慢性马兜铃酸肾病大鼠模型肾组织中差异蛋白质的筛选

马兜铃酸肾病（aristolochic acid nephropathy,AAN）在临床上十分常见,对人们的身体健康带来极大的危害。目前马兜铃酸导致肾损害的分子机制不清楚,其早期诊断尚无法解决。更谈不上有效的药物治疗。因此,为了阐明马兜铃酸肾损害的分子机制,我们通过建立慢性马兜铃酸。肾病模型,用双向电泳技术筛选和比较模型动物肾组织中马兜铃酸诱导的差异蛋白质分子,为进一步确定马兜铃酸导致肾损害的分子靶点奠定基础。     

改良慢性马兜铃酸肾病大鼠模型的建立

目的建立慢性马兜铃酸肾病(AAN)大鼠模型。方法将雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组,对照组灌服生理盐水,模型组每天灌服马兜铃酸单体5 mg/kg,建立慢性AAN动物模型。各组分别在第2、4、6、8周留取24 h尿液,在第4、8周取血,分离血清,检测肾功能指标,第8周留取肾组织,观察病理变化。结果随着饲养时间的延长,马兜铃酸模型组尿β2-MG、尿NAG水平明显升高,肾小管间质病理损害明显。结论改良方法建立的慢性AAN动物模型,对于药物改善由于马兜铃酸引起的慢性肾小管间质病变提供了新的实验对象。     

慢性间歇性缺氧大鼠肾脏组织表达蛋白质组的变化

比较慢性间歇性缺氧大鼠与正常大鼠肾脏组织蛋白质双向电泳图谱,寻找和鉴定慢性间歇性缺氧大鼠肾脏组织中的差异表达蛋白。方法：以固相pH梯度等电聚焦为第一向和垂直SDS—PAGE为第二向,分别对正常对照大鼠和慢性间歇性缺氧大鼠的肾脏组织蛋白质样品进行二维分离,2-DE图谱经ImageMaster 2D Plafinum v5．0软件分析,选取4个差异蛋白点用基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱（MALDI—TOF—Ms）进行鉴定。结果：通过对2-DE图谱蛋白斑点的匹配及对比分析,与慢性间歇性缺氧相关的差异表达蛋白斑点112个;经质谱鉴定出2个有意义的差异表达的蛋白斑点,慢性间歇性缺氧组表达量下调的差异蛋白质点1个,即线粒体ATP合成酶8亚基;上调的差异蛋白质点1个,即脱嘌呤／脱嘧啶核酸内切酶／氧化还原因子一1。结论：初步鉴定了与大鼠肾脏组织慢性间歇性缺氧损伤相关的差异蛋白,其表达的变化可能通过多种途经影响肾脏功能．该结果为慢性间歇性缺氧导致肾功能损害的发病机制研究提出了新的思路。     

慢性马兜铃酸肾病肾间质纤维化的实验研究

近 10年来 ,国内外学者对慢性马兜铃酸肾病 (CAAN)的临床和病理特征已有了较深入认识 ,但其发病机制仍不十分清楚 ,我们用关木通浸膏水溶液间断灌胃的方法 ,已成功制作成大鼠CAAN动物模型 ,本文即利用这一模型来探讨CAAN肾间质纤维化的发病机制。一、材料与方法1.试剂 :总RNA提取试剂盒及引物 ,实时定量RT PCR试剂盒 ,兔抗大鼠Ⅰ型胶原 (ColⅠ )多克隆抗体 ,兔抗大鼠转化生长因子 (TGF) β1多克隆抗体 ,山羊抗人结缔组织生长因子 (CTGF)多克隆抗体 ,兔抗大鼠纤溶酶原激活物抑制物 (PAI) 1多克隆抗体 ,兔抗人金属蛋白酶组织抑…     

冬虫夏草对马兜铃酸肾病大鼠模型肾纤维化的保护作用与机制研究

目的 探讨冬虫夏草对马兜铃酸肾病(aristolochic acid nephropathy,AAN)大鼠模型肾纤维化的保护作用.方法 将30只SD大鼠随机分为正常组、模型组和治疗组,每组均为10只.治疗组给予冬虫夏草进行干预,30 d后比较各组大鼠肾功能,并通过Masson染色观察各组大鼠肾脏病理变化,RT-PCR法测定各组大鼠肾组织Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ)mRNA的表达.结果 模型组大鼠肾脏明显纤维化,其collagen Ⅰ mRNA的表达亦显著升高.冬虫夏草可下调AAN大鼠BUN、SCr水平及collagenⅠmRNA的表达及肾脏胶原面积百分比.结论 冬虫夏草可有效抑制AAN大鼠模型肾纤维化,其机制可能与下调collagen Ⅰ mRNA的表达、阻断胶原沉积相关.     

