Ｌ—天门冬酰胺酶Ⅱ的表达与纯化

依据发表的大肠杆菌天门冬酰胺酶Ⅱ基因序列,合成引物,利用ＰＣＲ技术获得天门冬酰胺酶Ⅱ的结构基因,插入高效表达载体pＢＶ２２０,并转化大肠杆菌菌株ＤＨ５α,获得高效表达天门冬酰胺酶Ⅱ的基因工种菌株,通过对包涵体的提取与纯化,结合离子交换层析获得天门冬酰胺酶Ⅱ的蛋白质纯品。检测结果表明得到的天门冬酰胺酶Ⅱ具有较高的比活性,与商品化的同类产品比活相近。     

大肠杆菌L—天门冬酰胺酶的提取和纯化

用蔗糖溶液提取菌体细胞周质中的天门冬酰胺酶，所获得的粗酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维柱层析和羟甲基纤维素柱层析纯化，获得了比活为220IU/mg，SDS-PAGE显示一条带的L-天门冬酰胺酶。     

右旋糖苷对大肠杆菌L—天门冬酰胺酶Ⅱ的化学修饰

用高碘酸氧化法活化的右旋糖苷对大肠杆菌Ｌ－天门冬酰胺酶进行化学修饰，修饰反应的酶活力回收率为４６．８％，修饰酶冻干品比活为１１８．４ＩＵ／ｍｇ蛋白质，酶经修饰后，对底物的亲和力未发生变化，但抗胰蛋白酶水解能力明显提高，抗显性显著减弱。     

L—天门冬酰胺酶的提取和纯化工艺改进

目的：改进L－天门冬酰胺酶的提纯工艺，使成品达到中国药典型标准。方法：在工艺流程中改溶菌酶破裂，蔗糖提取为丙酮破裂，稀盐提取，并增加了亲和层析的工序。结果：提取的L－天门冬酰胺酶活力提高到250IU／mg，纯度达到98％以上，产率达到40％，结论：本工艺优于吴氏工艺，成品达到中国药典标准。     

重组L—门冬酰胺酶Ⅱ的提取与纯化工艺

采用渗透振扰破壁法、硫酸铵分级沉淀,乙醇分级沉淀,ＤＥＡＥ－纤维素层析等步骤提取和纯化重组Ｌ－门冬酰胺酶Ⅱ,并优化提纯过程的条件,提取总回收率高于５０％,产品纯度经高效毛细管电泳检测为单一峰,具有工业生产前景。     

环氧化酶Ⅱ基因克隆及表达

利用RT－PCR技术从NIH3T3细胞中克隆出环氧化酶ⅡcDNA，全长1815bp，测序分析表明与文献报道已知相符，构建真核表达载体。用阳离子脂质体介导转染的方法转染至宿主细胞HEK293细胞中，G418筛选出稳定转染的细胞克隆。加入底物花生四烯酸，通过测定PGE2含量的变化判断酶活，结果表明重组质粒能够表达环氧化酶。     

HPLC用于重组L—天门冬酰胺酶Ⅱ的纯度分析与肽图谱测定

目的：为了对重组Ｌ－天门冬酰胺Ⅱ进行肽图谱测定,以比较不同来源产品间一级结构的一致性。方法：运用梯度洗脱／反相高效液相色谱汉对榈进行纯度检查和肽图谱测定,并提出了简单的三氯乙酸变性方法,以解除蛋白质抗胰蛋白酶水解的能力。结果：建立了重组Ｌ－天门冬酰胺酶Ⅱ的三氯乙烃笥／胰蛋白酶水解测定肽图谱的ＨＰＬＣ方法,肽图谱的比较反映出不同样品间的一级结构间存在差异。结论：建立的肽图谱测定方法,过程简便,便于常     

β-环糊精对L-天门冬酰胺酶的稳定作用

目的 研究β—环糊精(β—CD)对L—天门冬酰胺酶(L—Asnase)稳定性的影响。方法 用β—CD对L—Asnase进行修饰，并对修饰后酶的热稳定性和抗胰蛋白酶水解能力进行了研究。结果 修饰后酶的热稳定性和抗胰蛋白酶水解能力明显提高。结论 β—CD对L—Asnase具有明显的稳定作用。     

