多重PCR法检测结核分枝杆菌耐药基因研究

目的:建立多重PCR法快速检测结核分枝杆菌耐药基因。方法:采用多重聚合酶链反应(PCR)同时扩增46株结核分枝杆菌临床分离株、48株北京标准菌株、40例耐药及40例非耐药的结核分枝杆菌临床分离菌株的inhA、katG、rpoB、IS1081等基因并采用测序的方法进行验证。结果:所有耐药样本基因(包括利福平、异烟肼耐药基因)及野生型菌株均被成功扩增。结论:应用多重PCR技术可同时快速检测结核分枝杆菌耐药基因。     

RD105基因缺失法和双重PCR法对125株结核分枝杆菌菌株基因分型检测

目的 为明确比较RD105基因缺失法和双重PCR法对辽宁地区结核分枝杆菌中北京家族菌株的检测能力，同时掌握辽宁地区结核杆菌中北京家族菌株的流行情况而进行该项研究。方法 选取2011—2013年间辽宁省内各地市临床分离菌株，随机抽取经传统方法菌种鉴定为结核分枝杆菌的菌株，共计125株。选用超声破碎法提取菌株DNA，应用RD105基因缺失法和双重PCR法，同时对收集到的125株结核分枝杆菌进行特异性扩增，最后使用琼脂糖凝胶水平电泳对扩增的结果进行判断。结果 两种方法判断标准为：RD105基因缺失法结果中，出现283 bp大小片段的为北京家族菌株，不出现特异性条带的为非北京家族菌株；双重PCR法结果中，只出现393 bp大小片段的为北京家族菌株，而只出现570 bp大小片段为非北京家族菌株。使用上述两种方法鉴定本研究的125株结核分枝杆菌，结果完全相同，其中北京家族菌株有110株（88%），非北京家族菌株有15株（12%）。结论 RD105基因缺失法和双重PCR法对辽宁地区结核分枝杆菌中北京家族菌株的检测能力相当，并且北京家族菌株在辽宁地区流行的结核分枝杆菌中为绝对优势株；两种方法相对于传统的Spoligotyping法更简单、更省时，检测成本也较低，更适合在我国多数实验室推广应用。     

随机扩增DNA指纹分型分析耐利福平结核分支杆菌的传播

目的 对临床分离菌株进行鉴定,分析耐利福平结核分支杆菌是人群中传播。方法 采用一对随机引物（P15′－CCGGGGCGGTTC,P2,5′－CCGCCGACCGAC）,对从重庆地区肺结核病人痰标本中分离到的100株耐利福平结核发支杆菌的DNA进行随机PCR扩增,根据扩增产物的DNA电泳指纹进行分型。结果 100株耐利福平结核分枝杆菌的DNA指纹可分为6种类型,以Ⅱ、Ⅰ和Ⅲ型为主,它们分别占40％、31％和25％;这3型菌株有1／4是从初治结核病人的痰标本中分离,而地20－39岁年龄段则有1／3是从初治结核病人的痰标本中分离。结论 随机护增DNA指纹是一种简便、敏感、重复性好的菌株分型方法,可用于耐药性结核病流行监测。重庆地区结核病的流行很可能与耐利福平结核分支杆菌的传播有关。     

肺结核暴发流行的指纹鉴定及临床意义

目的了解结核菌的分子流行病学特征。方法采用随机引物PCR扩增方法（RAPD）对两组6例暴发流行的肺结核患者的痰结核分支杆菌DNA进行了指纹多态性分析。结果6株病原菌均为结核分支杆菌。经RAPD分析，其中例1和例2菌株的DNA指纹图谱完全相同，例3-例6菌株的DNA指纹图谱有所不同。证明例1和例2所染病原菌的同源性很好，很可能为同一感染源，母女间交叉感染的可能性很大；例3-例6病原菌的同源性较差，为非交叉感染。结论RAPD方法可获得较好的DNA指纹多态图谱。是一种简便、实用且相对比较便宜的DNA指纹技术，适于临床实验室进行分支杆菌的分子流行病学调查。     

