噬菌体抗体库的筛选策略及其进展

噬菌体抗体库技术的出现开创了一条简便快捷的基因工程抗体生产路线,为人源抗体的制备提供了新途径.随着现代分子生物技术的迅速发展,抗体库的筛选工作也在传统的亲和淘选的基础上不断改进,涌现出越来越多新的有效筛选方法,显示出噬菌体抗体库技术在抗体开发应用中极为广阔的前景.     

噬菌体抗体库的筛选策略及其进展

噬菌体抗体库技术的出现开创了一条简便快捷的基因工程抗体生产路线,为人源抗体的制备提供了新途径.随着现代分子生物技术的迅速发展,抗体库的筛选工作也在传统的亲和淘选的基础上不断改进,涌现出越来越多新的有效筛选方法,显示出噬菌体抗体库技术在抗体开发应用中极为广阔的前景.     

抗内毒素噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建一个鼠源性的抗内毒素单链噬菌体抗体库,从中筛选出对内毒素具有较高亲和力的单链抗体。方法从小鼠脾细胞中提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增出小鼠抗体重链、轻链可变区基因（VH,VL）,用Linker将VH,VL交联形成单链抗体可变区片段（ScFv）。经NotⅠ,SfiⅠ双酶切后与经同样双酶切的pCANTAB5E载体相连,转化入大肠杆菌TG1以构建鼠抗内毒素单链噬菌体抗体库。在援救噬菌体抗体库后,用内毒素淘筛特异性的ScFv,富集的噬菌体阳性克隆重新感染TG1。在96孔板分别援救单个含特异性ScFv的TG1菌落,最后随机挑选出190个菌落经ELISA检测抗内毒素ScFv。结果小鼠血清中抗内毒素的效价为1∶12800。提取的总RNA浓度为12.3813μg/ml,纯度较好。扩增出的VH长约340bp,VL约320bp,ScFv约800bp。转化入TG1后有约1.9×107个菌落。淘筛一轮过后即有3×104阳性菌落长出,190个菌落经ELISA检测有2个阳性克隆。结论成功地构建了一个库容量为1.9×107的鼠抗内毒素单链噬菌体抗体库,并从中筛选出了2株抗内毒素ScFv。     

用不同方法从大容量噬菌体抗体库中筛选抗完整食管癌细胞的单链抗体

目的:初步探索从天然的单链大容量噬菌体抗体库中筛选肿瘤细胞抗体的技术策略.方法:通过两种方法,即2%多聚甲醛固定细胞筛选法(PF)及活细胞直接筛选法(NF),经过4轮"吸附-洗脱-扩增"的淘筛过程,对食管癌KYSE-170细胞进行筛选,得到抗食管癌细胞的噬菌体抗体,完善了噬菌体抗体库筛选完整细胞的特异性抗体的技术策略.并且进一步制备了其可溶性抗体.结果:活细胞NF组的筛选阳性率高于2%多聚甲醛固定PF组,筛选特异性抗体的阳性率分别为25.00%和12.50%,两组的差异具有统计学意义.结论:利用单链大容量抗体库可以采用不同的筛选方法成功制备与肿瘤细胞结合的噬菌体抗体,为今后的研究和应用奠定基础.     

噬菌体抗体库的构建及抗肿瘤单抗的筛选

鼠源抗肿瘤单抗通常用杂交瘤技术制备。作者首次尝试以噬菌体抗体库技术替代杂交瘤方法制备抗肿瘤鼠单抗。以ＲＴ－ＰＣＲ方法直接从免疫Ｂａ１Ｂ／ｃ小鼠脾脏淋巴细胞扩增出全套免疫球蛋白重链Ｆｄ段及轻链基因，克隆到原核表达载体并将抗体片断Ｆａｂ表达于线状噬菌体表面，构建了噬菌体抗体库（１．０×１０￣７）。以人乳腺癌细胞系Ｂｃａｐ３７活细胞为靶抗原对噬菌体抗体库进行的４轮亲和筛选显示了噬菌体抗体的特异性富集。从第４轮筛选后选取１８２个克隆进行ＥＬＩＳＡ检测发现１７４个具有与肿瘤细胞结合活性。用１２种人肿瘤细胞系及人淋巴细胞和成纤维细胞对所获克隆进行了进一步鉴定。我们所应用的方法为抗肿瘤单抗的制备提供了一条更为有效的新途径。     