工业化生产L-门冬酰胺酶发酵条件的研究

目的探讨不同发酵条件对L 门冬酰胺酶生产发酵的影响。方法对发酵罐的高径比、搅拌器转速、通气量及初始 pH值等控制因素进行研究。结果及结论增加罐体高径比值 ,提高搅拌速度 ,提高发酵通气量及适当的初始 pH值是提高L 门冬酰胺酶发酵的有效途径     

重组大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ中残余DNA的检测

用地高辛标记工程菌ＤＡＮ片段作探讨,针通过分子杂交和免疫显色检测重组天冬酰胺酰半成品中的残余ＤＮＡ。该法对半成品用氯仿抽提,消除了蛋白质对ＤＮＡ测定的干扰。３批重组门冬酰胺酶半成品的测定结果表明,其残余ＤＮＡ均小于１００ｐｇ／剂量。     

重组L—门冬酰胺前体脂质体与重组L—门冬酰胺酶对小鼠毒性作用比较

为了考查Ｌ－门冬酰胺酶（Ｌ－Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ,Ｌ－ＡＳＮａｅｓ）前体脂质体（Ｐｒｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）（Ｌ－ＡＳＮａｓｅＰＬ）与Ｌ－ＡＳＮａｓｅ的急性毒性及对外周血中白细胞总数及血小板数的作用。脂质体组小鼠静脉注射给药（Ｌ－ＡＳＮａｓｅ－ＰＬ）,给药剂量为给药物浓度（４０００ＫＵ／ｍｌ）,最大静脉注射体积（０．５ｍｌ／２０ｇ）;Ｌ－ＡＳＮａｓｅ组给药体积为０．４ｍｌ／２０ｇ,给药一次,给药     

重组L—门冬酰胺酶前体脂质体对急性淋巴白血病小鼠的治疗作用和毒性考察

目的考察重组L-门冬酰胺酶前体脂质体(L-ASNasePL)与重组L-门冬酰胺酶（L-Asparaginase,L-ASNase）对移植性小鼠急性淋巴白血病的作用,及相关急性毒性。方法采用DBA／2小鼠L1210腹水瘤模型,L-ASNasePL组和L-ASNase组小鼠每天腹腔注射一次,连续10d。另设L-ASNasePL组小鼠静脉注射给药,给以最大药物浓度（4000kU·m1     

大肠杆菌L-门冬酰胺酶Ⅱ作为多肽呈现载体的可行性研究

为了研究大肠杆菌L-H冬酰胺酶Ⅱ（Lasparaginasell，AnsB）能否作为多肽呈现载体。选取乙肝病毒表面抗原（HBSAg）preS2结构域的核心抗原表位区作为模型多肽，构建了两种表达载体pET28a-AnsB-preS2L和pET28a-AnsB-preS2C，分别转化至表达宿主菌E.coliBL-21，LB培养基（Kan^r）培养，乳糖诱导高效表达，通过渗透休克，DEAE 52-cellulose柱层析纯化获得了在AnsB C端融合有线状和环状模型多肽的嵌合酶AnsB-preS2L和AnsB-preS2C，两种嵌合酶分别保留了AnsB 81％、25％的催化活力，两者的pH稳定性均与AnsB相符。ELISA检测结果显示AnsB-preS2L与抗preS2抗体的结合能力较AnsB-preS2C强。证明AnsB确实能够作为一种表面呈现载体将线性外源多肽以融合表达的方式呈现在酶分子的表面，最终形成一种在每个亚基表面呈现有多肽的嵌合酶。最后，用富含带电序列的8肽（KRKRKKSR）替换核心抗原表位区作为模型多肽，进一步验证了AnsB作为多肽呈现载体的可行性和通用性。     

