骨髓间质干细胞体外定向肌样分化的研究

目的 研究兔骨髓间质干细胞经5—氮杂胞苷诱导，在体外定向肌样分化的情况。方法 取兔胫骨骨髓，分离并培养骨髓间质干细胞，用5—氮杂胞苷苦(10μmol/L)定向诱导，分别在培养的第7、14、2l、28天用免疫组织化学的方法检测细胞中的肌球蛋白重链，取未经5—氮杂胞苷诱导正常培养的细胞为对照组。结果 兔骨髓间质干细胞经5—氮杂胞苷诱导，在其培养的第21、28天免疫组织化学染色方法检测细胞中的肌球蛋白重链呈阳性，而在其培养的第7、14天以及对照组，免疫组织化学染色方法检测细胞中的肌球蛋白重链呈阴性。结论 骨髓间质干细胞是骨髓来源的具有多向分化潜能的干细胞，在5—氮杂胞苷的定向诱导下，可以肌样分化。     

5-氮杂胞苷和地塞米松对大鼠骨髓间充质干细胞分化作用的实验研究

[目的]探究5-氮杂胞苷和地塞米松对大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化能力的影响。[方法]SD大鼠骨髓间充质干细胞体外扩增和传代培养,流式细胞术鉴定细胞表面标志,取3代细胞随机分为空白组、激素组、激素+5-氮杂胞苷组,相应药物干预3 d后成骨诱导分化14 d,RT-PCR和Western blot检测Runx2和PPARγ的表达。[结果]所取得骨髓间充质干细胞纯度和均一性好,细胞表面标记CD90高表达,CD34、CD45低表达。第3代细胞经药物干预和成骨诱导后,与空白组相比,激素组Runx2基因表达降低,PPARγ基因升高,5-氮杂胞苷+激素组结果与激素组相反(P<0.05)。[结论]激素能抑制骨髓间充质干细胞成骨分化,促进成脂分化,5-氮杂胞苷能干预激素的这种作用,提高骨髓间充质干细胞分化潜能。     

脐血干细胞肌源性诱导后移植细胞间连接的研究

目的 研究犬脐血间质干细胞(MSCs)肌源性诱导后移植,移植细胞是否与宿主细胞形成功能性整合,检测细胞间连接的形成. 方法 通过分离、纯化、培养脐血MSCs,Laz-Z转染标记,5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)肌源性诱导,将36只杂种犬随机分为两组,建立犬心肌梗死模型.细胞移植组经冠状动脉和局部注射,将约107个MSCs移植到犬急性心肌梗死模型;对照组用同样的方法注射等量的生理盐水.两组分别于2、4和8周时取组织切片,用免疫组织化学法检测细胞问连接.结果 脐血MSCs呈梭形或纺锤形,克隆样生长;5-aza诱导后肌源性分化,可表达α-actin( ),desmin( ),connexin43( ).移植的细胞可存活8周以上,移植细胞、移植细胞和宿主心肌连接处有cadherin和connexin43的阳性表达;而对照组仅有cadherin和connexin43的表达. 结论 脐血MSCs可在体外诱导为心肌样细胞,移植后能与宿主心肌形成有效连接,从而具有通讯联系.     

骨髓基质干细胞复合藻酸钙凝胶修复全层半月板无血运区缺损

目的 观察骨髓基质干细胞复合藻酸钙凝胶注射式修复全层半月板无血运区缺损的效果.方法 2008年6月至2009年2月制造成年山羊半月板前角无血运区全层缺损模型.以自体骨髓基质干细胞复合可注射藻酸钙凝胶修复半月板缺损(Ⅰ组),同时设立单纯载体组(Ⅱ组)和空白对照组(Ⅲ组).术后4、8、16周处死动物,行大体观察,组织学观察、电镜观察和MRI检查并比较修复效果.结果 Ⅰ组缺损完全被修复组织填充,结合紧密,与正常半月板组织相似,在4～16周效果逐渐改善,大体观察优于其他各组.光镜见细胞随凝胶纤维排列分布,载体纤维间隙大多为细胞分泌基质所充填,细胞排列密集,基质分布均匀.透射电镜见Ⅰ组细胞呈软骨细胞样形态,细胞突起较多,细胞器丰富,细胞为不同走向排列的纤维包绕.MRI检查发现Ⅰ组修复效果较好.结论 骨髓基质干细胞复合藻酸钙凝胶注射可有效地修复全层半月板无血运区缺损.     

