RT－PCR制备人IL－3 cDNA的改进

ＲＴ－ＰＣＲ制备人ＩＬ－３ｃＤＮＡ的改进Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｉｎｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｈ－ＩＬ－３ｃＤＮＡｂｙＲＴ－ＰＣＲ￥／／陈鸿书，曹廷兵，姚家慧，陈嵩（重庆第三军医大学基础部基因工程实验室）重庆，６３００３８人白细胞介素－３（ｈ－Ｉ...     

RT—PCR法制备NGFcDNA

本研究直接以新生１８￣２１天龄的小鼠脑的全ＲＮＡ（含ＮＧＦｍＲＮＡ）为底物，进行逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），制备出了神经生长因子（ＮＧＦ）的ｃＤＮＡ片段。用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测序分析表明，所制备的ＮＧＦ ｃＤＮＡ片断为３６３ｂｐ，与编码成熟ＮＧＦ的ｍＲＮＡ碱基顺序相对应。直接利用全ＲＮＡ进行ＲＴ与ＰＣＲ一步联合反应，不仅简化了实验步骤，而且最大程度地减少了样品的需要量，减小了样品     

应用RT—PCR技术克隆人白细胞介素6的cDNA

0引言人白细胞介素6（11。－6）是一种由212个氨基酸组成的多功能细胞因子「‘’，我们应用反转录一聚合酶链反应（RT－P（二）的方法，成功地从人Hel。a细胞中克隆了11。－6的CDNA，为后续的表达奠定了基础．l材料和方法1．l材料人Hel。a细胞系购自中科院细胞生物所；pUC19及JM103为本实验室保存；Taq聚合酶、AMV反转录酶、T4ljNA连接酶及MagicPCR纯化试剂盒为Promega产品；重组a干扰素和DMEM培养基为GIBCO产品；内切酶为华美公司产品；PCRdl物PI：5’CGGAATTCATGC－CAGlxACCCCCAGGAG3’pZ：5’（7G（iGATCC…     

人B7.2cDNA的克隆及其核表达

为克隆人Ｂ７．２ｃＤＮＡ，构建Ｂ７．２真核表达质粒，并在哺乳动物细胞中表达。分离正常人淋巴结淋巴细胞，经ＬＰＳ诱导后，以ＲＴ－ＰＣＲ，克隆Ｂ７．２ｃＤＮＡ；构建真核表达质粒ｐＢＣＭＧＳＮｅｏ－Ｂ７．２，转染哺乳细胞，进行表达。结果成功克隆了Ｂ７．２ｃＤＮＡ，并经测序证实：所构建的Ｂ７．２抗原真核表达质粒可在哺乳动物细胞中高效表达。表明经ＬＰＳ诱导的人淋巴细胞可表达Ｂ７．２ｍＲＮＡ，所建立的ｐＢＣＭ     

RT—PCR方法检测病毒性心肌炎病原体

应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），对１０４０例疑似病毒性心肌炎患者的静脉血进行检测，共检出各种病毒感染者６１２例（５８．８４％）。其中检出感染柯萨奇病毒３８０例（６２．０９％），埃可病毒１２９例（２１．０７％），柯萨奇与埃可病毒合并感染８２例（１３．３０％），脊髓灰质炎病毒２１例（３．４３％）。结果表明，柯萨奇病毒的检出高于其它种病毒（Ｐ〈０．０５）。心电图有异常改变的占２０％，主要是ＳＴ段     

荧光定量RT—PCR快速检测A、B型流感病毒的研究

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测A、B型流感病毒的方法。方法根据A型流感M基因和B型流感HA基因的相对保守序列,分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化单一和双重反应体系后,利用10倍稀释法对已知滴度的流感病毒进行梯度稀释,检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线。结果A、B型流感病毒双重反应的灵敏度为分别为2·56×10-5和5·0×10-5TCID50,标准曲线相关系数分别为0·997和0·998,扩增效率分别为114·1%和107·8%,说明双重反应中A、B型的引物、探针、模板之间无相互干扰,具有很好的稳定性和重现性。结论研究建立的荧光定量RT-PCR技术可以准确同时检测A、B型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。     

庚型肝炎病毒的RT—PCR法检测

根据国外报道的庚型肝炎病毒基因组序列设计两对５’非编码区引物，用ＲＴ－ＰＣＲ法检测了２４例丙型肝炎和１０例透析病人血清静 标本。结果丙型肝炎病人透析病人各１例检出ＨＧＶ ＲＮＡ，占总受检例数的５．８８％。本研究说明了ＨＧＶ在我国的存在，提示开展ＨＧＶ相关研究的必要性。     