PCR方法鉴定结核分枝杆菌临床分离株

目的:用3对引物PCR扩增的方法对结核分枝杆菌临床分离株进行菌种鉴定.方法:将3对特征性的结核分枝杆菌标记基因:MPT40基因、α抗原基因和IS6100插入序列,分别放入PCR体系中,在各自的退火温度下进行PCR扩增,通过对扩增产物的不同带型进行分析,对结核分枝杆菌临床分离株进行菌种鉴定.结果:用3对引物PCR扩增的方法可将各种类型的结核分枝杆菌以及结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌鉴别开.结论:3对引物PCR扩增的方法是一种有效的结核分枝杆菌菌种鉴定的方法,可用于结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌以及各种类型的结核分枝杆菌的区分.     

非结核分枝杆菌荧光定量PCR检测和分子流行病学研究

目的探讨非结核分枝杆菌(NTM)荧光定量PCR检测技术及我院NTM分子流行病学现状,以便更好地检测和防治非结核分枝杆菌在医院内的感染。方法用常规确诊的方法收集来自我院环境和临床住院病人的标本,并分离菌株,然后用荧光定量PCR检测技术鉴定菌株,并对菌株进行基因测序。结果86株非结核分枝杆菌荧光定量PCR检测结果与细菌培养鉴定及涂片检查所得结果完全符合,44株来自临床住院病人的NTM中有37株与42株来自环境分离株其中的7株基因测序高度相符。结论应用荧光定量PCR方法对非结核分枝杆菌进行鉴定,结果快速、准确、可靠,为临床非结核分枝杆菌病的快速诊断提供了有效的手段,对菌株进行基因测序可确定其克隆同源性,为分子流行病学研究提供可靠数据,具有很好的临床应用价值。     

应用重复序列PCR技术对嗜麦芽窄食单胞菌进行基因分型

目的：建立一种快速、简便、准确的基因分型方法，对嗜麦芽窄食单胞菌的感染进行流行病学调查，确定基因型与耐药模式之间的相关性。方法：选用肠杆菌科基因重复序列（ERIC）为引物进行PCR扩增，对14株嗜麦芽窄食单胞菌进行基因分型研究，并与其抗生素耐药结果进行比较。结果：14株嗜麦芽窄食单胞菌呈现9种耐药模式，其中13株菌表现为5种基因型。表明嗜麦芽窄食单胞菌的耐药模式和基因型之间无明确的相关性。结论：ERIC—PCR应用简便易行，重复性好，适合于临床分离的病原菌的分型及医院感染的分子流行病学研究。     

膜反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇基因型

目的应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌对乙胺丁醇（EMB）耐药性。方法设计与合成用于检测结核分枝杆菌耐EMB基因embB的寡核苷酸探针，点于硝酸纤维素膜上，与结核分枝杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应（PCR）产物进行反向斑点杂交，并与PCR-直接测序（PCR—DS）结果比较。结果27株结核分枝杆菌临床分离株中，14株敏感株膜反向斑点杂交结果与标准株完全相同；13株耐乙胺丁醇临床分离株检测到embB基因突变。均为306位密码子ATG→GTG、ATG→CTG、ATG→ATA、ATG→ATT和ATG→ATC突变．该突变与直接测序结果完全一致。结论膜反向斑点杂交技术可能成为检测部分结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药基因型简便、快速的方法。     

非结核分枝杆菌耐药性特征及聚合酶链式反应检测方法的建立

目的建立一种快速鉴别非结核分枝杆菌的聚合酶链式反应方法,并与直接测序法比较,探讨该方法的可行性。方法根据分枝杆菌16~23srDNA间隔区序列设计引物,建立检测分枝杆菌的PCR分型方法,并利用该技术对5例临床分离株进行PCR扩增,借助凝胶电泳分析和直接测序分析进行临床分离株的分子分型。结果 5例分离株均耐利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素、丁胺卡那、环丙沙星、左氧氟沙星、硫异烟胺、力克肺座和比嗪酰胺,为多重耐药菌株。PCR扩增结果和直接测序结果相吻合,均为脓肿分枝杆菌。结论分枝杆菌高度保守的16~23srDNA间隔区序列可做为分枝杆菌鉴定的靶基因,建立快速、特异、敏感的PCR扩增体系,且从基因水平上可对分枝杆菌进行分子分型,为临床治疗提供快速、准确的实验数据。     