成肌分化因子和5-氮杂胞苷联合诱导骨髓间充质干细胞向骨骼肌细胞分化的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在体外定向分化为骨骼肌细胞的干预条件。方法取健康4周龄Wistar大鼠MSCs制成细胞悬液接种于培养瓶中，置于37C、5％CO2恒温培养箱中培养，倒置相差显微镜下观察，细胞布满瓶底即为1代，取第3代MSCs，以5-氮杂胞苷10μmol／L、成肌分化因子0．1ng／ml、转化生长因子β1 0.1ng／ml、胰岛素样生长因子12ng／ml进行联合诱导，使之分化。诱导后第9天，收集细胞，行MTT比色法、流式细胞仪和免疫组织化学检测鉴定细胞。结果原代培养的MSCs呈贴壁生长，3～5d呈集落样生长，5～7d后有体积不等的多突成纤维细胞、较大的扁平多角形细胞、中等的多角形细胞和较小的三角形细胞。培养12d后，细胞融合，铺满瓶底，MSCs形态变化不明显。联合诱导后，部分细胞死亡，生长缓慢；7d后见细胞明显增殖，体积逐渐增大，呈椭圆形、梭形或不规则形状；14d后，大量增殖的长梭形细胞开始增多；18～22d后，肌管数量增多，体积增大，核数亦明显增多，初生肌管与长梭形成肌细胞呈平行排列，间隔分布。MSCs免疫组织化学法测定CD44反应阳性，胞质呈棕褐颗粒，核周明显，CD34呈阴性反应；诱导后MSCs结蛋白、骨骼肌特异肌球蛋白均为阳性表达。流式细胞仪测定MSCs和诱导后MSCs大部分处于G0／G1期，分别占79．4％、62．9％，而G2／S／M期仅占20．6％、36．1％。根据MTT绘制生长曲线，可见MSCs生长速度明显高于诱导后的MSCs。两种细胞并未达到平台期，都有继续增殖的趋势。结论在体外，MyoD、5-氮杂胞苷可以诱导MSCs向骨骼肌细胞定向分化，并伴有结蛋白和骨骼肌肌球蛋白阳性表达；定向诱导后MSCs增殖期比例大，向骨骼肌细胞分化纯度更高。     

以海藻酸三维支架构建骨髓间充质干细胞源性生物人工肝组织的实验研究

目的 以骨髓间质干细胞(bone mesenchymal stem cell,BMSC)为种子细胞,以海藻酸三维支架为载体,研究两者的相容性及其构建生物人工肝组织的可能性.方法 将大鼠BMSC接种于海藻酸三维支架上,采用倒置相差显微镜、扫描电镜分别检测BMSC的黏附、生长与增殖情况,评价两者的相容性;同时以表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维生长因子4(FGF-4)等细胞因子混合液诱导BMSC向肝细胞分化,检测培养液内尿素氮和白蛋白含量,RT-PCR检测培养细胞ALB和AFP基因的表达,糖原染色及免疫荧光法检测细胞糖原合成功能和CK-18的表达. 结果大鼠BMSC在海藻酸三维支架上能正常地黏附、生长和增殖;于海藻酸三维支架内加入诱导液作用于BMSC后,培养液内尿素和ALB的含量逐渐上升,RT-PCR检测到培养细胞有AFP和ALB基因的表达,同时被诱导的细胞具有糖原储存的功能并表达CK-18.结论 海藻酸三维支架与大鼠BMSC具有良好的相容性;以EGF、HGF、FGF-4等细胞因子混合液为诱导因子,能在海藻酸三维支架上成功诱导BMSC向肝细胞分化;海藻酸三维支架和BMSC可望成为肝脏组织工程理想的种子细胞和细胞载体.     

