一种从银染后聚丙烯酰胺凝胶中回收,克隆DNA的方法

一种从银染后聚丙烯酰胺凝胶中回收、克隆ＤＮＡ的方法李卫东孟祥文李伟刘桂中牟巨伟吴日文从凝胶中回收ＤＮＡ是分子生物学实验中经常遇到的问题，而一些量很少的ＤＮＡ条带用琼脂糖凝胶电泳或一般ＥＢ染色的聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）很难分辨清楚。一些诸如ｍＲＮ...     

三种从琼脂糖凝胶回收DNA片段方法的比较

三种从琼脂糖凝胶回收ＤＮＡ片段方法的比较胡静，温进坤探针制备是进行核酸分子杂交的首要步骤。在制备作为探针的ＤＮＡ片段时，要将经内切酶切割后所生成的载体与插入片段混合物通过凝胶电泳分离后，再把所需的ＤＮＡ片段回收。回收ＤＮＡ片段的方法很多，如透析袋电洗...     

二氧化硅法纯化琼脂糖凝胶中的DNA

利用二氧化硅特异地吸附核素的特性，建立了从琼脂糖凝胶中回收ＤＮＡ的方法。结果表明本方法对１３００￣３５００ｂｐ的ＤＮＡ回收效果较好，回收效率达６０％￣７０％，１００￣１５００ｂｐ，３５００￣５０００ｂｐ的ＤＮＡ亦能被有效地回收。通过对回收ＤＮＡ的酶切，连接等实验，证实了所回收的ＤＮＡ片段能够满足进一步的实验要求。该方法简单，快捷，经济，适用，值得推广。     

从琼脂糖凝胶中回收DNA方法的评估

从琼脂糖凝胶电泳分离的条带中回收 DNA,是常用的分子生物学技术。回收的 DNA分子 ,根据目的不同 ,可用于连接重组、序列分析、制备探针等后续工作 [1 ]。目前从琼脂糖凝胶中回收 DNA的方法较多 ,如试剂盒法、电洗脱法、凝胶挖孔等。本研究从敏感性、回收率、经济性等几方面 ,比较了 3种常用的从凝胶中回收 DNA的方法 [2 ] 。1　材料与方法1.1　准备　为比较 3种方法对不同大小 DNA分子的回收效果 ,我们准备了 3种 DNA材料 ,大小分别为 12 0、840 bp和4.8kb。其中 12 0、840 bp片段为 PCR扩增产物[3 ] ;4.8kb的DNA为经 H ind 线性…     

一种从琼脂糠凝胶中分离DNA的快速方法

本文介绍一种冷冻挤压离心法从琼脂糖凝胶中分离ＤＮＡ片段，适合从０．５％～１．８％的凝胶中分离几十到几万ｂｐ的不同ＤＮＡ，ＤＮＡ回收率与凝胶浓度、ＤＮＡ大小有关，介于２５％～８０％。本方法快速、简单、经济、重复性好，值得推广应用。     

一种从琼脂糖凝胶中分离DNA的快速方法

本文介绍一种冷冻挤压离心法从琼脂糖凝胶中分离ＤＮＡ片段，适合从０．５％￣１．８％的凝胶中分离几十到几万ｂｐ的不同ＤＮＡ，ＤＮＡ回收率与凝胶浓度、ＤＮＡ大小有关，介于２５％￣８０％。本方法快速、简单、经济、重复性好，值得推广应用。     

从琼脂糖电泳凝胶中回收DNA的一种简便方法

目的 构建一种简便装置,以高效回收琼脂糖电泳凝胶中的ＤＮＡ。方法 利用１．５ｍｌ微量离心管、１ｍｌ移液抢头、尼头网膜和透析膜,做成一个巧妙且简单的ＤＮＳ回收装置。以分子量参照物λＤＮＡ／ＥｃｏＲ１＋ＨｉｎｄⅢ为验证样品,对其部分条带进行回收。用凝胶电泳和ＤＮＡ连接实验鉴定回收产品的质量。结果 在电压降为３Ｖ／ｃｍ、时间为０．５ｈ的电泳洗脱条件下,分子量标记中５６４ｂｐ条带的最终回收率高达８０％,２     