痰耐药结核分枝杆菌rpoB基因的快速检测及利福平耐药机制研究

目的快速检测痰耐药结核分枝杆菌rpoB基因，了解利福平耐药的分予机制。方法根据结核分枝杆菌rpoB基因的耐利福平决定区设计引物．用PCR方法从耐药肺结核患者痰及临床分离菌株扩增rpoB基因片段，对扩增获得的rpoB基因片段进行序列测定，比较分析耐多药、全耐、单耐利福平、全敏感或标准结核分枝杆菌株之间的基因序列差异。结果于6h内从耐药肺结核痰中快速检测到rpoB举因。耐多药菌株、全耐及单耐利福平分离菌株均检测有rpoB基因点突变，突变位点主要为531、516或526常见密码子，且绝大多数为单碱基突变，发现1例MDR-TB出现479位和531位密码子同时突变。敏感株和标准株无基因突变。结论PCR及序列分析方法可快速、准确检测结核分枝杆菌rpoB基岗及其突变，结核分枝杆菌埘利福平的耐药性与rpoB基因点突变有关。     

福建宁德市少数民族地区结核病分子流行病学研究

目的 了解福建省宁德市少数民族地区结核分枝杆菌的基因型特征。方法采用基于IS6110的PCR分型方法,对宁德市少数民族地区的73株结核分支杆菌进行检测,用Gel—Pro analyzer4．0软件和NTSYSpc2．10e软件对DNA指纹图谱进行聚类分析。结果根据IS6110-PCR指纹图谱,73株结核分支杆菌共分为两个主要类型,其中Ⅰ型48株占65．8％,Ⅱ型（北京基因型）25株占34．2％。汉、畲两族病例菌株指纹均为Ⅰ、Ⅱ型,但在两型中的分布差异有显著性（P〈0．01）,畲族以Ⅰ型居多,占78．9％。Ⅰ、Ⅱ型菌株耐药率分别为39．6％（19／48）、28．0％（7／25）。结论宁德市少数民族地区结核分支杆菌北京基因型呈一般水平的流行,汉、畲两族之间结核病存在近期传播关系,但畲族人群病例以Ⅰ型（非北京基因型）流行为主,且耐药率较高。     

重复片段引物PCR用于鲍曼不动杆菌分型研究

目的 运用重复片段引物PCR的分析方法对鲍曼不动杆菌进行分子分型研究。方法 选用肠杆菌科基因间的重复序列（ERIC）为引物进行PCR扩增，对22株鲍曼不动杆菌进行分型研究，并与生物学分型及抗生素耐药结果进行比较。结果 经重复片段引物PCR的方法，分离出6种不同基因型的鲍曼不动杆菌，而生物学分型只有2种，且与抗生素谱较为相关。该方法简便易行，且重复性好，适合于医院感染流行病学研究。     

2000年中国结核病流行病学抽样调查菌株分子流行病学特征

目的　从分子流行病学角度探讨中国结核分枝杆菌的分布特征。方法　样本的获得采用全国范围等比例分层整群随机抽样 ;构建以IS6 110RFLPDNA指纹方法和以DR为基础的SpoligotypingDNA指纹方法 ;采用Gelcompare4 1软件对DNA指纹图谱进行数字化 ,比较其相似性 ;同时应用该软件行聚类 (cluster)分析 ;用 χ2 检验比较不同组别病人的分离菌株成簇率 (clustering)的差别 ,利用公式 1和 2计算影响结核病近期传播的危险因素 (OR值 )。结果　共获得 4 0 2株可进行DNA指纹分析的结核分枝杆菌 ;其中 5 0 75 % (2 0 4 / 4 0 2 )为“北京基因型”菌株 ;发现 3簇指纹图谱相同的菌株 ,其中 1簇对应的病人来源于同一家庭 ;分组统计显示 :男性组与女性组、年龄≥ 4 0岁组与<4 0岁组成簇率之间差异有显著性 (P <0 0 5 ) ,近期传播的危险因素男性为OR1:2 0 4 95 %CI(1 0 7～ 3 96 ) ,OR2 :4 96 95 %CI(2 77～ 9 0 0 ) ;<4 0岁为OR1:1 6 895 %CI(1 0 1～ 2 80 ) ,OR2 :1 30 95 %CI(0 2～ 0 4 4 ) ,其他各组之间差异无显著性 (P >0 0 5 )。结论　北京基因型结核分枝杆菌在中国呈较高水平的流行 ;男性和年长 (≥ 4 0岁 )可能为结核病近期传播的危险因素。利用结核分枝杆菌的DNA指纹图谱 ,可以实现结核分枝杆菌传染源     