全人源食管癌噬菌体单链抗体库的筛选及特异性鉴定

目的：我们应用噬菌体抗体库技术构建了食管癌相关的人源单链抗体文库，本文目的在于对该抗体库进行鉴定，筛选食管癌抗体，同时对抗体的活性进行检测。方法：PCR鉴定TG1中食管癌单链抗体scFv的插入率；1．5％琼脂糖凝胶电泳鉴定Sfi I和NotI双酶切质粒的结果；先以人正常食管上皮细胞吸附后再以食管癌细胞Eca109为抗原对所建抗体库进行4轮的亲和筛选；将阳性重组噬菌体克隆感染Ecoli HB2151进行可溶性抗体表达及经亲和柱层析纯化；用SDS—PAGE测定该抗体的相对分子量；用Western blot鉴定该抗体；用ELISA法、免疫组化法鉴定该抗体与人食管癌细胞的结合的特异性。结果：seFv基因插入率为91．7％；酶切后检测到目的基因片段。在亲和筛选过程中，食管癌噬菌体单链抗体得到富集，收获率逐轮得到提高，第4轮为第1轮的141倍；SDS—PAGE与Western blot结果显示抗体的相对分子量为左右和30kd条带染色；在Ecoli HB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。免疫组织化学结果提示可溶性抗体仅染食管癌组织，而肝癌组织和胃癌组织不染色。免疫细胞化学结果表明此可溶性抗体可使Eca109细胞染色。ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的免疫活性，能与Eca109细胞结合，而不与胃癌BGC-823和NHEEC结合。结论：利用噬菌体抗体库技术的阴性、阳性筛选得到了食管癌噬菌体单链抗体，且筛选后的抗体片段与人食管癌细胞有特异性的结合活性。     

用噬菌体抗体库技术筛选单克隆抗体

用噬菌体抗体库技术制备单克隆抗体是近年来抗体技术中的革命性进展，本文简要介绍了我们在这方面所进行的研究工作：从乳癌细胞免疫后的小鼠脾脏细胞和接种过HBsAg疫苗的志愿者的外周血淋巴细胞扩增出k链和Fd段基因，组装到Fab段噬菌体抗体表达载体pCOMB3中,分别建立了鼠源性和人源性噬菌体抗体库，以固相化的HBsAg和乳癌细胞为抗原．通过“吸附-洗脱-扩增”富集性筛选过程获得了鼠抗人乳癌细胞和人抗HBsAg的噬菌体抗体，并通过对表达载体的改造，在大肠杆菌表达出了可溶性的Fab段,对所获得的抗体Fab段进行了特异性、亲和力以及DNA序列的分析，显示噬菌体抗体库技术是一个行之有效的抗体制备手段。     

抗γ-精浆蛋白人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库的构建及导向筛选

目的:建立人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库,筛选抗γ-精浆蛋白(γ-sm)人源性抗体轻链。方法:PCR扩增前列腺癌患者外周血淋巴细胞人抗体全套轻链基因,克隆人含鼠源抗γ-sm抗体Fd基因的pComb3X噬粒中,建立人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库。通过稀释滴定、限制性酶切等分别对库容、基因重组率和多样性进行鉴定。以M13K07辅助噬菌体超感染,利用纯化的γ-sm对杂合库进行筛选,对筛出的阳性克隆进行功能检测。结果:构建了库容量为1．2×107CFU、重组率为90％、多样性好的人-鼠杂合噬菌体抗体库。ELISA检测出2个强阳性克隆,Western blot确证为抗γ--sm的人-鼠杂合Fab,竞争ELISA显示其表观亲和力约为亲本鼠抗体亲和力的71．8％。DNA测序显示筛到的人源轻链可变区基因属IGKV4-1*01胚系家族。结论:成功得到人源性抗γ-sm抗体轻链,为进一步获得全人源化抗体奠定了基础。     

抗前列腺癌细胞特异抗体库的构建及特异结合抗体的筛选

目的: 获得前列腺癌的噬菌体呈现型单链抗体库,筛选与前列腺癌特异结合的抗体,为前列腺癌的诊断和治疗奠定基础. 方法: 用两种恶性程度较高的前列腺癌细胞PC3,DU145膜蛋白混合物免疫Balb/c小鼠.取脾脏提取总RNA,用RT-PCR分别扩增抗体重、轻链可变区基因(VH和VL), 经Linker连接形成ScFv基因片段,将ScFv基因片段与噬菌粒载体pCANTAB 5E的连接产物转化大肠杆菌TG1.用辅助噬菌体M13KO7进行超感染,获得重组噬菌体抗体.以恶性程度低的前列腺癌细胞LNCap为对照,用PC3细胞对重组噬菌体抗体库进行五轮筛选后,随机挑取克隆,经phage-ELISA筛选特异性结合PC3细胞的ScFv.结果: 用所构建的库容量为3.5×106的单链抗体库筛选特异结合抗体,得到一个与PC3细胞特异结合的噬菌体-单链抗体.结论: 本研究所构建的抗体库中可筛选到与前列腺癌细胞结合特异性较好的抗体,可用于前列腺癌的诊断和治疗中.     