骨髓间充质干细胞诱导同种异体B细胞向CD5~＋调节性B细胞转化体外实验

目的研究骨髓间充质干细胞（BMSC）诱导高分泌IL-10的调节性B细胞（Breg）的产生及机制。方法采用成功分离的DA大鼠BMSC与Wistar大鼠B细胞共培养（BMSC＋B）96h后,ELISA检测BMSC＋B组细胞培养上清中IL-10的浓度和分泌细胞因子的变化,设单纯BMSC、单纯B细胞两组对照;流式细胞术分析B细胞表型的变化;通过加入中和抗体,观察细胞因子对BMSC诱导Breg细胞产生的影响。结果 BMSC＋B组成功诱导产生高分泌IL-10的Breg细胞（P=0.006）;Breg表型为CD19＋CD1d＋CD5＋;IFN-β促进BMSC诱导Breg的产生（P=0.034）。结论 BMSC能诱导高分泌IL-10的CD5＋Breg产生,该机制可能与BMSC自身分泌的IFN-β有关     

骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MsCs)定向分化为心肌细胞的可行性，建立一种以干细胞移植为主治疗心肌梗死的治疗策略。方法利用Percoll分离骨髓细胞培养获得MsCs；用5-氮杂胞苷(0．1、1、5、10、50和100μmol/L)定向诱导24h，分别在诱导培养的第14d和21d，检测细胞中的α-横纹肌肌动蛋白表达。将培养的MSCs，移植于急性梗死心肌组织内，4周后进行组织学和免疫组织化学染色，并用超声检测室壁运动和心功能改变。结果骨髓间充质干细胞经5-氮杂胞苷诱导，培养21d后，5和10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导后的MSCs有一部分细胞表达α-横纹肌肌动蛋白，并一些细胞自发性跳动；细胞移植4周后，在缺血心肌有一部分MSCs与宿主心肌细胞形成连接并分化为具有典型的肌小节和表达α-横纹肌肌动蛋白阳性的心肌细胞。结论MsCs可以分化成心肌细胞。     

可注射性藻酸钙凝胶载体组织工程性软骨的实验研究

目的 对经体外培养的软骨细胞与藻酸钙凝胶载体复合形成的组织工程性软骨进行组织形态学观察。方法 取 2周龄新西兰白兔的膝关节软骨细胞,经体外培养两次传代后与藻酸钠溶液复合,使细胞密度为 5× 10 6/ml、 NaCl 0.135 mol/L、 K 2HPO 4 0.1 mol/L、藻酸钠的质量分数为 1％,然后注入葡萄糖酸钙使终浓度为 40 mmol/L。在实验组 (A、 B组 )兔的背部皮下注入复合藻酸钙载体的软骨细胞悬液,对照组 (C、 D组 )动物或注入无载体的软骨细胞悬液或注入无细胞的藻酸钙载体,分别于注射后第 2周、第 4周取材,进行 HE和甲苯胺蓝染色。结果 实验组,于注射复合软骨细胞的藻酸钙凝胶载体第 2周时, HE染色结果显示皮下注射点出现大量软骨细胞增殖,第 4周时有软骨组织形成;甲苯胺蓝染色见有软骨细胞和软骨基质形成。在注入无载体的软骨细胞悬液组 (C组 ),部分动物的皮下注射点有少量软骨组织形成,而在注入无细胞的藻酸钙载体组 (D组 )则未见软骨形成。结论 应用可注射性藻酸钙凝胶载体复合软骨细胞可在同种异体动物体内形成新生软骨组织。     