大鼠各组织器官蛋白质图谱分析

目的　研究大鼠各组织器官的蛋白质图谱。方法　用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)技术分析大鼠 17种组织器官的蛋白质表达。结果　获得大鼠不同组织器官蛋白质图谱 ,其中肝脏中蛋白质种类最多。结论　各组织器官蛋白质含量与种类存在差异 ,但与相应的组织器官具有和执行的功能呈一定的相关性。     

缓肾散治疗慢性马兜铃酸肾病36例

目的:探讨缓肾散治疗慢性马兜铃酸肾病的疗效。方法:71例慢性马兜铃酸肾病患者随机分为两组,治疗组采用西药对症加缓肾散治疗,治疗效果与对照组(单用西药)比较。结果:治疗组36例,7例临床痊愈,11例显效,13例有效,5例无效,总有效率86.11%;对照组35例,3例临床痊愈,7例显效,11例有效,14例无效,总有效率60.00%。Ridit分析显示,治疗组中医证候疗效明显高于对照组(P<0.05);治疗组临床疾病疗效明显高于对照组(P<0.05)。肾功能检测(尿素氮、肌酐、尿NAG酶及β2-微球蛋白)两组比较均有显著性差异(P<0.05)。结论:用缓肾散治疗慢性马兜铃酸肾病可改善肾功能及临床症状。     

温阳活血方上调慢性马兜铃酸肾病大鼠肾组织血管生成素1 mRNA表达

目的：观察温阳活血方对慢性马兜铃酸肾病大鼠肾组织血管生成素（angiopoietin,Ang）表达的影响,并探讨其保护作用机制。方法：将28只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组和温阳活血方组。模型组大鼠予关木通水煎液10ml/（kg.d）灌胃,温阳活血方组于模型组基础上,再予温阳活血方30g/（kg.d）灌胃。20周后,采用实时逆转录聚合酶链式反应方法检测3组大鼠肾组织中Ang-l和Ang-2mRNA的表达。结果：与正常对照组比较,模型组大鼠肾组织Ang-1mRNA表达明显减少（P〈0.01）,Ang-2mRNA表达明显升高（P〈0.01）;与模型组大鼠比较,温阳活血方组大鼠肾组织Ang-1mRNA表达升高（P〈0.01）,Ang-2mRNA表达下降,但差异无统计学意义（P〉0.05）;肾脏病理显示温阳活血方组肾损害较模型组明显减轻。结论：温阳活血方通过上调Ang-1mRNA的表达发挥对慢性马兜铃酸肾病大鼠肾脏保护作用。     

甲状腺癌蛋白质差异表达的观察

目的 由于甲状腺结节的高发率和鉴别良恶性的困难,所以需要寻找一种比较特异的分子标志。本研究的目的就是利用蛋白组学方法,建立人甲状腺癌和癌旁正常组织的双向凝胶蛋白图谱,寻找差异表达的蛋白质。方法 双向凝胶电泳分离人甲状腺癌及其周围正常组织的总蛋白质,通过图形软件分析比较,找出差异表达的蛋白质,利用质谱对差异表达的蛋白质进行鉴定。结果 建立双向凝胶图谱,平均蛋白质点数约为1000个左右。发现只在肿瘤表达的点有263个,表达上调2倍及以上的点有134个。在对差异点进行的质谱鉴定中发现了热休克蛋白27在肿瘤中表达下调。结论 建立了人甲状腺乳头状癌和癌旁正常组织的双向电泳图谱,并鉴定了一些与肿瘤相关的蛋白质。     

