丁酸钠对大肠癌HCT-116细胞增殖及自噬影响研究

目的 研究丁酸钠(sodium butyrate,NaB)对大肠癌HCT-16细胞增殖和自噬的影响.方法 不同浓度(0.1、0.5、1、2和5 mmol/L) NaB处理大肠癌HCT-116细胞,MTT法检测细胞的存活率;蛋白质印迹法检测自噬特异性蛋白LC3B表达量的变化;单丹磺酰尸胺(MDC)和吖啶橙(AO)染色检测酸性自噬泡的形成.结果 单因素方差分析结果显示,不同浓度(0.1、0.5、1、2和5mmol/L)NaB处理组与对照组细胞的存活率相比,差异有统计学意义,F=24.076,P＜0.001;0.5 mmol/L浓度的NaB作用24 h即能显著抑制大肠癌HCT-116细胞的增殖,细胞存活率为(94.00±4.09)％,P＜0.05;1、2、5 mmol/L浓度的NaB作用大肠癌HCT-116细胞24 h,细胞存活率分别为(89.43±1.83)％、(84.56±4.77)％和(81.00±7.38)％,与对照组比较,P值均＜0.01.2 mmol/L NaB处理24后,HCT-116细胞内酸性囊泡细胞器明显蓄积;不同浓度NaB处理HCT-116细胞24 h后,LC3B-Ⅱ蛋白的表达量随着NaB浓度增加而增加;2 mmol/LNaB处理HCT-116不同时间(10 min、30 min、1h、2h、4h、6h、12h和24 h)后,LC3B-Ⅱ蛋白的表达量随着NaB作用时间的延长而增加.结论 NaB可抑制大肠癌HCT-116细胞增殖并诱导其发生自噬.     

阿西替尼通过调控自噬对结肠癌HCT-116细胞增殖、凋亡的影响研究

目的研究阿西替尼(AXI)对结肠癌HCT 116细胞增殖、凋亡及自噬的影响。方法体外培养结肠癌HCT 116细胞,分为AXI 1组(150 μmol／L)、AXI 2组(300 μmol／L)、AXI 3组(600 μmol／L)及无任何添加的正常对照组(NC组)。四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测各组结肠癌HCT 116细胞增殖情况;AnnexinV FITC／PI法检测各组结肠癌HCT 116细胞凋亡情况;Western Blot检测结肠癌HCT 116细胞自噬相关蛋白LC3 Ⅱ、beclin1,雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路中p mTOR、p P70S6K蛋白水平、增殖相关蛋白CyclinD1、c Myc,以及凋亡相关cleaved caspase3、B细胞淋巴瘤 2(Bcl 2)、Bax蛋白表达水平。结果与NC组比较,AXI 1组和AXI 2组结肠癌HCT 116细胞增殖抑制率、凋亡率、LC3 Ⅱ、beclin1、Bax、cleaved Caspase3蛋白表达水平依次增加(P<005),p mTOR、p P70S6K、Cyclin D1、c Myc、Bcl 2蛋白表达水平依次减少(P<005)。AXI 2组和AXI 3组结肠癌HCT 116细胞增殖抑制率、凋亡率、LC3 Ⅱ、beclin1、p mTOR、p P70S6K、CyclinD1、c Myc、cleaved caspase3、Bcl 2、Bax蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P>005)。结论AXI可通过抑制mTOR通路激活,诱导结肠癌HCT 116细胞自噬,抑制其增殖,促进其凋亡,初步揭示了AXI对结肠癌细胞的作用机制,为结肠癌的靶向治疗提供了新思路。     

三七皂苷R1调控PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导人下咽鳞状细胞癌FaDu细胞凋亡和自噬北大核心

目的:探讨三七皂苷R1(notoginsenoside R1,NGR1)对人下咽鳞状细胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HSCC)FaDu细胞凋亡以及自噬的影响,并对其涉及的信号通路进行研究。方法:75μmol/L、150μmol/L、300μmol/L NGR1作用于FaDu细胞24 h后,采用MTT检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡;自噬双标腺病毒检测自噬流;Western blot检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ以及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达水平。结果:NGR1能够抑制FaDu细胞的增殖并促进细胞凋亡;NGR1可诱导FaDu细胞自噬,并呈一定浓度依赖性;Western blot结果显示,NGR1作用于Fa Du细胞24 h后,LC3Ⅱ表达明显增加,而p-PI3K、p-AKT、p-m TOR表达相较于Control组明显下降。结论:NGR1可抑制Fa Du细胞增殖,诱导细胞凋亡与自噬,其机制可能与抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路有关。     

