增加而变大.结论:姜黄素可抑制HepG2细胞中VEGF的基因表达.     

ANXA2和ANXA4在胃腺癌中的表达及临床意义

目的:研究膜联蛋白A2(AnnexinA2,ANXA2)、膜联蛋白A4(AnnexinA4,ANXA4)在人体胃腺癌(gastric adenocarcinoma cells,GAC)的表达,探讨其表达与GAC生物学行为的关系及两种蛋白的相关性.方法:免疫组织化学SP法检测组织芯片中75对配对的GAC和其相应癌旁组织ANXA2和ANXA4的表达.结果:在GAC和癌旁组织中ANXA2、ANXA4的表达分别为:33.1%(25)vs1.3%(1)、68.0%(51)vs25.5%(13),二者在GAC的表达显著高于癌旁组织(x2=24.448,P=0.000;x2=39.353,P=0.000);ANXA2和ANXA4在GAC表达呈正相关(r=0.335,P=0.003);两种蛋白的表达与GAC的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期和分化程度有关(P<0.05),与年龄、性别和远处转移无关(P>0.05);肿瘤大小与ANXA2表达有关(P<0.01),与ANXA4表达无关(P>0.05).结论:ANXA2和ANXA4的表达上调可能共同参与了GAC的发生、发展、浸润和转移,可作为临床预测GAC预后的标志物和治疗靶点.     

Nek2对肝癌细胞凋亡的影响及其分子机制的研究

目的研究Nek2(nima-related kinase2)在肝癌组织和肝癌细胞系中的表达,并通过沉默肝癌细胞中的Nek2基因,研究Nek2对肝癌细胞凋亡的影响,并初步探索其机制。方法使用Western blotting对27对肝癌及非癌组织和正常肝细胞株HL-77026及人肝癌细胞株HepG2、PLC/PRF/5、Hep3B、BEL-7402、SMMC-7721、QGY-7701中Nek2的蛋白表达情况进行分析。筛选HepG2细胞系进行下一步实验。沉默肝癌细胞HepG2中的Nek2因子,通过流式细胞仪(FACS)分析,采用Western blotting技术检测转染前后肝癌细胞中P53、Bcl-2、Bad、Caspase-3蛋白表达的变化。结果 Nek2在肝癌组织和6个肝癌细胞株中均表达升高。沉默肝癌细胞系HepG2中的Nek2后可使细胞的凋亡增强,P53、Caspase3和Bad的蛋白表达升高,抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表达下降。结论抑制Nek2表达可以明显促进肝癌HepG2细胞的凋亡,并通过影响凋亡信号传导通路中的重要因子来促进细胞的凋亡。     

槲皮素对人肝癌HepG2细胞的作用与机制

目的：探讨槲皮素（Qu)对人肝癌HepG2细胞的作用及其对人肝癌HepG2细胞化疗效果的影响。方法：体外培养传代人肝癌细胞系HepG2细胞，以甲基噻唑基四唑（MTT）法和荧光染色法检测不同浓度Qu及联合阿霉素（ADM）对HepG2细胞抑制率和细胞凋亡率的影响，并进行比较，结果：Qu能抑制人肝癌HepG2细胞生长，诱发细胞凋亡，能提高抗HepG2细胞化疗效果。结论：Qu具有抗肝癌HepG2细胞和化疗增敏作用。     

Chinese medicinal compound delisheng has satisfactory anti-tumor activity, and is associated with up-regulation of endostatin in human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 in three-dimensional culture

AIM： TO investigate the multicellular resistance of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells in three-dimensional culture to delisheng, 5-fluorouracil and adriamycin, and the possible molecular mechanisms of delisheng.
METHODS： Human hepatocellular carcinoma HepG2 cells were cultured with a liquid overlay technique. After the formation of multicellular spheroids, morphology was analyzed by phase contrast microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Sensitivity of HepG2 cells to delisheng, 5-fluorouracil and adriamycin was investigated by Ml-I- assay in multicelluar spheroids and monolayers. Vascular endothelial growth factor （VEGF） and endostatin expression were analyzed in multicellular spheroids treated with delisheng, 5-fluorouracil, adriamycin and negative control PBS, with immunohistochemical staining.
RESULTS： Multicellular spheroids exhibited structural characteristics somewhat different to those in monolayers. The cells in three-dimensional cell culture turned out to be less sensitive to delisheng, 5-fluorouracil and adriamycin than the cells cultured in monolayer. This showed that delisheng had a satisfactory cells inhibition ratio compared to 5-fluorouracil and adriamycin. Immunohistochemical staining showed that VEGF and endostatin expression was positive during growth as multicellular spheroids, and endostatin expression in spheroids with treatment of delisheng was higher than that with 5-fluorouracil, adriamycin and PBS （139.35 ± 7.83, 159.23 ± 10.34, 162.83 ± 3.47 and 148.48 ± 11.06, P 〈 0.05）.
CONCLUSION： Chinese medicine compound delisheng has satisfactory anti-tumor activity in HepG2 cells in three-dimensional culture, and the effects are associated with up-regulation of endostatin.     

