酵母双杂交法筛选与受翻译调节的肿瘤蛋白相互作用的蛋白

目的:采用酵母双杂技术筛选与受翻译调节的肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)相互作用的蛋白,以探讨TCTP的生物学功能。方法:采用PCR法扩增获得TCTP基因,并将其插入酵母双杂交诱饵载体中构建获得pDEST32-TCTP;检测pDEST32-TCTP在酵母菌中的表达和自激活情况,利用酵母双杂交系统筛选出带有靶蛋白基因的阳性克隆并测序鉴定;免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)法验证人肝癌细胞Huh7中TCTP与细胞S期激酶相关蛋白-2(S-phase kinase-associated protein2,Skp2)的相互作用。结果:成功构建获得酵母双杂交诱饵载体pDEST32-TCTP,pDEST32-TCTP在酵母菌中可以表达,且在3-氨基-1,2,4-三唑(3-amino-1,2,4-triazole,3AT)浓度为20mmol/L时无自激活作用。采用酵母双杂交系统共筛选获得6个可与TCTP相互作用蛋白的基因,包括Smad4、人热休克蛋白60(heat shock protein60,HSP60)、TAKl、Bcl-xl、卵泡抑素(follistatin,FS)和Skp2。其中Skp2与TCTP蛋白的相互作用在Co-IP中得到验证。结论:应用酵母双杂交系统可筛选获得一组与TCTP相互作用的蛋白,为进一步研究TCTP的生物学功能提供了可靠的实验依据。     

酵母双杂交技术筛选肺癌组织中MCM7蛋白结合蛋白

背景与目的 微小染色体维持蛋白(mini-chromosome maintenance proteins,MCM)MCM7为MCM复合体成员之一,在启动DNA复制、合成中起关键作用,但对能够与其结合的蛋白所知甚少.本研究应用酵母双杂交方法筛选肺癌组织中MCM7蛋白的结合蛋白.方法构建MCM7全长cDNA-pGBKT7质粒,与含肺癌组织cDNA文库-pACT2质粒转化酵母AH109,在涂有X-a-gal营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长,挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒,转化大肠杆菌提取质粒DNA后测序,进行生物信息学分析.结果 筛选出11种与MCM7蛋白特异性相互作用的蛋白,其中细胞骨架蛋白5种,各种酶、激酶以及相关受体6种.结论 克隆到的基因对进一步研究MCM7蛋白的功能有一定提示作用.     

应用酵母双杂交筛选人胃癌耐药细胞SIVA-1基因相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交筛选人胃癌耐药细胞中与SIVA-1基因相互作用的蛋白。方法:构建人胃癌耐药细胞的cDNA文库,运用酵母双杂交及体外免疫共沉淀实验方法筛选SIVA-1相关作用蛋白,探讨其对胃癌耐药细胞耐药性的影响机制。结果:成功构建人胃癌耐药细胞cDNA文库,滴度为4.78×106 cfu/mL,重组率>95%,扩增后滴度达9.50×109 pfu/mL,成功构建诱饵表达载体pGBKT7-SIVA-1,且经自激活检测表明重组诱饵载体pGBKT7-SIVA-1不具有自激活性。经过初筛,我们获得能同时激活三个报告基因（Ade2、His3、LacZ）的阳性克隆21个,随后将21个阳性克隆进行质粒抽提、扩增并进行酵母回转实验,最终获得4个与SIVA-1截短体相互作用的阳性候选克隆。对这四个文库插入片段进行基因测序,最终得到2个不同的与SIVA-1相互作用的蛋白:UXT（泛表达转录子）和PCBP1（多聚胞嘧啶结合蛋白1）。经体外免疫共沉淀实验后,最终筛选出与胃癌耐药细胞SIVA-1相互作用的PCBP1。结论:PCBP1与SIVA-1之间存在蛋白相互作用关系。     

酵母双杂交筛选原癌基因proto-Dbl的上游调控分子

目的：探讨VL domain对Dbl癌基因活性的调控机制。方法：本文通过酵母双杂交的方法,以proto-Dbl的VL domain为诱饵蛋白对人胎脑文库进行筛选。结果：研究共获得7个能与VL domain相互作用的蛋白。结论：Proto-Dbl VL domain相互作用蛋白的发现将为揭示proto-Dbl的功能奠定基础。     