心肌或"心肌样"环境而不是化学物质诱导骨髓基质细胞向心肌细胞分化研究

目的 比较心肌或“心肌样”环境与胞嘧啶类化学物质5-氮胞苷对骨髓基质细胞(MSCs)向心肌细胞分化的诱导作用。方法 用不同浓度(3、5、10μmol／L)的5-氮胞苷以各种方法(一次处理与反复处理)诱导MSCs，连续观察30d。采用免疫荧光技术检测心肌特异性肌球蛋白重链(MHC)及肌钙蛋白Ⅰ(TnⅠ)的表达，并用心室肌特异性肌球蛋白轻链(MLC2v)启动子(250bp)控制的蓝绿色荧光蛋白(ECFP)报告基因表达技术从转录启动水平进行检测；将MSCs与心肌细胞共培养或移植入大鼠心肌内。检测MHC及TnⅠ表达。结果 5-氮胞苷处理过的MSCs培养物中未见细胞搏动、肌管形成、MHC和TnⅠ表达，亦无MLC2v转录启动阳性细胞出现；但在共培养及体内移植实验中，检测到心肌特异性蛋白在MSCs中的表达。结论 体外5-氮胞苷处理不能诱导MSCs表达心肌特异性蛋白；但MSCs与心肌细胞直接接触可向心肌细胞分化。     

肿瘤干细胞与肝癌干细胞

肿瘤起源于干细胞的假说正在各种人类肿瘤中得到证实,肿瘤不单是一种基因病,而且是一种干细胞病,基因突变作用于干细胞,干细胞突变成为肿瘤干细胞,这是肿瘤发生、再生、转移和复发的关键。肝细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一,其中是否存在“肝癌干细胞”的问题一直倍受人们关注。该文介绍肿瘤干细胞与肝癌干细胞的研究情况。     

大鼠神经干细胞与小鼠雪旺细胞混合培养的研究

外培目的观察小鼠雪旺细胞体养时对大鼠神经干细胞存活及分化的影响。方法获取Wistar鼠坐骨神经并采用组织块法分离和纯化雪旺细胞；体外分离新生乳鼠脑神经干细胞，将雪旺细胞和神经干细胞分别培养扩增后进行共培养。共分5组进行：实验组1（NSC悬浮＋SC悬浮＋DMEM／F12）；实验组2（NSC悬浮＋SC贴壁＋DMEM／F12）；试验对照组1（SC培养基＋NSC＋DMEM／F12）；试验对照组2（EGF／bFGF＋NSC＋DMEM／F12）；试验对照组3（NSC＋DMEM／F12）。倒置相差显微镜对各组培养细胞每天观察形态和计数，免疫组织化学检测混合培养细胞特异性标记物的表达：SC采用P0和S100，NS采用nestin标记，神经干细胞分化神经元分别采用GFAP、GalC、Tubulin-β染色。结果共培养组NF染色阳性神经元样细胞的百分率明显高干其他各组；实验组1克隆球直径明显高于其他各组，其平均直径为8μm；实验组神经元样细胞突起的长度比对照组的长，3周长度差为26．5-67．3μm。结论大鼠神经干细胞与小鼠雪旺细胞共培养使两者不仅能够共生，而且雪旺细胞能显著促进体神经干细胞分化为神经元样细胞；神经干细胞分化神经元突起增长并且有序排列成轴索样结构。     

干细胞向生殖细胞分化的研究进展

干细胞(SCs)具有在体外分化为生殖细胞的潜能,为研究生殖细胞(GCs)早期发育提供了良好的模型,并将为干细胞移植修复生殖功能提供细胞资源。本文综述了胚胎干细胞/诱导多能干细胞(ESCs/iPSCs)、新生儿附属物来源干细胞(NDSCs)以及成体干细胞(ASCs)向生殖细胞分化所取得的研究进展,同时总结了各类干细胞向生殖细胞分化时所遇到的障碍及所面临的挑战,为干细胞在生殖医学领域的应用提供理论依据。     

Induction of regulatory T cells from mature T cells by allogeneic thymic epithelial cells in vitro