自噬介导葫芦素E对乳腺癌细胞Bcap-37的细胞毒作用北大核心CSCD

目的研究葫芦素E(Cucurbitacin E,Cu E)或Cu E联合自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)对乳腺癌Bcap-37细胞增殖的影响,并探讨其分子机制。方法 MTT法检测乳腺癌Bcap37细胞增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测LC3-Ⅰ/Ⅱ、P62蛋白表达。透射电子显微镜检测自噬溶酶体形成。结果 Cu E通过诱导凋亡显著抑制Bcap-37增殖。经Cu E处理的Bcap-37细胞中自噬特异性标志物LC3-Ⅱ表达增高,而LC3-Ⅰ、P62表达降低。细胞内自噬溶酶体形成。结论 Cu E可诱导Bcap-37细胞凋亡及细胞保护性自噬。抑制自噬可增加Cu E对Bcap-37的细胞毒性。     

长程缺氧对结肠癌细胞增殖的影响

目的:体外观察长程缺氧环境对结肠癌细胞SW480和HCT116增殖能力的影响并探讨其可能的作用机制。方法:缺氧培养结肠癌SW480和HCT116细胞14～28d,采用MTT法和平板克隆法检测缺氧条件下2种结肠癌细胞增殖能力的改变;激光共聚焦显微镜下观察缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)和Wnt/β-catenin信号通路关键因子β-catenin的表达;蛋白质印迹法检测HIF-1α和β-catenin、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、Ser9被磷酸化的GSK-3β[phospho-glycogen synthase kinase-3β(Ser9),pGSK-3β(Ser9)]以及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达。以常氧下培养的这2种细胞作为对照。结果:细胞生长曲线和平板克隆检测结果均显示,长程缺氧适应后SW480和HCT116细胞的增殖能力较常氧下明显增强(P<0.01);激光共聚焦显微镜下观察发现,HCT116细胞在缺氧条件下HIF-1α的表达部位发生改变;蛋白质印迹法检测发现,与常氧组比较长程缺氧组细胞中HIF-1α(P<0.05)、β-catenin(P<0.05)和pGSK-3β(Ser9)(P<0.01)蛋白的表达均上调,而总GSK-3β的表达无明显变化,PCNA在缺氧条件下表达上调(与常氧组比较,在SW480细胞中P<0.05,在HCT116细胞中P<0.01)。结论:缺氧适应可促进结肠癌细胞SW480和HCT116的增殖,这可能是HIF-1α与Wnt/β-catenin信号转导通路共同作用的结果。     

芹菜素诱导胃癌SGC-7901细胞自噬及其对凋亡 的影响

目的：探讨芹菜素（API）是否诱导胃癌SGC-7901细胞发生自噬及其对细胞凋亡的影响。方法：采用不同浓度（0、20、40、60、80 μmol/L）的API处理胃癌SGC-7901细胞24 h,MTT法检测API对细胞生长的抑制情况。分别采用不同浓度（0、20、40、60、80 μmol/L）API处理细胞24 h,及60 μmol/L的API处理不同时间（0、12、24、36、48 h）,Western blot检测自噬标志蛋白微管相关蛋白l轻链3（LC3）、Beclin-1和磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/Akt/mTOR信号通路中关键分子p-Akt、p-mTOR的表达;电子显微镜下观察细胞自噬情况。细胞经自噬抑制剂氯喹（CQ）或3-甲基腺苷（3-MA）预处理后再加入API,Western blot检测聚二磷酸腺苷-核糖体聚合酶（PARP）的表达;流式细胞术流检测细胞凋亡率。结果：API对胃癌SGC-7901细胞生长具有明显抑制作用并呈剂量-效应关系。随着API浓度和作用时间的增加,SGC-7901细胞LC3Ⅱ与Beclin-1蛋白表达均增加,各剂量组与对照组相比较差异均具有统计学意义（P < 0.05）;API处理后的细胞逐渐出现自噬囊泡和自噬溶酶体;p-Akt、p-mTOR蛋白表达降低。采用自噬抑制剂抑制细胞自噬后,除API组LC3Ⅱ与Beclin-1蛋白表达明显高于对照组外（P < 0.05）,各组蛋白表达无显著差异。API+CQ组和API+3-MA组的PARP蛋白剪切片段表达及凋亡率均高于对照组和API组（P < 0.05）。结论：API可以诱导胃癌SGC-7901细胞发生自噬,其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路关键分子p-Akt、p-mTOR活性有关;抑制API诱导的自噬能够增强API的凋亡诱导效应,从而增强对胃癌SGC-7901细胞的杀伤作用。     