肾康注射液对慢性马兜铃酸肾病模型大鼠肾间质纤维化的拮抗作用

目的 研究肾康注射液对慢性马兜铃酸肾病 (CAAN) 模型大鼠肾间质纤维化的拮抗效应。方法 雄性 SD 大鼠随机分为对照组、模型组和干预组，每组6只。于 0、1、4、8、12 周末分别检测体质量、尿糖、24 h 尿蛋白定量和肌酐清除率 (Ccr)；第12周末处死大鼠留取肾组织，行 Masson 染色观察肾间质纤维化程度；并用逆转录实时定量聚合酶链反应和免疫组织化学方法检测肾组织中转化生长因子-β₁ (TGF-β₁)、结缔组织生长因子 (CTGF)、纤溶酶原激活物抑制物-1 (PAI-1)、金属蛋白酶组织抑制物-1 (TIMP-1) 和Ⅰ型胶原 (Col I) mRNA 及蛋白表达。结果 与对照组比较，模型组和干预组大鼠体质量明显减轻 (P＜0.01)，但干预组大鼠体质量明显高于模型组，12周末时存在显著差异 (P＜0.05)。与对照组相比，模型组大鼠 24 h 尿蛋白定量显著上升 (P＜0.01)，Ccr 显著下降 (P＜0.01)；12 周时肾间质纤维化面积显著增加 (P＜0.01)；肾组织内上述各检测指标的 mRNA 及蛋白表达均显著上调 (P＜0.01)。与模型组相比，干预组大鼠各时间点 Ccr 均显著升高 (P＜0.01)；第12周时 24 h 尿蛋白定量及肾间质纤维化面积均显著降低 (P＜0.05、0.01)；上述高表达的 mRNA 及蛋白指标均被显著抑制 (P＜0.05)。结论 肾康注射液可能通过抑制肾组织促细胞外基质 (ECM) 合成因子 (TFG-β₁、CTGF) 及抗 ECM 降解因子 (TIMP-1、PAI-1) 生成，而改善 CAAN 的肾间质纤维化及肾功能。     

慢性马兜铃酸肾病与慢性肾小球肾炎肾衰竭贫血的比较研究

目的通过与原发性慢性肾小球肾炎（CGN）肾衰竭患者相比较,探讨慢性马兜铃酸肾病（AAN）肾衰竭患者肾性贫血的临床特点。方法自2003年3月～2005年3月我科共经治26例慢性AAN肾衰竭患者。选择同期31例原发性CGN肾衰竭患者作为对照,测定用药前的血红蛋白（Hb）及血肌酐,根据MDRD公式估算。肾小球滤过率（GFR）。根据GFR分为GFR≥60ml／min及GFR〈60ml／min两个亚组,比较两组及两组中相应亚组Hb的差异,以Hb为因变量,GFR为自变量,求线性回归方程,并比较两组线性回归方程斜率及截距差异的显著性。结果两组之间GFR差异无统计学意义（P〉0．05）,慢性AAN组hb比CGN组显著低（P〈0．01）,两个亚组中也是慢性AAN组Hb比CGN组显著低（P均〈0．01）。慢性AAN组Hb与GFR倒数的线性回归方程的斜率及截距均显著比CGN组小（P〈0．01）。结论与CGN肾衰竭患者相比,慢性AAN肾衰竭患者贫血发生早、进展快、程度重,这种特点可能与其肾小管间质损害的病理损害特征有关。     

Transitional cell carcinoma associated with aristolochic acid nephropathy: most common cancer in chronic hemodialysis patients in China

Background  The research of cancer in patients on hemodialysis (HD) in China has not been reported. The aim of this study was to investigate the clinical and histological features and outcomes of cancer in Chinese HD patients.

Methods  The study subjects were 49 cancer patients (1.4%) out of 3448 end stage renal disease (ESRD) patients maintained on HD at China-Japan Friendship Hospital from October 1997 to July 2011.

Results  Urinary tract cancer (74%) was the most common followed by gastrointestinal tract cancer (12%), breast cancer (6%), lung cancer (4%), thyroid cancer (2%), and hematologic cancer (2%). Thirty-three patients (67%) had urinary tract transitional cell carcinoma (TCC) and 29 of them had aristolochic acid nephropathy (AAN) as underlying disease. Death occurred in eight patients out of 49, and the survival rate of HD patients with cancer was similar to those without cancer (P=0.120).

Conclusion  The urinary tract TCC is the most common cancer in HD patients with AAN in one of the centers of northern China.