The ability of thymic epithelial cells (TEC) to re‐educate mature T cells to be regulatory T cells has not been addressed. In the present study, this issue was directly investigated by co‐culturing of mature T cells and allo‐TECs. B6 macrophage cell line 1C21‐cultured BALB/c splenocytes responded to B6 antigens in vitro. However, BALB/c splenocytes precultured with B6‐derived TECs 1‐4C18 or 1C6 did not proliferate to B6 antigens, but responded to rat antigens. Exogenous interleukin‐2 (IL‐2) failed to revise the unresponsiveness of these T cells. Allo‐TEC‐cultured T cells predominantly expressed Th2 cytokines (IL‐4 and IL‐10). B6 TEC‐cultured BALB/c splenocytes markedly inhibited the immune responses of naïve BALB/c splenocytes to B6 antigens, but not to rat or the third‐party mouse antigens. BALB/c nude mice that received naïve syngeneic splenocytes rejected B6 or rat skin grafts by 17 days postskin grafting; however, co‐injection of B6 TEC‐cultured BALB/c splenocytes significantly delayed B6 skin graft rejection (P < 0.01), with the unchanged rejection of rat skin grafts. These studies demonstrate that allo‐TECs are able to ‘educate’ mature T cells to be regulatory cells, and suggest that regulatory cells derived from mature T cells by TECs may play an important role in T cell tolerance to allo‐ and auto‐antigens.     

骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞作为组织工程瓣种子细胞的对比

目的 诱导分化骨髓间充质干细胞(BMSC)及内皮祖细胞(EPC),进行BMSC及EPC作为组织工程瓣膜(TEHV)种子细胞的对比.方法 分离扩增BMSC及EPC,分别定向诱导分化为内皮细胞,比较两种细胞在形态学、增殖能力、黏附力以及细胞冻存和复苏率方面的特点与区别.结果 光镜下,两种细胞均为贴壁生长细胞,BMSC的形态为梭形或多角型,EPC的形态为圆形及不规则形状,第2代诱导的BMSCs、EPCs的倍增时间分别为34 h和35 h,诱导后的BMSC冻存和复苏率以及黏附力与EPC之间差异无统计学意义;电镜示两种细胞均能够种植在去细胞猪主动脉瓣上.免疫组织化学结果显示两种细胞种植后的瓣膜上均有间质细胞生长.结论 BMSC和EPC诱导后可分化为内皮细胞,两者之间差异无统计学意义,都是合适的TEHV种子细胞.     

人骨髓间质干细胞向表皮细胞分化的研究

目的探讨人骨髓间质干细胞（MSC）在体外培养条件下能否定向诱导分化为表皮细胞。方法抽取无造血系统恶性疾病的成人骨髓标本，采用Percoll细胞分离液（1．073g／ml）分离MSC，在体外传代培养至第3代，分为对照组和实验组。两组分别用普通L-DMEM培养基和含表皮生长因子、胰岛素、维甲酸、氯化钙的L-DMEM培养基诱导7d。在倒置相差显微镜下每天观察两组细胞的形态；采用免疫组织化学法检测P63和广谱细胞角蛋白（PCK）的表达情况。结果实验组细胞由长梭形逐渐转变为扁圆形或形态不规则，部分细胞P63和PCK呈阳性表达；对照组细胞持续呈长梭形，P63和PCK未见表达。结论人骨髓MSC在体外可诱导分化为表皮细胞。     

人脂肪间充质干细胞向表皮细胞表型转化的研究

目的:探索人脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)向表皮细胞表型转化的方法。方法:以手术中剩余的人皮下脂肪组织为材料来源,利用胶原酶消化法分离ADSCs,流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD90、CD105的表达,成脂诱导后油红O染色鉴定。实验组利用第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科实验室已成功构建的pc DNA3.1(+)/SP+EGF质粒经脂质体介导转染的Ha Cat细胞,与ADSCs在Transwell小室中共培养,对照组为ADSCs加入10%FBS培养基,14天后Realtime-PCR检测两组ADSCs中CK19、integrin-β的m RNA表达量。结果:实验组ADSCs中CK19、integrin-β的m RNA表达量较对照组明显升高,且差别有统计学意义。结论:转染EGF的Ha Cat细胞可诱导ADSCs向表皮细胞表型分化,从而为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。     