忍冬藤提取物抗结肠癌作用研究

目的 研究忍冬藤提取物的体外抗结肠癌作用。方法 体外培养结肠癌HCT116和SW480细胞并用忍冬藤提取物干预,采用CCK8法检测忍冬藤提取物对HCT116和SW480细胞增殖的影响;采用Hochest法和Annexin V/PI法检测忍冬藤提取物及p53抑制剂PFT-α对HCT116和SW480细胞凋亡的影响;JC-1法检测忍冬藤提取物对HCT116细胞线粒体膜电位的影响;Western Blot检测忍冬藤提取物对HCT116细胞相关蛋白表达水平的影响。结果 相较于空白组,忍冬藤提取物可明显抑制结肠癌HCT116和SW480细胞增殖,并促进细胞凋亡(P<0.01),促进HCT116细胞线粒体膜电位坍塌,明显上调HCT116细胞Bax/Bcl-2的比值(P<0.01)以及Cleaved PARP、Cyt-C、Cleaved Caspase-3和p53蛋白表达(P<0.05,P<0.01);相较于忍冬藤提取物组,忍冬藤提取物+PFT-α明显抑制HCT116细胞凋亡(P<0.01)。结论 忍冬藤提取物可通过诱导p53依赖的线粒体凋亡发挥抗结肠癌作用。     

阿西替尼对结肠癌HCT-116细胞增殖、凋亡及自噬的影响研究

目的 研究阿西替尼(AXI)对结肠癌HCT-116细胞增殖、凋亡及自噬的影响。方法 体外培养结肠癌HCT-116细胞,分为AXI 1组(15.0μmol/L)、 AXI 2组(30.0μmol/L)、 AXI 3组(60.0μmol/L)及无任何添加的正常对照组(NC组)。四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测各组结肠癌HCT-116细胞增殖情况;AnnexinV-FITC/PI法检测各组结肠癌HCT-116细胞凋亡情况;Western Blot检测结肠癌HCT-116细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ、beclin1,雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路中p-mTOR、p-P70S6K蛋白水平、增殖相关蛋白CyclinD1、c-Myc,以及凋亡相关cleaved-caspase3、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bax蛋白表达水平。结果 与NC组比较,AXI 1组和AXI 2组结肠癌HCT-116细胞增殖抑制率、凋亡率、LC3Ⅱ、beclin1、Bax、cleaved-Caspase3蛋白表达水平依次增加(P0.05),p-mTOR、p-P70S6K、Cyclin D1、c-Myc、Bcl-2蛋白表达水平依次减少(P0.05)。AXI 2组和AXI 3组结肠癌HCT-116细胞增殖抑制率、凋亡率、LC3Ⅱ、beclin1、p-mTOR、p-P70S6K、CyclinD1、c-Myc、cleaved-caspase3、Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论 AXI可通过抑制mTOR通路激活,诱导结肠癌HCT-116细胞自噬,抑制其增殖,促进其凋亡,初步揭示了AXI对结肠癌细胞的作用机制,为结肠癌的靶向治疗提供了新思路。     