噬菌体抗体库筛选技术及在肿瘤研究中的应用

噬菌体抗体是指表达在噬菌体表面的抗体分子Fab或SCFV，这些分子的群体称为抗体库。经特定抗原或细胞筛选后可以获得针对该抗原或细胞表面标志物的特异性抗体。经典的筛选方法为固相或液相抗原识别，前提条件是能得到抗原纯品，对于抗原无法提纯或抗原性质不确定的情况则不能适用，所以又出现全细胞筛选，直接利用肿瘤细胞或组织细胞进行筛选，无需纯抗原，但目标抗原一定要有较高的表达水平，对于表达较低的情况，一种策略是先利用正常细胞筛选，去掉无关抗原后，再利用肿瘤细胞筛选；另一种策略是细胞内化筛选，特异性抗体被内化入细胞，然后用酸性洗脱液洗脱掉细胞膜上非特异结合的噬菌体抗体后裂解细胞，获得特异性抗体。其余筛选方法还有切片组织筛选、体内筛选等，适用面较窄，未获推广。筛选效率主要通过以下几项的检测：转化数，即被感染的噬菌体数，它随筛选轮数的增加而增加；抗体基因插入栽体的频率，高比例的丢失意味着筛选的低效率；抗体亲和性。抗体库技术避免了杂交瘤技术中的许多难点，如细胞融合、动物免疫等，目前该技术已逐渐在肿瘤诊断和肿瘤治疗中发挥重要作用，     

应用噬菌体随机肽库筛选肿瘤MUC1/Y黏蛋白结合肽

目的：探索用噬菌体随机肽库筛选可用于肿瘤导向治疗的新型小分子载体。方法：以MUC1/Y黏蛋白的胞外段蛋白（MUC1/Yex）为靶分子,用凝胶亲和法和酶联板法分别筛选十二肽噬菌体随机肽库,ELISA鉴定阳性克隆,DNA序列测定后确定MUC1/Yex结合肽的氢基酸序列;免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆及正常及肿瘤细胞的结合能力及特异 性。结果：通过4轮筛选,共获得3种MUC1/Yex的结合肽,分别为HHWHSRSQLSWF,HLKHKNYLPPTP和GNWYRHPHYLQP,其中HXXHS表位可能在与MU1/Yex的结合中起重要作用。阳性噬菌体克隆可与肿瘤细胞系MCF7,OVCA3,而不与正常外周血淋巴细胞结合。结论：筛选获得的MUC1/Yex结合肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性,可进一步用于肿瘤导向治疗的研究。     

胃癌相关的人源单链抗体基因文库的构建

目的　构建胃癌相关的人源单链抗体基因文库。方法　应用DNA重组技术 ,从胃癌患者的转移淋巴结及其脾细胞mRNA中构建出组合单链抗体 (ScFv)cDNA文库。将cDNA文库克隆到噬菌粒载体 pCANTAB5 ,并转化大肠杆菌TG 1。随机对所得细菌克隆进行序列分析。结果　cDNA文库克隆到噬菌粒载体pCANTAB5后转化大肠杆菌TG 1,得到 2 .5× 10 7个氨苄青霉素菌落。ScFv序列分析结果证实VH 属于人源抗体VHⅢ亚群 ,VL 属于VκⅢ亚群。结论　胃癌相关的人源单链抗体基因文库的构建为进一步构建噬菌体单链抗体库奠定了基础     

胃癌细胞特异性结合肽的筛选及鉴定

目的 筛选与胃癌细胞特异性结合的多肽。方法 以正常细胞为吸附细胞,胃癌细胞为筛选靶细胞对噬菌体随机12肽库进行消减筛,用细胞酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫细胞和组织化学法及裸鼠正常组织结合实验鉴定阳性克隆并进行DNA测序。结果 经三轮筛选,利用ELISA从随机挑选的24个噬菌体克隆中得到8个与胃癌细胞具有高结合力的噬菌体阳性克隆,经免疫细胞化学及裸鼠正常组织结合试验鉴定,发现第20、24两个克隆能与胃癌细胞特异性结合,而不与正常细胞和裸鼠组织结合,噬菌体阳性克隆氨基酸序列无同源性。结论 得到两个序列不同的特异性结合胃癌细胞的噬菌体克隆,这可为进一步的研究提供实验依据。     

Phage Display Cloning and Characterization of Monoclonal Antibody Genes and Recombinant Fab Fragment against the CD98 Oncoprotein