SUMO-1、MDM2和P53对5-Fu诱导细胞凋亡的影响

目的:探讨SUMO-1、MDM2和P53对化疗药5-Fu诱导的HepG2细胞凋亡的影响.方法:5-Fu诱导HepG2细胞产生凋亡,以质粒pCMV-HDM1B(pMDM2)和pcDNA3-His6-SUMO-1(pSUMO-1)转染细胞,应用Western blot检测经药物诱导及转染前后细胞中内源性P53蛋白的表达强度...     

抑癌基因Smad4对HepG2生长的影响及其机制探讨

目的研究抑癌基因Smad4对人肝癌细胞株HepG2．生长的影响，并探讨其作用机制。方法采用脂质体瞬时转染法转染PFTX-5Smad4质粒至人肝癌细胞株HepG2（实验组），以转染空质粒PFTX-5的HepG2细胞为对照组，野生型HepG2细胞为空白组，利用免疫印迹（Westernblot）和逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测Smad4及血管内皮生长因子（VEGF）表达的变化；用MTT法检测细胞增殖及用FITC—AnnexinV、碘化吡啶（propidiumiodide，PI）双染后流式细胞仪（FCM）检测细胞周期和凋亡情况，Westernblot检测细胞周期素D1（CyclinD1）表达差异。结果PFTX-5Smad4瞬时转染到肝癌细胞后，实验组与对照组和空白组相比，Smad4mRNA和蛋白表达明显上升（P〈0．05），而VEGFmRNA和蛋白的表达显著降低（P〈0．05）。实验组细胞CyclinD1表达明显下降（P〈0．05），细胞周期时相分布出现合成前期（G。／G．期）阻滞。实验组细胞凋亡率明显升高（P〈0．01），增殖受到明显抑制。结论Smad4高表达可能通过降低肝癌细胞中VEGF的表达，抑制eyclinD1转录合成，并诱导强烈的G1期阻滞和细胞凋亡，对细胞的增殖有明显的抑制作用，为进-步研究肝癌生长增殖机制提供了实验基础。     

二十二碳六烯酸增强5氟尿嘧啶对人肝癌细胞的细胞毒活性

目的研究二十二碳六烯酸（DHA）联合5氟尿嘧啶（5-Fu）对肝癌细胞增殖、凋亡的影响。方法 CCK8法检测DHA联合5-Fu对肝癌细胞HepG2细胞增殖的影响;流式细胞仪检测DHA联合5-Fu对HepG2细胞凋亡的影响;RT-PCR检测DHA及5-Fu处理后HepG2细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的变化。结果 DHA联合5-Fu较单用5-Fu能更加明显抑制HepG2细胞的增殖,凋亡率分别为23.7%,13.2%。经DHA处理后HepG2细胞中Bcl-2表达下降,联合5-Fu后Bcl-2表达进一步减少,Bax表达则无明显改变。结论 DHA联合5-Fu能有效的抑制Bcl2的表达,从而发挥抑制肝癌细胞增殖、诱导肝癌细胞凋亡的效应。     

反义核酸协同化疗药物抑制肝癌细胞的增殖

目的 研究以端粒酶催化亚基hTERT基因为靶的反义硫代寡核苷酸(ASODN)分别与三种常用化疗药物顺铂(DDP)、5-氟尿嘧啶(5—FU)、阿霉素(ADM)联合用药抑制人肝癌细胞HepG2增殖的作用。方法 以脂质体为载体,将ASODN转染至HepG2中,用四氮唑盐(MTT)法染色并计算联用ASODN及化疗药物对HepG2增殖的抑制率,用SAS统计软件及金正均Q值法进行数据分析。结果 单用DDP、5-FU、ADM时其IC_(50)分别为1.07、4.15和0.29μg/ml,加入0.1μmol/L的ASODN,IC_(50)下降为0.25、1.52和0.12μg/ml,与单用化疗药的抑制效果相比有明显增强(F分别为66.92、25.96和8.56,P<0.001);Q值分析表明ASODN分别与中低浓度的DDP(≤1μg/ml)、5—FU(≤10μg/ml)、ADM(≤0.1μg/ml)联用有较好的协同作用(Q≥1.15)。结论 ASODN分别与化疗药物DDP、5—FU、ADM联合用药,均可显著增强抑制HepG2增殖的效果。     

重组腺病毒介导反义2型基质金属蛋白酶抑制人肝癌细胞株浸润的实验研究

目的构建携带反义2型基质金属蛋白酶(MMP2)的重组腺病毒并探讨它对人肝癌细胞株HepG2侵袭细胞基底膜的抑制作用。方法从新鲜肝癌组织中提取总RNA,用逆转录聚合酶链反应法合成MMP2cDNA序列中5'端转录起始位点附近长约500bp的基因片段,将此片段反义克隆到腺病毒载体系统的多克隆位点,经转染293细胞包装生成携带反义MMP2基因的重组腺病毒Ad-MMP2AS;利用侵袭小室模型,检测Ad-MMP2AS对肝癌细胞株(HepG2细胞)体外侵袭能力的影响。结果成功构建并生成携带反义MMP2基因片段的重组腺病毒Ad-MMP2AS,病毒滴度达1×108;体外细胞实验中Ad-MMP2AS能明显抑制HepG2细胞穿透人工重组基底膜的能力。结论重组腺病毒介导反义MMP2基因可望有效抑制肝癌细胞的浸润和转移,为肝细胞癌的基因治疗提供新的方法。