c-Raf基因对大肠癌细胞生长的作用及其分子机制研究

摘 要：［目的］ 通过转染siRNA沉默c-Raf基因以探讨其在大肠癌细胞生长中的作用及其相关分子机制。［方法］通过阳离子脂质体介导的方法将siRNA转染入大肠癌细胞HCT116和SW620,经Western blot验证siRNA的干扰效果。经MTT法、Transwell实验、细胞克隆形成实验和流式细胞术研究下调c-Raf基因对HCT116和SW620增殖、迁移和相关细胞活力的影响。采用Western blot法检测转染siRNA后相关细胞周期蛋白水平。［结果］ HCT116和SW620转染后细胞活力明显下降,转染siRNA 48h后HCT116与SW620细胞的抑制率分别为34%、28%。流式细胞术发现HCT116和SW620在c-Raf基因下调后,较多细胞滞留在G1期(P<0.05)。Western blot实验发现转染siRNA后细胞p-Cdc2、E2F1、CyclinD1表达水平均有下降(P<0.05)。siRNA转染HCT116 和SW620细胞后,细胞凋亡比例分别为9.68%±2.37%、7.29%±1.68%,均高于对照组(P<0.05)。siRNA转染HCT116 和SW620细胞后Caspase-3相对水平分别为0.57±0.11、0.47±0.09,Bcl-2相对水平分别为0.16±0.05、0.23±0.04,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。siRNA转染HCT116和SW620细胞后N-cadherin相对水平分别为0.24±0.07、0.22±0.04,E-cadherin相对水平分别为0.47±0.12、0.58±0.13,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。［结论］通过下调c-Raf基因的表达可将大肠癌细胞阻滞在G1期,促使细胞发生凋亡,同时抑制大肠癌细胞发生EMT转化。     

RNA干扰ATG16L1抑制人胃癌细胞BGC823自噬并促进顺铂诱导的细胞凋亡

摘 要：［目的］ 检测RNA干扰自噬相关基因16L1(autophagy-related gene 16L1,ATG16L1)表达后胃癌细胞的自噬活性,观察在ATG16L1敲减下顺铂（DDP）对胃癌细胞凋亡的影响。［方法］ 用ATG16L1 siRNA 技术构建ATG16L1 低表达的人胃癌BGC823 细胞株作为干扰组,转染阴性干扰的BGC823 细胞作为阴性转染组,未转染的BGC823 细胞作为对照组;Western blot 检测各组细胞中ATG16L1 的表达和自噬标志物微管相关轻链蛋白3(microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3,LC3) 及死骨片蛋白1(sequestosome 1,P62)的表达;免疫荧光观察LC3II情况。CCK-8实验检测DDP处理后各组细胞增殖能力,计算IC50值。经DDP刺激后,流式细胞术检测细胞凋亡,再用Western blot 检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白表达。最后应用公共数据库Kaplan-Meier对多组胃癌患者mRNA 表达谱进行分析,预测ATG16L1 的表达水平对患者预后的影响。［结果］ ATG16L1 siRNA干扰组较对照组蛋白表达水平明显降低(P<0.001) ;LC3II水平下降(P<0.01),P62 水平上升(P<0.01),并且LC3荧光强度下降(P<0.05) 。经DDP诱导后,干扰组细胞增殖明显受抑（P<0.001）,细胞凋亡率明显增加(P<0.01) ;ATG16L1 干扰组中促凋亡分子cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表达比对照组明显增加(P<0.001,P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2 表达减少(P<0.001) 。公共数据库Kaplan-Meier表达谱芯片分析结果显示高表达ATG16L1组较低表达组预后差,差异有统计学意义 (P=0.001)。 ［结论］ RNA干扰ATG16L1抑制胃癌细胞自噬,并能够明显增强顺铂诱导人胃癌细胞的凋亡,提示靶向干扰ATG16L1抑制细胞自噬后可能通过调控细胞凋亡提高胃癌细胞对化疗药物的敏感性。     

青藤碱对肠癌细胞的抑制作用

目的:观察青藤碱对肠癌细胞的抑制作用。方法:选取HCT116细胞分3组,分别用DMSO（对照组）、20 μmol/L和40 μmol/L的青藤碱以及6 μmol/L的5氟尿嘧啶（5-FU）处理细胞。MTT检测不同浓度药物对HCT116细胞增殖的影响。PI染色技术和JC-1染色分别检测药物对细胞周期和凋亡的作用。通过Western blot检测青藤碱对HCT116细胞中Cyclin D1和bcl-2的影响。Transwell实验检测青藤碱对HCT116细胞迁移的影响。通过Western blot检测青藤碱对HCT116细胞中MMP2的影响。结果:与DMSO相比,20 μmol/L和40 μmol/L的青藤碱以及6 μmol/L的5-FU作用于HCT116细胞24 h后对细胞的抑制率分别为:(33.16±6.01)%、(47.48±2.32)%和(62.31±3.26)%。青藤碱抑制G1-S期转化,促进细胞凋亡。Western blot结果显示,青藤碱抑制Cyclin D1、bcl-2和MMP2在HCT116细胞中的表达。结论:青藤碱抑制HCT116细胞的生长和迁移。     