The Fab gene of anti-CD98 heavy chain (h.c.) monoclonal antibody (mAb) HBJ127 was cloned and expressed as a recombinant Fab (rFab) fragment by means of a phage display system. The variable heavy and light chain genes of HBJ127 were found to be derived from VOx-1 and IgVk8-30 germline, respectively. Extensive somatic mutation was found in the heavy chain complementarity determining region 2. rFab fragment was purified homogeneously from crude bacterial lysates by Ni-chelate chromatography in a yield of 71.4 μg from 100 ml of culture. rFab fragment was reactive with the cell surface of CD98-positive cells irrespective of tissues of origin, but not with CD98-neg-ative cells. The recognition site of the rFab fragment was identical to that of mAb since the binding of rFab fragment to HeLaS₃cells was completely inhibited by pretreatment with an excess of mAb. The relative affinity values of rFab fragment and mAb were found to be 0.11x10⁸ and 0.35X10⁸ M ^-1, respectively. Three-fold lower affinity of rFab fragment may be due to the difference of valency of the antibody preparation. Cell growth inhibition in vitro by rFab fragment preincubated with anti-Fab suggests that the rFab fragment produced by cloned gene-bearing Escherichia coli was identical to the Fab part of HBJ127 mAb. These results show that a small fragment with antigen binding activity similar to that of the parent mAb can easily be prepared by using a phage display system. To our knowledge, this is a first report of the production of anti-CD98 h.c. rFab fragment.     

抗CD20单克隆抗体治疗非霍奇金淋巴瘤的研究进展

非霍奇金淋巴瘤(NHL)是临床常见的造血系统恶性肿瘤,是威胁人类生命的10大恶性肿瘤之一.大多数NHL起源于B淋巴细胞,95% 以上的B细胞NHL表达CD20抗原.NHL对标准的治疗,包括放疗和化疗敏感,有效率高,但复发率也高.     

采用抗体库技术筛选抑制肺癌的功能性抗体

 目的 研制抑制肺癌细胞功能性单抗,为治疗肺癌提供靶向治疗剂,并为分离获得肺癌相关的分子靶标打下基础。方法 从新鲜人肺癌组织分离肿瘤细胞免疫Balb/c小鼠,免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后接种于甲基纤维素,制备大容量功能性抗体库。采用活细胞荧光、ELISA、免疫组化、肿瘤增殖、侵袭、黏附、动物体内治疗实验等方法筛选鉴定抑制肿瘤细胞的功能性单抗。结果 本次融合共获得了1573株杂交瘤克隆,在能与肺癌细胞膜反应的314株克隆中,154株与正常肺组织不反应或低反应。功能性筛选发现41株单抗显著地抑制肺癌细胞增殖,24株能抑制肺癌细胞对Matrigel的侵袭,15株能抑制肺癌细胞与CollagenI的黏附,进一步实验验证了2株单抗能在体内抑制肺癌移植瘤的生长。结论 采用大容量功能性抗体库技术成功获得了多株具有抑制肺癌细胞恶性生物学行为的功能性单抗,其中2株可能具有靶向治疗肺癌的应用潜力。     

Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library

Background: Gastric cancer is the second most common cancer among the malign cancer types. Inefficiency oftraditional techniques both in diagnosis and therapy of the disease makes the development of alternative and noveltechniques indispensable. As an alternative to traditional methods, tumor specific targeting small peptides can be usedto increase the efficiency of the treatment and reduce the side effects related to traditional techniques. The aim of thisstudy is screening and identification of individual peptides specifically targeted to human gastric cancer cells usinga phage-displayed peptide library and designing specific peptide sequences by using experimentally-eluted peptidesequences. Methods: Here, MKN-45 human gastric cancer cells and HFE-145 human normal gastric epithelial cellswere used as the target and control cells, respectively. 5 rounds of biopannning with a phage display 12-peptide librarywere applied following subtraction biopanning with HFE-145 control cells. The selected phage clones were establishedby enzyme-linked immunosorbent assay and immunofluorescence detection. We first obtain random phage clonesafter five biopanning rounds, determine the binding levels of each individual clone. Then, we analyze the frequenciesof each amino acid in best binding clones to determine positively overexpressed amino acids for designing novelpeptide sequences. Results: DE532 (VETSQYFRGTLS) phage clone was screened positive, showing specific bindingon MKN-45 gastric cancer cells. DE-Obs (HNDLFPSWYHNY) peptide, which was designed by using amino acidfrequencies of experimentally selected peptides in the 5th round of biopanning, showed specific binding in MKN-45cells. Conclusion: Selection and characterization of individual clones may give us specifically binding peptides, butmore importantly, data extracted from eluted phage clones may be used to design theoretical peptides with betterbinding properties than even experimentally selected ones. Both peptides, experimental and designed, may be potentialcandidates to be developed as useful diagnostic or therapeutic ligand molecules in gastric cancer research.