     

代谢酶在马兜铃酸肾病中的作用

马兜铃酸（aristolochic acid,AA）是马兜铃酸肾病（aristolochic acid nephropathy,AAN）的致病因素,已受到国际上的高度重视,有关AA肾毒性机制的研究目前已成为毒理学领域的研究热点之一。马兜铃酸I（AAI）是马兜铃酸的主要毒性成分,氧化和还原是AAI体内快速清除必不可少的代谢过程。参与AAI氧化还原的代谢酶及此代谢过程在AAN中的作用取得了重大进展,因此对相关的研究结果进行综述,为进一步深入研究AAI肾毒性机制提供参考。     

骨髓干细胞移植治疗慢性马兜铃酸肾病大鼠的实验研究

目的:观察骨髓源性干细胞能否向慢性马兜铃酸肾病大鼠肾脏细胞分化及移植后相关生化指标的动态变化。方法:制备雌性Wistar大鼠CAAN动物模型,亚致死剂量X线照射后经尾静脉移植同系雄性大鼠骨髓干细胞,于移植后第60d处死大鼠,留取血、尿及肾组织标本。生化检测观察移植后相关生化指标的改善情况,Y染色体荧光原位杂交(Y-FISH)观察雌性受体大鼠肾脏中雄性骨髓源性干细胞的分化情况。结果:骨髓移植60d后在肾小球及肾间质中均发现Y染色体阳性的供体源性细胞,相关生化指标得到改善。结论:骨髓源性干细胞具有向慢性马兜铃酸肾病大鼠肾小球及间质细胞分化的潜能。     

妇科分清丸所致马兜铃酸肾病的临床和病理特点

目的探讨妇科分清丸所含马兜铃酸对肾脏、肝脏和血液系统的毒性作用及治疗途径。方法收集该院2003￣2004年14例由妇科分清丸所致马兜铃酸肾病(AAN)病人的临床和病理资料,并用前列腺素E1(10μg/d)静点或静推10￣14d治疗。结果妇科分清丸含有关木通,能引起血液、消化和肾脏等多器官功能障碍,症状出现早而严重。该组病人住院期间应用前列腺素E1治疗后血肌酐下降而血红蛋白水平升高(P<0.05)。结论马兜铃酸可能引起前列腺素系统或其他影响肾脏血流量的血管活性因子异常,所以改善微循环治疗对改善AAN的肾功能损伤有效,但是用量及疗程尚有待于进一步探讨。     

高效液相色谱法测定大鼠组织样品中马兜铃酸A的含量

目的建立用高效液相色谱法（HPLC）测定大鼠脾虚模型组织与血浆样品中马兜铃酸A含量的方法。方法色谱条件为HypersilODS2柱（4．6mm×250mm,5μm）,柱温30℃,流动相为甲醇：乙腈：水（0．6％冰醋酸,pH=3．60）（30：30：40）,流速为1ml／min,检测波长为250nm,20μl进样。结果空白血浆中马兜铃酸A在0．05～25μg／ml范围内与峰面积线性关系良好（Y=57672X-10065,R^2=0．9994）,提取回收率为83．46％～94．13％,方法回收率为99．67％～106．43％。低、中、高3个浓度的日内精密度RSD分别为6．28％、3．36％、1．88％,日间精密度RSD分别为9．67％、4．27％、4．56％。血浆中马兜铃酸A的最低检测浓度为0．05μg／ml,组织中最低检测浓度为0．31ng／g。结论建立的HPLC法准确、稳定、重复性好、灵敏度高,可应用于大鼠脾虚模型组织和血浆样品中马兜铃酸A的含量测定。     