多因子联合诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞样细胞

目的 建立有效的体外诱导人胚胎干细胞(hESCs)分化为肝细胞样细胞的培养体系.方法 将H9 hESC细胞株接种到基底膜提取物包被的培养板上,序贯加入含有下列诱导因子的分化培养基诱导分化:100μg/L细胞因子活化素A( activin A)诱导3d,20 μg/L骨形成蛋白4(BMP-4)和10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导4d,10μg/L肝细胞生长因子(HGF)诱导5d,最后以含10 μg/L制瘤素M(OSM)及1×10-7 mol/L地塞米松(Dex)的培养液继续诱导4d.于细胞诱导分化第16天,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫荧光检测分化细胞肝脏特异性基因和蛋白表达水平;过碘酸-雪夫反应(PAS)试验和吲哚氰绿(ICG)摄取试验检测分化细胞是否具备肝细胞功能.结果 activin A、BMP-4、bFGF、HGF、OSM和Dex联合诱导的分化细胞具有类似肝细胞的形态结构,呈多角形或卵圆形;RT-PCR结果显示分化第16天的细胞表达甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白7(CK7)、细胞角蛋白19(CK19)、肝细胞核因子-4α(HNF4-α)、1-抗胰蛋白酶(AAT)等肝脏特异性基因;免疫荧光化学检测结果显示分化第16天的细胞表达AFP、ALB、CK19、CYP7A1等肝脏特异性蛋白;PAS试验及ICG试验显示分化细胞具备糖原合成和ICG摄取释放等肝细胞功能.结论 体外联合多种诱导因子可诱导hESCs定向分化为肝细胞样细胞.     

诱导脂肪干细胞向血管内皮细胞分化的实验研究

目的 探讨诱导脂肪干细胞(ADSCs)向血管内皮细胞(ECs)分化的可能性,为ADSCs应用于创伤修复的理论提供实验依据.方法 切取大鼠脂肪组织,用酶消化法分离、培养ADSCs,流式细胞仪检测第3代ADSCs的CD49d和CD106的表达以鉴定ADSCs.实验组用含30%大鼠血管匀浆液的条件培养液诱导大鼠ADSCs,空白对照组用含10%胎牛血清DMEM培养液培养大鼠ADSCs,各组诱导3 d后经免疫组化和流式细胞仪检测ADSCs中CD34和血管性假血友病因子(vWF)相关抗原的表达变化.结果 流式细胞仪检测ADSCs的CD49d和CD106阳性率分别为(98.32±0.37)%和(1.67±0.61)%;血管条件培养液诱导组细胞CD34和vWF阳性率分别为(77.14±0.76)%和(75.46±0.37)%,较空白对照组(1.38±0.31)%和(1.70±0.23)%均升高,差异有统计学意义(P<0.01).结论 ADSCs可以被诱导向ECs表型分化,提示ADSCs具有参与创伤后血管形成的潜能,可以应用于创伤修复的治疗.     

间充质干细胞联合输注促进造血干细胞移植后的造血重建

目的探讨间充质干细胞(MSCs)与造血干细胞(HSCs)共同移植对造血重建的影响。方法将扩增的Balb/c小鼠骨髓MSCs与骨髓共同经尾静脉输入经致死剂量照射的同系小鼠体内(联合输注组),并设单输骨髓细胞的HSCs组、单输间充质干细胞的MSCs组以及输培养基的对照组,每隔5d计数白细胞,计算动物死亡率。将乙酰乙酸碳氧荧光素标记的人间充质干细胞输入SCID小鼠尾静脉,24h后取肺、心、肝、脾、肾和小肠组织做冰冻切片;取骨髓、肝脏及脾脏,制成单细胞悬液,涂片,在荧光显微镜下观察计数;用逆转录聚合酶链反应测定鼠骨髓中人特异性β2-微球蛋白。结果细胞输注后,联合移植组的白细胞恢复快,12d左右恢复正常,死亡率(3/11)低于HSCs组(5/10)、MSCs组(4/4)、输培养基的对照组(11/11)。人MSCs输入SCID小鼠后24h,其在体内的分布依次为肺、肾、脾、肝,小肠及心脏组织中几乎无阳性细胞,骨髓中有极少MSCs。结论MSCs与造血干细胞共输能促进造血恢复。