食管癌相关基因1编码蛋白的相互作用蛋白筛选

目的　筛选与食管癌相关基因 1(ECRG 1)编码蛋白相互作用的蛋白 ,为其功能研究奠定基础。方法　将编码ECRG 1羧基端 378个氨基酸的DNA序列插入到pGBKT7 DNA BD载体 ,与编码Gal4DNA结合结构域的DNA序列拼接做融合基因 ,将此重组质粒与已克隆到pACT2载体上的人肝脏cDNA文库 (与编码Gal4激活结构域的DNA序列融合 )共转化酵母细胞AH10 9。ECRG 1与相应的人肝脏cDNA片段编码的蛋白发生相互作用后 ,可激活报告基因的表达。排除假阳性后 ,阳性克隆中的文库cDNA进行测序分析。同源性检索搜寻GenBank中与之相同或相似的序列。结果　共转化得到约 3× 10 6个转化子 ,2 3个克隆有报告基因的表达。排除假阳性后 ,得到 2个阳性克隆 ,它们分别编码Miz 1(myc interactingznfingerprotein 1)和FLNA(actin bindingprotein 2 80 )。结论　ECRG 1基因编码蛋白在酵母中可特异性的结合Miz 1和FLNA ,提示ECRG 1可能通过与MIZ 1、FLNA相互作用参与调控细胞周期的运行。     

酵母双杂交技术筛查与vasostatin相互作用的蛋白质

摘 要 目的: 通过酵母双杂交技术筛查与血管生长抑制因子vasostatin相互作用的蛋白质,为进一步阐明其抑制血管生成作用的分子机制奠定基础。方法: 应用第3代酵母双杂交系统，构建vasostatin诱饵质粒，经过表达和自激活验证后筛选预转化的人内皮细胞cDNA文库。将在四缺培养基中筛选得到的阳性克隆提取酵母质粒转化大肠杆菌，进行限制性酶切和测序，寻找可能与vastotatin具有相互作用的蛋白序列。结果： 经过酵母双杂交共获得21个克隆,经过验证,有3个阳性克隆;经过NCBI的BLAST进行同源性分析, 它们的核酸和蛋白序列与已知基因高度同源,它们分别为层黏连蛋白α5（7 547~8 112）和整合素αV（1 257~1 820、316~878）片段，均为重要的配体结合部位。Vasostatin蛋白通过与该区域结合，影响FAK、VEGF和bFGF等的信号通路，抑制血管生成。结论: 酵母双杂交筛选获得的层黏连蛋白和整合素蛋白的3个蛋白片段，它们与肿瘤内血管内皮细胞增殖和迁移等密切相关。     

酵母双杂合体系筛选乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X 蛋白是一个广义反式作用因子,同原发性肝癌的发生发展密切相关,由于其功能同蛋白-蛋白间相互作用有关,故本研究利用酵母双杂合体系筛选并鉴定HBV X 蛋白结合蛋白。     

PD-L1-Ig融合蛋白的酵母表达及其对T细胞的抑制作用

目的：利用毕赤酵母表达系统表达PDL1Ig融合蛋白,检测该融合蛋白的生物学活性。方法：化学合成hPDL1IgG4融合基因,构建携带该基因的酵母表达载体,转化GS115酵母菌株后分泌表达融合蛋白,亲和层析和离子交换层析法纯化,SDSPAGE和Western blotting分析鉴定。ELISA法检测融合蛋白与受体PD1的结合能力,混合淋巴细胞反应检测融合蛋白对T细胞功能的抑制能力,51Cr稀释法检测其对CTL杀伤人结肠癌SW480细胞效应的抑制作用。结果：成功构建酵母表达载体pPIC9KPDL1IgG4,转化菌株分泌表达PDL1IgG4融合蛋白,相对分子质量为55 000,含量为120 μg/ml。发酵菌株,纯化制备融合蛋白。融合蛋白与受体PD1具有良好的结合能力,能够显著抑制T细胞增殖、活化（P<0.01）,并抑制CTL对结肠癌细胞的杀伤（P<0.01）。结论：成功制备了酵母表达PDL1IgG4融合蛋白,该融合蛋白具有良好的生物学活性,为深入研究其在肿瘤免疫应答中的调控效应奠定了良好基础。     