银杏叶提取物对马兜铃酸肾病管周毛细血管病变的治疗作用

目的研究马兜铃酸肾病管周毛细血管（peritubular capillaries，PTCs）损害以及银杏叶提取物（EGB）对其治疗作用。方法将20只雌性Wister大鼠先用关木通煎剂灌胃8周，然后随机分为治疗组（10只）和未治疗组（10只）。治疗组再予EGB灌胃治疗8周；未治疗组予饮用水灌胃8周。另设正常对照组8只。第16周处死全部大鼠，留取尿、血和肾组织标本，分别作病理、免疫组化CD34抗体标记、生化等检查。结果与正常对照组和治疗组相比，未治疗组大鼠问质微血管病变严重，PTCs密度明显减少（P〈0．01），肾功能明显损害（P〈0．01），肾小管萎缩明显，肾小管面积明显缩小（P〈0．01），肾间质面积明显增加（P〈0．01），肾间质严重纤维化。EGB能明显延缓马兜铃酸肾病的进展，减轻微血管病变，改善肾小管萎缩程度，保护肾功能。PTCs密度与血肌酐（Scr）水平、肾问质面积呈负相关（P〈0．001），与近端小管面积呈正相关（P〈0．001）。结论马兜铃酸肾病PTCs损伤严重，EGB治疗能明显改善PTCs损伤程度，保护肾功能。     

虫草菌粉对慢性马兜铃酸肾病大鼠模型肾间质纤维化的保护作用

目的研究虫草菌粉对慢性马兜铃酸肾病（CAAN）模型大鼠肾间质纤维化的拮抗作用。方法雄性sD大鼠随机分为对照组、模型组和虫草组;每组6只。于0、1、4,8及12周末分别检测大鼠体重、尿糖、尿蛋白定量和血清肌酐（SCr）;并于第12周末处死大鼠留取肾组织,行Masson染色观察肾间质纤维化程度,逆转录实时聚合酶链反应和免疫组织化学方法检测肾组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）、纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）、金属蛋白酶组织抑制物-1（TIMP-1）和Ⅰ型胶原（ColⅠ）mRNA及蛋白质表达。结果模型组大鼠尿蛋白定量及SCr显著高于对照组（P〈0．01及P〈0．05）;12周时肾间质纤维化面积显著增加（P〈0．01）;肾组织内上述指标的mRNA及蛋白质表达显著上调（P〈0．01）。与对照组相比,模型组大鼠肾组织TGF-β1、CTGF、PAI-1、TIMP-1和ColⅠ的mRNA表达分别上调4．19、2．66、6．12、3．09和7．03倍;蛋白质表达分别上调2．31、3．53、3．17、3．18和6．87倍。虫草组大鼠第12周时尿蛋白定量、SCr及肾间质纤维化面积均显著低于模型组（P〈0．05）,上述高表达的mRNA及蛋白质指标均被显著抑制（P〈0．05）,与模型组相比,虫草组大鼠肾组织TGF-β1、CTGF、PAI-1、TIMP-1和ColⅠ的mRNA表达分别下调45％、41％、47％、48％和67％;蛋白质表达分别下调38％、39％、49％、46％和61％。结论虫草菌粉可通过抑制肾组织促细胞外基质（ECM）合成因子（TGF-β1、CTGF）及抗ECM降解因子（TIMP-1、PAI-1）生成,而改善CAAN的肾间质纤维化及肾功能。     

小G蛋白Rac1在马兜铃酸诱导肾小管上皮细胞损伤中的作用及意义

目的：探讨马兜铃酸（从）致肾小管上皮细胞损伤的机制及小G蛋白Racl在此过程中发挥的作用。方法：以溶剂作为对照组,从以浓度10μg／mL作用于大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E,培养24h后,WST-1法检测细胞增殖的抑制率;Hoechst33258染色观察细胞核的形态变化;细胞免疫荧光染色检测Ⅲ型胶原和Racl蛋白的表达;real—time RT—PCR检测TGF—D1mRNA的表达;ELISA法检测细胞培养上清液中Racl和TGF—β1含量,并分析两者相关性。结果：从可明显抑制NRK-52E细胞增殖,并诱导细胞凋亡。从以10μg／mL处理NRK-52E细胞24h后,TGF—β1 mRNA的表达明显升高（p〈0．05）,并且细胞外基质成分Ⅲ型胶原的表达明显增加（P〈0．05）。此外,从也可诱导小G蛋白Racl的表达（P〈0．05）。相关分析显示,AA诱导NRK-52E细胞损伤过程中,Racl的表达量与TGF—β1的分泌水平呈现明显正相关（r=0．967,P〈0．01）。结论：从诱导肾小管上皮细胞出现纤维化样改变,同时伴有Racl蛋白的高表达;Racl及其介导的信号通路可能被TGF-β1的高表达所活化,进而参与从所致的胶原累积过程。