植物天门冬酰胺连接酶在大环肽类药物应用中的研究进展

植物中的天门冬酰胺内肽酶(asparaginyl endopeptidases, AEPs)属于半胱氨酸蛋白酶家族,以酶原的形式在酸性液泡中发生自激活,在种子储存蛋白成熟、蛋白质降解、细胞程序性死亡和宿主防御中发挥着重要的生理作用。最近从几种富含环肽的植物中分离鉴定了促进环肽成熟的生物加工酶-天门冬酰胺连接酶(peptidyl Asxspecific ligases, PALs),由AEPs进化而来,可位点特异性催化天冬酰胺或天冬氨酸肽键的生成,由于相对无痕和宽泛的底物谱以及催化效率高等优势,已经在多肽和蛋白质的环化和修饰方面起到重要作用,是提高多肽类药物稳定性的有力工具。本文介绍了AEPs在植物中的生理功能,综述了PALs的发现、结构特点、催化机制和蛋白质工程,以及限制其应用的原因和未来的发展趋势。此外,还重点阐述了PALs在环肽生物合成以及在大环肽类药物开发中的应用,旨在为生物催化合成环多肽类药物提供一种新思路。     

L—天门冬酰胺酶产生菌的快速筛选方法

采用一种简易，快速、微量的奈斯勒试剂显色法，可直接从细菌固体培养物中筛选出产生Ｌ－天门冬酰胺酶的细菌。该法适用于从大量菌株中快速筛选Ｌ－天门冬酰胺酶产生菌。     

人α2b型干扰素的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达提高

应用ＰＣＲ的方法，从人的染色体片段制备人α２ｂ干扰素的ｃＤＮＡ，将其克隆到ｐＲＣ２３表达载体上，构建成重组表达质粒ｐＭＺＩ２Ａ和ｐＭＺＩ２Ｂ，并转化大肠杆菌ＤＨ５α组建成工程菌。ｐＭＺＩ２Ａ和ｐＭＺＩ２Ｂ的区别在于后者的α２ｂ基因５＇－卢始密码ＡＴＧ上游编制了一段ＳＤ顺序，与ｐＬ启动子上连接的ＳＤ顺序组成双ＳＤ顺序。表达重组质粒中由于不含ｃＩｔＳ基因，所以采取３７℃连续培养后比较两者的抗病毒活性，     

人胎盘TRAIL基因的克隆和大肠杆菌中的表达

从人胎盘中提取总RNA，利用RT－PCR技术扩增了可溶性TRAIL（凋亡素配体2）基因片段。序列分析表明该基因序列与国外发表的可溶性TRAIL基因片段的序列完全相同。将该基因片段插入到含T7启动子的质粒pET-28c( )上，构建表达质粒pET-28c( )TRAIL，转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选获得表达菌株BL－pET-28c( )TRAIL。表达菌经1mmol/L的IPTG诱导表达4h后，产生大量的重组人TRAIL蛋白，SDS－PAGE扫描计算机灰度分析表明，表达的重组蛋白占菌株可溶性蛋白的40％ 以上。     

L-天冬酰胺酶Ⅱ基因工程菌的培养

为提高Ｌ－天冬酰胺酶Ⅱ基因工程菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐＫＡ／ＣＰＵ２１０００９的产酶量,采用正交试验法确定了较佳培养条件,并优化了发酵工艺。工程菌摇产酶稳定在１９８Ｕ／ｍｌ。２５Ｌ发酵罐产酶亦高达１８０Ｕ／ｍｌ,发酵周期大大缩短,仅９～１０小时。产酶量比原部以上,具有较好的工业生产前景。     

L-天门冬酰胺酶II的表达与纯化

依据发表的大肠杆菌天门冬酰胺酶II基因序列,合成引物,利用PCR技术获得天门冬酰胺酶II的结构基因,插入高效表达载体pBV220,并转化大肠杆菌菌株DH5α,获得高效表达天门冬酰胺酶II的基因工程菌株。通过对包涵体的提取与纯化,结合离子交换层析获得天门冬酰胺酶II的蛋白质纯品。检测结果表明得到的天门冬酰胺酶II具有较高的比活性,与商品化的同类产品比活相近。