RAPD技术用于结核病交叉感染的鉴别

目的：调查RAPD技术用于结核菌株DNA指纹鉴定的效果。方法：采用多重PCR方法对一组2例母女同时发病的肺结核患者和一组2例先后发病的兄妹肺结核患者的病原菌进行了菌种鉴定。采用RAPD技术对它们的基因组DNA进行指纹多态性分析。结果：4株病原菌均为结核分支杆菌。经RAPD分型，其中母女组2菌株的DNA指纹图谱完全相同，兄妹组2菌株的DNA指纹图谱有所不同。证明母女组所染病原菌的同源性很好，很可能为同一感染源，母女之间交叉感染的可能性很大；兄妹组病原菌的同源性较差，为非交叉感染。结论：RAPD技术适用于结核分支杆菌流行病学调查，特别是交叉感染的鉴别。     

应用M13引物PCR指纹法分析假丝酵母菌氟康唑耐药性

目的探讨M13微卫星引物PCR指纹法用于假丝酵母菌氟康唑耐药性基因分型的可行性。方法采用纸片扩散法分析假丝酵母菌氟康唑耐药性,并进一步对41株假丝酵母菌进行M13引物PCR指纹分析,采用RAPD200软件邻接法(neighbour joining,NJ)聚类分析电泳带型模式。结果41例主要从痰液和阴道分泌物中分离的假丝酵母菌标本中中,氟康唑药物敏感11株(26.8%),依赖8例(19.5%),耐药22例(53.7%),PCR指纹分析至少可检测到12种不同的条带,条带数目从2条到12条不等,电泳带型模式与感染部位和氟康唑药物反应性有关。结论假丝酵母菌氟康唑耐药性菌珠所占比例较大,M13微卫星引物PCR指纹法可用于假丝酵母菌的分子流行病学调查和氟康唑耐药性基因分型。     

结核分枝杆菌H37Ra株fbpC基因的克隆与表达

目的：探讨克隆结核杆菌H37Ra菌株抗原fbpC基因及在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达。方法：通过聚合酶链反应扩增人结核杆菌弱毒性菌株H37Ra的编码基因ibpC,并定向克隆到原核表达载体pET-28a,通过酶切、聚合酶链反应和测序鉴定重组质粒,转化大肠埃希菌BL21（DE3）中,由异丙基硫代半乳糖苷诱导表达,十二烷基磺酸纳一聚丙烯酰胺和Westernblot鉴定表达的重组蛋白。结果：成功构建了pET28a—fbpC重组质粒;在大肠埃希菌中表达了相对分子量约33000的重组蛋白。结论：重组质粒pET28a—fbpC成功构建和表达,为fbpc反应原性、免疫诊断价值的研究提供参考。     

Bovine salmonellosis in Northeast of Iran: Frequency,genetic fingerprinting and antimicrobial resistance patterns of Salmonella spp.

Objective

To evaluate serovar and antimicrobial resistance patterns of Salmonella spp isolated from healthy, diseased and necropsied cows and calves in this observational study.

Methods

Nineteen isolates recovered from feces and tissues of salmonellosis-affected animals of two commercial farms in north-east of Iran. In second part of the study, the two farms were sampled 4 times with an interval of 2 month. The samples included calves'' feces, adult cows'' feces, feeds, water, milk filters, and milk fed to calves. Five Salmonella were isolated from 332 fecal samples collected from calves and peri-parturient cows. No Salmonella was recovered from water, feed, milk filers and milk fed to calves.