采用二氧化硅微球法回收DNA的实验研究

目的：探讨一种以二氧化硅微球为载体从琼脂糖凝胶中高效回收DNA片段的方法。方法：用3mol/L NaI溶胶液将琼脂糖凝胶溶解后与一定量的二氧化硅微球一起孵育，充分洗涤干燥后以双蒸水洗脱DNA，通过凝胶成像系统计算DNA回收率。结果：①用二氧化硅微球从凝胶中回收DNA时溶胶液的pH值对回收效率影响最大，最佳pH值为5．0-5．5；二氧化硅微球大小、用量、溶胶液的浓度、洗液的浓度及酸碱度也会对回收效率产生影响。②DNA片段大小也可影响回收效率，500bp以上片段的回收效率在80％以上，而500bp以下则为50％～70％。结论：以二氧化硅微球为载体可以简便、高效、快速地从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段。     

一种快速可靠的小量制备质粒DNA的方法

小规模快速制备质粒ＤＮＡ是筛选大批重组质粒的阳性克隆的一个不可缺少的步骤，常规经典的方法是碱裂解法。通过该方法制备出来的质粒ＤＮＡ既可进行琼脂糖凝胶电泳，也可进行限制性酶切分析。但该方法在一次筛选数十个克隆时就显得操作步骤繁琐，费时较多。今介绍一种经...     

单细胞凝胶电泳技术及其应用

由Ｏｓｔｌｉｎｙ于１９８４年首创的单细胞凝胶电泳（ＳＣＧＥ）用于检测ＤＮＡ单或双链缺口，具有简单、灵敏、迅速且不需放射性核素标记等优点。其基本原理是将单个细胞包埋于琼脂糖凝胶中进行裂解、电泳、荧光染色和显微镜检测，细胞ＤＮＡ损伤产生的链缺口在电泳中迁移形成典型的“彗星”图像（故又称Ｃｏｍｅｔ Ａｓｓａｙ）。根据迁移长度和荧光强度即可定量分析ＤＮＡ损伤，故该方法在放射生物学、遗传毒理学、群体生物学监     

一种快捷、简便制备基因探针的方法

本文对常规随机引物标记基因探针法进行了改进，排除了已标记载体ＤＮＡ片段在核酸分子杂交反应中的影响，证明了载有特异ｃＤＮＡ片段质粒直接用于标记探针的可行性，建立了一种快捷、简便、经济的基因探针制备方法，并为特异ＤＮＡ片段酶切、回收困难质粒的应用提供了一条可行之路     

一种新的PCR产物回收方法

针对ＰＣＲＤＮＡ的回收效果及回收特点,采用ＨＣＭＶ(ｈｕｍａｎｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ)病毒ＤＮＡＰＰ71基因ＰＣＲ反应产物,分别利用本室建立的一种新方法和另外四种传统方法对ＰＣＲ产物ＤＮＡ进行回收,分析比较新方法同四种方法的回收效果。新方法是取60μｌＰＣＲ产物利用琼脂糖凝胶电泳,切下待回收片段凝胶切碎,加100μｌ双蒸水,70℃放置30ｍｉｎ,使胶冻结(若无70℃条件,20℃亦可,但相应延长放置时间)后,取出使胶在室温溶解,12000ｒ/ｍｉｎ离心20ｍｉｎ,取上清,利用3倍体积ｎ丁醇除去溴化乙锭,加入1/2体积75ｍｏｌ/ＬＮＨ4…     

一种替代玻璃乳进行DNA纯化的简便方法

一种替代玻璃乳进行ＤＮＡ纯化的简便方法有几种基质，包括玻璃、硅藻土和离子交换树脂都可以用于ＤＮＡ纯化。玻璃乳是一种以二氧化硅为主的基质，可以广泛用于ＤＮＡ纯化，尤其适用于纯化来自琼脂糖胶中的ＤＮＡ片段。现找到了一种玻璃乳的替代物：二氧化硅，它有规范的...     

人类染色体显微切割技术及其作用

人类染色体显微切割技术可从特定区域切以所需的染色体片段，结合ＰＣＲ、分子克隆 、ＤＮＡ测序和ＦＩＳＨ等方法，用于染色体特定区、带的ＤＮＡ文库构建、特异性探针的制备、疾病遗传学特征的分析和有关基因的鉴定、分离、克 隆和定位等。     

正常人T淋巴细胞cDNA文库一未知DNA片段的克隆与分析（摘要）

正常人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库一未知ＤＮＡ片段的克隆与分析（摘要）蔡铀庆，朱锡华（第三军医大学分子免疫学研究室重庆６３００３８）本研究设计并合成了一对引物。从正常人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库中，采用聚合酶链式反应，经α－互补颜色筛选和ＰＣＲ方法筛选，获得一...     