宫颈癌HeLa细胞内SKP2结合蛋白的筛选和功能预测

目的： 通过免疫共沉淀与质谱分析技术从宫颈癌HeLa细胞中获取与S期激酶相关蛋白2 （S-phase kinase-associated protein 2,SKP2）结合的蛋白质群体并预测其生物功能。 方法： 以免疫共沉淀与Western blotting技术建立SKP2免疫共沉淀体系, 以SDS-PAGE和银染技术获得SKP2结合蛋白的特异条带,通过质谱分析技术获得可能与SKP2结合的蛋白群体,应用生物信息 学技术对筛选得到的蛋白进行GO分析与KEGG分析。 结果： HeLa细胞内存在一定水平的SKP2蛋白表达,可进行免疫共沉淀 反应;成功建立了SKP2免疫共沉淀体系,并获得SKP2结合蛋白样品;针对差异的凝胶条带进行质谱分析,共鉴定出SKP2结合蛋 白563个;设定筛选条件后,获得可信度较高的SKP2蛋白270个,进行GO分析与KEGG分析后初步预测了结合蛋白参与的细胞 功能和信号通路。 结论： 从宫颈癌HeLa细胞中成功筛选获取SKP2 结合蛋白,为后续筛选靶标结合蛋白和寻找细胞靶向药物奠 定了基础。     

酵母双杂交筛选NGAL相互作用蛋白

目的：中性粒细胞明胶酶相关脂萼蛋白（neutrophil gelatinase-assiociated lipocalin，NGAL）功能不明，籍筛选与之相互作用蛋白，构筑相互作用图谱，为揭示其功能提供新途径。方法：利用蛋白质相互作用原理，应用酵母双杂交技术，构建pGBKT7-NGAL载体，以NGAL为诱饵，在人类骨髓cDNA文库中筛选与之相互作用蛋白的基因。结果：通过酵母交配筛库、一对一验证和β-gal分析筛选出40个阳性克隆；测序．利用网上数据库（http：//www．ncbi．nlm．nih．gov）对序列进行比对．初步确定了31种基因．其中11种为未知基因，20种为已知基因。已知基因中舍有编码区的有LGALS1、MT2A、COX1、RNP24、ATP1R3、IGL、IGH、VDJ、RARRES2、GYPA、NEB和NPC2。结论：筛选得到31种可能与NGAL相互作用蛋白的基因．这为研究NGAL功能及作用机制提供了新途径。     

组蛋白去乙酰化酶1相互作用蛋白的筛选

目的：筛选与组蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase 1,HDAC1）相互作用蛋白。方法：将带有Flag标签的HDAC1表达质粒分别转染食管癌细胞EC109和结肠癌细胞HCT116,采用免疫印迹检测外源基因的表达。然后采用Flag抗体进行亲和沉淀,收集蛋白样品进行质谱测定。结果：采用RT－PCR技术成功地构建了含Flag标签的HDAC1。转染后检测显示该表达质粒可高效表达于EC109和HCT116细胞中。亲和沉淀所获得的蛋白样品经质谱检测后,分别从EC109细胞和HCT116细胞中筛选出107和17个可能与HDAC1相互作用的蛋白质。结论：通过质谱筛选出可能与HDAC1相互作用的蛋白,为进一步研究HDAC1基因功能及其在肿瘤中的生物学意义奠定基础。     