维生素E琥珀酸酯通过Akt/mTOR信号通路诱导人胃癌细胞SGC-7901发生保护性自噬

目的： 观察维生素E琥珀酸酯 (vitamin E succinate,VES)处理SGC-7901细胞后是否发生自噬,并探讨自噬在VES抑制细胞增殖中的作用。方法：用不同浓度 (0、5、10、15、20 μg/mL)VES处理SGC-7901细胞24 h后,电子显微镜观察自噬体形态;VES处理转染GFP-LC3质粒后的SGC-7901细胞,荧光显微镜观察自噬情况;Western blot检测自噬标志蛋白LC3,以及Akt/mTOR通路关键分子Akt,mTOR活性变化;采用自噬抑制剂氯喹 (chloroquine,CQ)和3-甲基腺苷 (3-methyladenine,3-MA)处理细胞后,MTT法检测细胞的增殖能力。结果：电子显微镜观察显示经不同浓度VES处理后,细胞中出现了典型的自噬囊泡以及自噬溶酶体等自噬各阶段的形态变化;荧光显微镜观察显示GFP-LC3质粒转染后随VES处理剂量的增加,绿色点状荧光逐渐聚集增强;Western blot结果显示,VES可使LC3-Ⅱ蛋白表达增强;并下调Akt/mTOR通路关键分子Akt,mTOR的活性;MTT结果显示VES+CQ组和VES+3-MA组的细胞增殖抑制率均明显高于VES单独处理组 (P均 <0.05),即自噬抑制剂CQ与3-MA预处理使细胞增殖率进一步下降,提示VES诱导的肿瘤细胞自噬对肿瘤细胞增殖具有保护作用。结论：VES可以通过抑制Akt/mTOR通路活性诱导人胃癌细胞SGC-7901细胞发生自噬,且此种自噬为保护性自噬。     

miR-124 通过靶向BECN1 基因调控细胞自噬抑制食管癌KYSE170 细胞的侵袭和迁移

目的：探讨miR-124 通过调控细胞自噬对食管癌KYSE170 细胞侵袭和迁移能力的影响。方法：食管癌KYSE170 细胞转染miR-124 mimic,Transwell 实验检测细胞侵袭和迁移能力的变化,双荧光素酶报告基因验证miR-124 对BECN1(Beclin1)基因的靶向调控作用,Western blotting 分析对BECN1、P62 及LC3 蛋白表达水平的影响。向KYSE170 细胞中转染BECN1 siRNA沉默BECN1 的表达,Transwell 法检测细胞侵袭及迁移能力的变化,Western blotting 检测BECN1、P62 及LC3 蛋白的表达。将miR-124 mimic 与BECN1 过表达质粒共转染至KYSE170 细胞,Transwell 实验检测细胞侵袭及迁移能力的变化,Western blotting 检测自噬相关基因表达的变化。结果：转染miR-124 mimic 后,KYSE170 细胞的侵袭和迁移能力下降(P<0.05),BECN1 蛋白及荧光素酶报告基因活性均明显下调(均P<0.01),自噬相关蛋白P62 表达增高,LC3 表达水平明显降低(均P<0.01)。沉默BECN1 表达抑制食管癌细胞侵袭及迁移(P<0.01),而过表达BECN1 使miR-124 mimic 对KYSE170 细胞自噬、侵袭和迁移能力的抑制作用明显减弱(P<0.01),自噬相关蛋白P62 表达降低、LC3 蛋白表达水平明显升高(均P<0.01)。结论：miR-124 能够抑制食管癌细胞侵袭及迁移能力,其机制可能与靶向调控自噬相关基因BECN1 的表达影响细胞自噬有关。     