巢式RT—PCR检测肝癌患者外周血微量转移癌细胞

目的建立肝癌患者外周血微转移癌细胞的分子检测方法.方法从肝癌患者外周血中分离有核细胞,用TRzol提取RNA,特异引物扩增AFPmRNA,凝胶电泳观察结果.分析AFPmRNA扩增结果与患者临床指标的关系.结果肝癌患者外周血有核细胞RNA提取成功率为100%,33例肝癌患者AFPmRNA阳性率为69%(23/33),临床肝内门静脉癌栓、肝外转移患者AFP'mRNA扩增阳性率为100%,临床无转移患者AFPmRNA阳性率为56%(15/27),P＜0.05,AFPmRNA阳性患者的肿块最大径平均为10.67,AFP＞400μg/L者占40%(8/20),AFP'mRNA阴性患者肿块最大径平均为7.13cm,AFP＞400μg/L者占10%(1/10).结论巢式RT-PCR是检测肝癌患者外周血微转移癌细胞的稳定方法.     

半定量RT-PCR检测少量兔血管内皮细胞中特异mRNA的表达

目的：半定量检测体外培养的少量兔血管内皮细胞中特异ｍＲＮＡ的表达。方法：用Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ公司的快速微量ｍＲＮＡ提纯试剂盒从兔内皮细胞中直接提取出ｍＲＮＡ,并以此为模板,用半定量ＲＴ－ＰＣＲ技术检测培养的兔血管内皮细胞中内皮素（ＥＴ－１）ｍＲＮＡ的相对含量。结果：从１０＾５个兔血管内皮细胞中提取出未降解的ｍＲＮＡ,Ａ２６０／Ａ２８０〉１．８;用半定量ＲＴ－ＰＣＲ技术,测定出ＥＴ－     

CFL2基因半定量多重RT-PCR检测方法的建立

目的在CFL2基因功能的研究中,建立一种能检测CFL2基因mRNA表达水平的半定量多重RT-PCR体系。方法细胞总RNA经反转录合成cDNA,以GAPDH为内参与CFL2进行同管扩增,以常规PCR体系为参照对退火温度、Mg-（2＋）、dNTP和循环数等参数进行优化并与常规组比较,建立了检测C2C12细胞CFL2基因半定量多重RT—PCR体系。结果CFL2和GAPDH的cDNA同时PCR扩增后电泳条带清晰,与预期产物大小一致,两对引物间无明显竞争,其扩增效率和特异性与单一基因的RT—PCR体系相同。结论成功建立CFL2基因半定量多重RT—PCR方法,有利于半定量检测CFL2 mRNA表达变化。     

聚丙烯酰胺凝胶银染技术在半定量RT-PCR中的应用

目的:探讨聚丙烯酰胺凝胶银染技术在半定量RT-PCR中的应用.方法:提取正常组大鼠和链脲佐菌素致糖尿病模型组大鼠心肌组织总RNA,逆转录得到cDNA第一链,以此为模板进行PCR扩增,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和DNA银染技术分析不同循环数及模板量与PCR产物量间的关系.结果:PCR扩增反应在第20～25个循环,起始模板量为0.8～2.4μg时,PCR产物量与起始模板量呈现较好的线性关系.结论:通过控制起始模板量,减少PCR循环数使目的基因的扩增处于PCR扩增指数期,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和DM银染技术,可以通过比较PCR扩增产物量的变化以分析目的基因表达水平的差异.     

肝细胞癌组织芯片环氧合酶-2表达的半定量图像分析

目的 分析环氧合酶-2(COX-2)在肝细胞癌(HCC)中的表达及意义. 方法 应用改良的手工制备组织芯片方法制备含150例肝细胞癌、92例癌旁肝硬化、45例癌旁慢性肝炎以及37例肝内转移灶和13例正常肝组织的组织芯片,结合免疫组织化学染色和图像分析技术检测COX-2蛋白的相对表达量. 结果 COX-2蛋白在HCC表达显著低于癌旁肝硬化、癌旁慢性肝炎(P<0.01),但高于正常肝组织(P<0.05),差别具有统计学意义.在HCC组织中,低分化HCC的COX-2表达量显著低于高分化的HCC,差别有统计学意义(P<0.01).COX-2蛋白的表达与性别、肿瘤大小、组织学类型、包膜侵犯及转移均无关(P>0.05). 结论 COX-2在HCC的发生中发挥重要作用,并与HCC的分化程度密切相关,但与HCC进展及侵袭转移关系不大.     

竞争性RT-PCR在基因表达定量分析中的应用

目的用竞争性RT-PCR测定鼠脑Goα mRNA水平. 方法通过RT-PCR制备内标和外标,将等量内标和倍比稀释的外标作竞争性共扩增,得到标准曲线.然后将等量内标与cDNA标本共扩增,通过标准曲线求出标本中靶序列的水平. 结果内标和外标在共扩增反应中表现出明显的竞争性.一鼠脑标本Goα mRNA的测定结果为17.62amol/μg总RNA. 结论竞争性RT-PCR是一种简便、快速、灵敏的测定基因表达(mRNA)水平的方法.     