酵母双杂交筛选NGAL相互作用蛋白

目的:中性粒细胞明胶酶相关脂萼蛋 白(neutrophilgelatinase assiociatedlipocalin, NGAL)功能不明,籍筛选与之相互作用蛋白, 构筑相互作用图谱,为揭示其功能提供新途径。 方法:利用蛋白质相互作用原理,应用酵母双杂 交技术,构建pGBKT7 NGAL载体,以NGAL 为诱饵,在人类骨髓cDNA文库中筛选与之相 互作用蛋白的基因。结果:通过酵母交配筛库、 一对一验证和β gal分析筛选出40个阳性克 隆;测序,利用网上数据库(http://www.ncbi. nlm.nih.gov)对序列进行比对,初步确定了31 种基因,其中11种为未知基因,20种为已知基 因。已知基因中含有编码区的有LGALS1、 MT2A、COX1、RNP24、ATP1B3、IGL、IGH VDJ、RARRES2、GYPA、NEB和NPC2。结论: 筛选得到31种可能与NGAL相互作用蛋白的 基因,这为研究NGAL功能及作用机制提供了 新途径。     

卵巢癌差异表达基因2氨基端PID结构域相互作用蛋白的筛选

目的〖HT5"SS〗： 筛选人卵巢癌差异表达基因2(differentially expressed in ovarian cancer 2, DOC2)氨基端磷酸酪氨酸作用结构域PID (nDOC2)的相互作用蛋白质,为研究DOC2作用的信号通路提供线索。〖HT5W〗方法〖HT5"SS〗： 将含有人DOC2氨基端PID结构域cDNA的片段插入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母菌AH109并在其内表达,然后转化人胎脑cDNA文库,在营养缺陷培养基和Xα半乳糖苷酶（X     

肺癌组织中Atonal homolog 1与Disabled-2的表达及其临床意义

目的：分析Atonalhomolog1（Atohl）和Disabled-2（Dab2）在肺癌组织中的表达及其与临床病理因素间的关系。方法：采用免疫组化方法检测Atohl和Dab2在100例非小细胞肺癌中的表达情况。结果：在100例非小细胞肺癌中,Atohl的细胞质和细胞核的平均阳性表达率分别为82．70％±19．06％和43．10％±27．16％,明显高于Atohl在癌旁正常组织中的细胞质和细胞核的平均阳性表达率（71．80％±19．14％,18．77％±10．54％）。Atohl在细胞核内的表达与肺癌的低分化（P=0．026）负相关,并且在肺腺癌（P=0．002）和女性患者（P=0．042）中阳性率较高。Dab2在细胞核内的表达与肺癌的原发灶T分期负相关（P=0．025）,并且与肺癌的TNM分期相关（P=0．002）。Atohl在肺癌中的细胞质表达与Dab2的细胞质表达显著相关（P〈0．001）。结论：Atohl在细胞核内的表达与肺癌的低分化负相关,Dab2在细胞核内的表达与肺癌患者TNM分期负相关。Atohl和Dab2在肺癌组织中可能具有协同表达的现象。     

HPP1-mediated tumor suppression requires activation of STAT1 pathways

HPP1 is a recently discovered gene that is epigenetically silenced in a number of tumor types, suggesting a potential role as a tumor suppressor. However, whether HPP1 has tumor suppressor activity is not clearly known. We have sought to investigate the effects of HPP1 on tumor growth and survival and to identify signaling pathways that mediate HPP1's mechanism of action. Forced expression of HPP1 into HCT116 colon cancer cell lines blocked the ability of HCT116 tumors to grown in vivo in nude mice. In cell culture, ectopic expression of HPP1 induces apoptosis and potently inhibits soft agar colony formation. HPP1 overexpression was also associated with a moderate reduction in in vitro proliferation characterized by an accumulation of cells in the G0/G1 phase of the cell cycle. Microarray analysis revealed that ectopic expression of HPP1 resulted in a dramatic upregulation of STAT1 as well as a large number of associated interferon-inducible genes. RNA interference-mediated abrogation of STAT1 reversed HPP1's antiproliferative effects. We conclude that HPP1 demonstrates tumor suppressive and pro-apoptotic activity, both in vitro and in vivo. Coupled with its inactivation in a number of tumor types, our data provides evidence to support the role of HPP1 as a tumor suppressor gene. Moreover, activation of the STAT1 pathway likely represents the principal mediator of HPP1's tumor suppressive properties.