蛋白酶体抑制剂诱导OVCAR3卵巢癌细胞自噬的机制研究

目的:研究蛋白酶体抑制剂诱导OVCAR3卵巢癌细胞的自噬中PI3K通路的作用。方法:MG1 3 2处理OVCAR3细胞后,光镜观察自噬泡的形成。多种蛋白酶体抑制剂处理OVCAR3细胞后,Western blot检测自噬特异性蛋白LC3的变化。PI3K抑制剂(渥曼青霉素与3-MA)联合多种蛋白酶体抑制剂处理OVCAR3细胞,Western blot检测LC3的变化。采用shRNA技术下调OVCAR3细胞的Beclin 1表达,MG132处理细胞,Western blot检测LC3的变化,吖啶橙(AO)染色观察酸性自噬泡的形成。结果:MG132诱导OVCAR3卵巢癌细胞自噬泡形成,多种蛋白酶体抑制剂均可诱导OVCAR3细胞LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化增强。PI3 K抑制剂与蛋白酶体抑制剂联合应用,与单独应用蛋白酶体抑制剂相比,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化无改变。下调Beclin 1表达后,MG132诱导的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化及酸性自噬泡的形成均无改变。结论:蛋白酶体抑制剂诱导OVCAR3卵巢癌细胞发生自噬是不依赖PI3K途径进行的。     

羟喜树碱通过诱导自噬抗宫颈癌的机制研究

目的探讨抗肿瘤药物羟喜树碱(HCPT)对宫颈癌HeLa细胞作用的机制。方法 CCK8检测Hela细胞增殖,Western blot检测自噬和凋亡相关蛋白的表达,GFP-LC3 shRNA转染和Hoechst染色后,荧光显微镜下观察细胞自噬特异小体量的改变以及凋亡形态学的变化。结果 HCPT抑制Hela细胞生长呈浓度依赖性(P<0.05),IC503μmol/L HCPT作用Hela细胞后,自噬相关蛋白Beclin1、p62的表达以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值发生改变,差异有显著性意义(P均<0.05);凋亡相关蛋白Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2表达也发生明显改变(P均<0.05);荧光显微镜下观察Hela细胞带有GFP-LC3的自噬体增加,凋亡细胞也增多(P均<0.05)。结论 HCPT能够诱导HeLa细胞中自噬相关基因Beclin1、p62以及LC3的表达增强,从而激活细胞自噬发生;且HCPT能够激活宫颈癌HeLa细胞发生自噬,进而诱导细胞凋亡来达到抗肿瘤目的。     

自噬对宫颈癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的 观察自噬对宫颈癌细胞增殖迁移能力的影响,并探讨其可能机制。方法 采用不同浓度雷帕霉素诱导人宫颈癌HeLa细胞,吖啶橙染色观察自噬小体的形成,Western blot检测自噬相关基因LC3B以及PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的表达情况,采用RTCA仪器实时检测细胞的增殖能力,Transwell小室检测细胞的迁移能力。应用自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)阻断宫颈癌细胞自噬后,采用RTCA仪器实时检测细胞的增殖能力,Transwell小室检测细胞的迁移能力。构建带有绿色荧光蛋白的LC3B质粒,转入HeLa细胞,通过G418药物筛选转染阳性细胞,荧光显微镜观察LC3B的细胞定位,Western blot检测LC3B表达。RTCA仪器实时检测野生型和LC3B过表达HeLa细胞的增殖能力,Western blot检测PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的表达。结果 雷帕霉素诱导后,宫颈癌HeLa细胞自噬水平增高,增殖和迁移能力有所下降;PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达改变(P＜0.05)。自噬抑制剂3-MA诱导HeLa细胞增殖和迁移水平下降(P＜0.05)。荧光显微镜和Western blot结果显示构建的LC3质粒成功转入Hela细胞中并且能够抑制宫颈癌细胞的增殖(P＜0.05)。结论 在一定范围内,随着自噬水平的升高,HeLa细胞增殖和迁移能力降低,可能是通过PI3K/Akt/mTOR信号通路发挥作用。通过基因靶向扰乱自噬关键基因(如LC3等)而改变宫颈癌细胞自噬水平可能为宫颈癌的治疗带来新策略。     