Results

Salmonella Typhimurium was the most frequently isolate among all sero-groups. S. Dublin was only accounted for 8% (two out of 24) of isolates. Isolated Salmonella strains were used for the ERIC PCR DNA fingerprinting assay. Our results grouped Salmonella isolates into 3 clusters, suggesting that specific genotypes were responsible for each sero-group of Salmonella. The results also revealed diversity among Salmonella isolates in cluster III (sero-group B). Eighteen out of 19 Salmonella spp. were resistant to oxytetracycline. Five isolates out of 19 showed more than one drug resistance. Multi-drug resistance was seen only among Salmonella Typhimurium isolates. Enrofloxacin was the most susceptible antibiotic against all isolates in this study.

Conclusion

The emergence of multiple antibiotic-resistant strains of Salmonella Typhimurium should be of great concern to the public. No correlation between ERIC fingerprinting and resistance patterns of Salmonella isolates was found, which indicates resistance to antimicrobial agents was not related to specific genetic background.     

荧光定量PCR检测石蜡组织中结核杆菌的临床应用

目的探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）检测石蜡包埋组织结核分枝杆菌DNA（TB—DNA）在结核病诊断中的应用价值。方法33例石蜡包埋组织标本采用FQ—PCR技术检测TB—DNA,同时进行组织病理学检查,分别计算FQ—PCR和病理学检查的灵敏度和准确度。结果29例临床诊断为结核病的组织标本中,FQ—PCR检测阳性26例,病理学拟诊为结核阳性20例,4例临床诊断非结核病的标本中,FQ—PCR检测和病理学检查都为阴性,两者的灵敏度和准确度分别为89．66％、90．91％和68．97％、72．73％。结论FQ—PCR技术检测石蜡包埋组织的TB—DNA用于结核病的诊断具有较高的灵敏度和准确度,与病理学检查相结合可以大大提高结核病的检出率。     

应用PCR方法扩增IS6110保守片段快速鉴定结核分支杆菌

目的：了解PCR方法快速鉴定结核分支杆菌的可靠性，探索快速诊断结核病的实验方法。方法：应用PCR方法扩增149株结核分支杆菌临床分离株的IS6110保守片段，并与结核分支杆菌H37Rv标准株进行比较。结果：149株临床分离株中，140株可以扩增出与结核分支杆菌H37Rv标准株相同的123bp DNA片段(敏感性达93．9％)，而阴性对照均不能扩增出该片段。结论：应用PCR方法扩增IS6110保守片段来鉴定结核分支杆菌，结果准确可靠，且具有方便和快速等优点，有较大的临床应用价值。     

2013—2021年杭州某综合医院非结核分枝杆菌肺病流行状况分析

目的 分析杭州市结核病定点诊治医院2013—2021年非结核分枝杆菌（nontuberculosis mycobacteria,NTM）肺病的流行状况,为杭州市该病的临床防治诊疗及流行病学提供依据。方法 收集2013—2021年浙江大学医学院附属杭州市胸科医院结核科及呼吸与危重症医学科收治的疑似肺结核患者,经抗酸杆菌涂片及BACTEC MGIT960确诊为分枝杆菌感染,采用实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）检测结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex,MTB）与NTM的菌群鉴定,对鉴定为NTM的菌株采用HAIN基因分型鉴定法及DNA微阵列技术进行菌种鉴定,并对感染者的相关资料进行总结分析。结果 2013—2021年,从37 520例疑似肺结核患者标本中分离出NTM菌株1257株,检出率从2013年的0.8%上升到2021年的6.7%。患者中男性占50.76%,女性占49.24%。年龄分布上,60~79岁的中老年患者最多,占55.0%。2013年检出3种NTM菌种,分别是胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和龟/脓肿分枝杆菌;2021年菌种分布达13种,前三位分别是胞内分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌和鸟分枝杆菌。结论 2013—2021年杭州地区NTM检出率持续升高,感染人群以男性、60~79岁的中老年为主,感染菌种以胞内分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌和鸟分枝杆菌为主。