竞争性RT-PCR在基因表达定量分析中的应用

目的 用竞争性ＲＴ－ＰＣＲ测定鼠脑ＧｏαｍＲＮＡ水平。方法 通过ＲＴ－ＰＣＲ制备内标和外标，将等最内标和倍比稀释的外标作竞争性共扩增，得到标准曲线。然后将等最内标与ｃＤＮＡ标本共扩增，通过标准曲线求出标本中靶序列的水平。结果 内标和外标在共扩增反应中表现出明显的竞争性。一鼠脑标本ＧｏαｍＲＮＡ的测定结果为１７．６２ａｍｏｌ／μｇ总ＲＮＡ。结论 竞争性ＲＴ－ＰＣＲ是一种简便、快速、灵敏的测定基因表达     

外周淋巴细胞FMR－1mRNA的检测

采用逆转录ＰＣＲ技术检测了人外周淋巴细胞ＦＭＲ－１ｍＲＮＡ表达。对１０名在临床筛查中被认为可能患有脆性Ｘ综合征的男性学生进行了检测，其中２例可疑男性样品中未检测出ＦＭＲ－１ｍＲＮＡ表达。ＤＮＡ印迹杂交和异常甲基化ＰＣＲ检测证实这２例患者同时伴有ＦＭＲ－１基因５＇ＣｐＧ岛异常甲基化和（ＣＧＧ）ｎ扩展。上述方法的建立为诊断脆性Ｘ综合征提供了一种新的分子生物学手段，并可用于ＦＭＲ－１基因表达研究。     

应用RT-PCR分析食管癌组织中lrig1基因的表达

目的：观察lrigl基因在食管鳞癌中的表达及意义．方法：采用RT．PCR检测36例食管鳞状细胞癌癌组织、相应的癌旁组织和远癌组织中lriglmRNA的表达情况．PCR产物经凝胶电泳，比较3种组织中ragl与GAPDH条带的灰度值之比，半定量分析IriglmRNA的表达水平．结果：36例食管癌组织中有15例（42％）lriglmRNA检测到阳性表达，21例（58％）lriglmRNA表达缺失，其阳性表达率低于相应的癌旁组织（92％）和远癌组织（100．0％，P〈0．05）；癌组织中lriglmRNA表达水平（0．76±0．22）低于相应的癌旁组织（0．89±0．33）和远癌组织（1．13±0．40）；随着肿瘤分化程度的升高，lriglmRNA在癌组织中的阳性表达率也增加（P〈0．05），但lriglmRNA表达缺失与食管癌临床分期（TNM），淋巴结有无转移和病理类型均无统计学差异（P〉0．05）．结论：lriglmRNA在食管癌组织中存在表达缺失和低表达，提示Irigl基因在食管癌的发生发展中可能具有抑癌基因的作用．     

由肝肾相关理论探讨高血压病

高血压病是最常见的心血管疾病,当属中医的"眩晕""头痛""中风"等范畴,发病与肝肾有密切关系。中医对高血压病的认识多由肝肾相关理论进行阐述,该文具体从肝肾的病理改变以及肝肾阴阳失调对高血压病的病因病机进行探讨,为临床治疗高血压病提供理论依据。     

HMGB1和相关炎症因子在小鼠肝纤维化模型中的表达及意义

目的:探讨HMGB1、IL-6及TNF-α在CCL4导致的小鼠肝纤维化模型中的表达及意义.方法:昆明种雄性小鼠30只,采用CCL4灌胃法制备肝纤维化模型组(1 μL/g CCL4油溶液灌胃,1次/5 d),另设正常对照组10只,(1 μL/g生理盐水灌胃,1次/5 d).在建模2周、4周、6周后留取血清及肝组织,ELISA法检测血清中透明质酸(HA)、Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ)、Ⅲ型前胶原蛋白(PⅢP)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)的含量;Western blot法检测肝组织HMGB1的表达水平.结果:ELISA结果显示正常对照组血清HA、Col-Ⅰ、PⅢP和IL-6、TNF-α含量较少;正常组与模型组2周组、2周组与4周组、4周组与6周模型组血清HA、Col-Ⅰ、PⅢP和IL-6、TNF-α含量均较前组明显增加(P<0.05).Western-blot结果显示正常对照组肝组织内无HMGB1表达,肝纤维化2周、4周、6周模型组与正常对照组比较,肝组织中HMGB1的表达明显增加,而且随着CCL4损伤时间的延长而逐渐升高(P<0.05).结论:血清HMGB1和相关炎症因子IL-6、TNF-α的表达在CCL4导致的小鼠肝纤维化动物模型中明显增高.