HIF-1α通过下调TP53INP1促进乳腺癌细胞的迁移及侵袭

目的:探讨HIF-1α通过调节TP53INP1蛋白对乳腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。方法:通过免疫组化检测60例乳腺癌标本中TP53INP1和HIF-1α的表达情况及分析其临床病理资料。通过体外构建HIF-1α及共转染HIF-1α和TP53INP1细胞模型,迁移侵袭实验和划痕实验检测HIF-1α和TP53INP1对乳腺癌细胞迁移侵袭能力的影响;Western blot实验研究共同下调HIF-1α和 TP53INP1对MMP2、VEGF蛋白表达水平的影响。结果:免疫组化实验显示HIF-1α在人乳腺癌组织中高表达,TP53INP1呈低表达,两者之间具有相关性且均与淋巴结转移有关（P＜0.05）。迁移侵袭实验及划痕实验显示在乳腺癌MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞中下调HIF-1α抑制了迁移侵袭及愈合能力,MCF-7细胞中共同转染下调HIF-1α和TP53INP1质粒之后逆转了乳腺癌细胞的迁移侵袭能力及愈合能力（P＜0.05）。Western blot实验显示shHIF-1α和TP53INP1共转染后在MDA-MB-231细胞中MMP2表达水平高于下调HIF-1α表达组。共转染shHIF-1α和shTP53INP1质粒后在MCF-7细胞中,VEGF和MMP2表达高于下调shHIF-1α组（P＜0.05）。结论:HIF-1α可能通过下调TP53INP1的表达促进乳腺癌细胞的迁移侵袭能力。     

褪黑素通过下调HIF-1α表达增强卵巢癌细胞OVCAR3顺铂敏感性

目的:探讨褪黑素对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响及其机制。方法:采用不同浓度褪黑素联合顺铂作用于卵巢癌细胞OVCAR3,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白及信号通路蛋白AKT及ERK的磷酸化,同时检测褪黑素对HIF-1α蛋白表达的影响。结果:MTT结果显示,褪黑素和顺铂联合作用能够显著抑制OVCAR3细胞增殖(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,褪黑素和顺铂联合作用相较于单独顺铂作用或褪黑素作用能够显著增加OVCAR3细胞的凋亡。Western blot结果显示,褪黑素与顺铂联合作用能够增加促凋亡蛋白BAX及Caspase3的表达,抑制抗凋亡蛋白BCL2的表达,检测信号通路结果显示,褪黑素与顺铂联合作用能够促进AKT及ERK的磷酸化,同时褪黑素能够抑制HIF-1α蛋白的表达。结论:褪黑素通过抑制HIF-1α的表达使OVCAR3细胞对顺铂敏感。     

CD147 siRNA对乳腺癌细胞HIF-1α、MMP-2与VEGF表达及细胞凋亡的影响

目的:探讨CD147 siRNA对乳腺癌细胞VEGF、MMP-2和HIF-1αmRNA表达及细胞凋亡的影响。方法:对乳腺癌细胞株MDA-MB-435转染CD147 siRNA真核表达载体,实时定量PCR法及Western blot检测VEGF、MMP-2和HIF-1αmRNA与蛋白表达的变化,流式细胞仪检测细胞的早期凋亡率。结果:转染CD147 siRNA沉默CD147基因后,乳腺癌细胞VEGF、MMP-2和HIF-1α蛋白与mRNA表达均明显下降(P<0.05),而细胞的早期凋亡率则显著增高(3.32%vs 15.21%,P<0.05)。结论:CD147作为一种重要的调控分子,可以下调乳腺癌细胞HIF-1α、MMP-2及VEGF的表达,从而参与了乳腺癌的增殖、转移等过程。     

丙戊酸促进神经母细胞瘤细胞自噬性死亡

目的探讨丙戊酸(VPA)对神经母细胞瘤细胞自噬性死亡的调控。方法用含不同浓度的VPA培养基培养SH-SY5Y细胞,应用MTT法检测细胞的存活率,乳酸脱氢酶(LDH)检测细胞损伤,单丹磺酰尸胺(MDC)染色评价细胞质内酸性自噬泡的形成,Western blotting法检测巨自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值及Beclin-1的表达。结果与对照组比较,VPA孵育48 h后,SH-SY5Y细胞存活率明显降低,且具有剂量依赖性(P<0.05);SH-SY5Y细胞培养基中LDH明显增高,且具有剂量依赖性(P<0.05);VPA诱导细胞内LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值及Beclin-1的表达水平明显上调(P<0.05)。结论 VPA诱导神经母细胞瘤细胞细胞自噬性死亡,为神经母细胞瘤的治疗提供新的手段。