从人活化B细胞株3D5细胞λgtll cDNA文库筛选到的1…

对用单抗５Ｃ５和单抗５Ｃ５－Ｇ１的混合物从３Ｄ５细胞λｇｔｌｌ ｃＤＮＡ文库筛选到的７个阳性ｃＤＮＡ克隆中的１个（３Ｄ５－５）进行了核苷酸序列分析。由于３Ｄ５－５ ｃＤＮＡ长１．６ｋｂ左右，不能直接测序，故先依测序用质粒ｐＢＳｃｒｉｐｔ－ＫＳ多克隆位点中的内切酶点行单酶切，经电泳分析画出测序用的物理图谱，再用相应内切酶行单酶酶切。藉低熔点琼脂糖回收各个片段。带质粒ｐＢＳｃｒｉｐｔ－ＫＳ的大片段经直     

人白细胞介素6逆转录病毒表达载体的构建

实验以ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌｋｓ质粒为载体，构建了人白细胞介素６次级克隆ｐＢＩＬ－６。用限制性内切ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＶ消化ｐＢＩＬ－６，分离并回收了ＩＬ－６ｃＤＮＡ片段，并在其平未端加入了ＢａｍＨＩ接头。实验将带有ＢａｍＨＩ粘性末端的ＩＬ－６全基因片段插入到了逆转录病毒载体ｐＺＬＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）１的ＢａｍＨＩ位点上，构建了重组质粒ｐＺＬＰＩＬ－６。经对重组予ＤＮＡ的琼脂糖凝胶电泳、限制住内切酶分析和核酸杂交鉴定，筛选出了含有ＩＬ－６ｃＤＮＡ片段及插入方向正确的ｐＺＬＰＩＬ－６。     

从人活化B细胞株3D5细胞λgtll cDNA文库筛选到的1529bp cDNA的核苷酸序列分析

对用单抗５Ｃ５和单抗５Ｃ５－Ｇ１的混合物从３Ｄ５细胞λｇｔｌｌｃＤＮＡ文库筛选到的７个阳性ｃＤＮＡ克隆中的１个（３Ｄ５－５）进行了核苷酸序列分析。由于３Ｄ５－５ｃＤＮＡ长１．６ｋｂ左右，不能直接测序，故先依测序用质粒ｐＢＳｃｒｉｐｔ－ＫＳ多克隆位点中的内切酶点行单酶切，经电泳分析画出测序用的物理图谱，再用相应内切酶行单酶酶切。藉低熔点琼脂糖回收各个片段。带质粒ｐＢＳｃｒｉｐｔ－Ｋ５的大片段经直接自身环化，小片段与质粒载体ｐＢＳｃｒｉｐｔ－ＫＳ重组，构建测序用的亚克隆。用双链双脱氧末端终止法测各亚克隆的核苷酸序列，再拚接出全长为１５２９ｂｐ的３Ｄ５－５ｃＤＮＡ全长序列。与国际基因库资料比较，未见有相同的序列。此ｃＤＮＡ中有一个长４６５ｂｐ（从５４０ｂｐ－１００４ｂｐ）的ＯＲＦ，编码１５４个氨基酸的蛋白质。此蛋白质中有二个疏水区（第１～３４位氨基酸及第７９～１０９位氨基酸），提示它可能属Ⅰ类穿膜蛋白。     

多聚酶链反应和寡核苷酸探针检测衣原体

本研究所用引物和探针序列选自衣原体１６Ｓ ｒＲＮＡ基因。以生物素末端标记制备探针。多聚酶链反应（ＰＣＲ）扩增物作琼脂糖凝胶电泳和ＤＮＡ斑点杂交，证实引物为衣原体属特异性。ＰＣＲ检测灵敏度达到相当于１个拷贝的衣原体ＤＮＡ分子。生物素化寡核苷酸探针ＤＮＡ斑点杂交的直接检测灵敏度为１００ｐｇ，结合ＰＣＲ扩增的检测灵敏度为１ｆｇ。本法高度敏感、特异，且方法简便，对于衣原体感染诊断和分子流行病学调查具有较好     

人细胞色素p450IA1基因cDNA的克隆和鉴定

在用３－甲基胆蒽诱导培养人羊膜ＦＬ细胞２４ｈ后，抽提细胞总ＲＮＡ并直接合成ｃＤＮＡ第一链。利用人工合成的一对寡核苷酸引物，采用ＰＣＲ技术特异性地扩增Ｃｙｔ ｐ５０ＩＡ１ ｃＤＮＡ。３０个循环后琼脂糖凝胶电泳显示１．５Ｋｂ大小片段，长度与预计相符。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果证实此片段确为Ｃｙｔ ｐ４５０ＩＡ１ ｃＤＮＡ。将此片段克隆至质粒ｐＧＥＭ－３Ｚ并进行部份序列分析。结果显示克隆片段包含Ｃｙｔ ｐ