重组人sCR1在巴斯德毕赤酵母细胞中的表达、纯化及鉴定

目的:酵母细胞SMD1168表达人sCR1,并对重组蛋白进行纯化。方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPIC9K,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9K-sCR1);经测序鉴定正确后,将重组质粒转化入毕赤酵母菌细胞SMD1168中,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析及Western blot鉴定,并通过Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化。结果:经甲醇诱导的含pPIC9K-sCR1的酵母细胞表达出重组人sCR1的融合蛋白,48～72hsCR1融合蛋白表达量最高。此蛋白在凝胶上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论:人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

EGF在毕赤酵母中的表达及活性测定

目的高效表达和纯化有活性的EGF蛋白。方法将含有表皮生长因子(EGF)基因的质粒pAO815通过LiAc法转入毕赤酵母细胞中,筛选在MM平板上生长缓慢的Muts型酵母工程菌,甲醇诱导基因表达产生EGF,柱纯化后利用SDS-PAGE检测到EGF的生成,MTT法及新生小鼠皮下法分别检测活性。结果 SDS-PAGE电泳检测EGF成功表达和纯化,MTT法测定EGF生物活性约为2.8×106IU/mL。结论本研究构建的工程菌株能高效表达EGF,且纯化的EGF具有与天然EGF同样的体外和体内活性。     

重组人白细胞介素10在毕赤酵母中的表达及生物学活性测定

目的在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人白细胞介素10(rhIL-10),用于IL-10的生理功能研究和动物试验。方法通过PCR扩增IL-10基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点处,再将融合基因αIL-10重组到表达质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,SalⅠ酶切线性化重组质粒IL-10/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的基因IL-10,甲醇诱导rhIL-10的表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定目的蛋白,用ELISA定量测定及MC/9细胞分析IL-10生物学活性。结果成功构建了重组表达质粒IL-10/pPIC9K,获得了4个含IL-10基因的高拷贝毕赤酵母转化子,甲醇诱导后,在摇瓶水平的IL-10表达量为(0.627±0.09)mg/L,比活性为1.5×105U/mg。结论毕赤酵母分泌表达的IL-10具有良好的生物学活性。     

复合干扰素在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及活性分析

目的 在毕赤酵母中高效分泌表达复合干扰素。方法 根据毕赤酵母密码子偏性合成了复合干扰素基因，克隆至分泌型酵母表达载体pMKX9K，线性化后转化毕赤酵母GS115，筛选高表达菌株。诱导后的培养上清经过离子交换，疏水层析，凝胶过滤三步层析纯化，用细胞病变抑制法测定其活性，并结合Iowry法蛋白定量计算其比活性。结果 SDS-PAGE分析显示，重组蛋白以可溶性分子的形式存在于上清液中，经纯化后纯度达到96％，其N端氨基酸序列与理论值一致，比活与干复津相当。结论 复合干扰素在毕赤酵母中获得高效分泌表达，为获得大量基因工程产品奠定了基础。     

人成纤维细胞生长因子13基因在酵母细胞中的表达

目的：用酵母细胞表达重组人成纤维细胞生长因子（ｈＦＧＦ１３）蛋白并检测其活性。方法：通过ＲＴ－ＰＣＲ从流产胎儿脑组织中钓取ｈＦＧＦ１３ｃＤＮＡ,将其克隆入ｐＹＥＸ４Ｔ－１载体质粒。在酏母细胞表达ＧＳＴ＿ｈＦＧＦ１３融合蛋白。以细胞增殖实验测定酵母表达蛋白粗提物的活性。结果：ＧＳＴ－ｈＦＧＦ１３融合刷拓酵发母细胞中得到表达;ＧＳＴ－ｈＦＧＦ１３融合蛋白细胞ＮＩＨ３Ｔ３细胞的增殖,而且此活性能够被ＦＧ     

重组嵌合抗人CD22四价基因工程抗体在毕赤酵母中的表达及活性检测

目的:采用酵母多拷贝分泌表达载体pPIC9K表达重组嵌合抗人CD22四价基因工程抗体cRFB4FC和cRFB4CH3,并进行活性检测。方法:采用基因克隆技术获得两抗体的基因,然后将其克隆入表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K/cRFB4FC和pPIC9K/cRFB4CH3,经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母SMD1163中,将经G418抗性筛选出的重组酵母菌株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,经ELISA检测生物学活性。采用正交试验优化重组酵母菌株的表达条件以提高抗体的表达量。结果:获得重组表达质粒pPIC9K/cRFB4FC和pPIC9K/cRFB4CH3,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母菌株,经甲醇诱导表达出cRFB4FC和cRFB4CH3蛋白。它们在SDS-PAGE上分别表现为相对分子质量(Mr)约326 000和295 000的蛋白区带,在Western blot分析中均可被山羊抗人IgG Fc单克隆抗体(mAb)识别,经ELISA分析它们都具有较高的生物学活性。优化表达条件后,抗体的表达量分别提高了196.4%和151.7%。结论:抗体cRFB4FC和cRFB4CH3在酵母菌SMD1163中成功获得高效分泌表达,并有免疫学活性。     

重组人白介素18在毕赤酵母中的高效分泌表达

目的:构建人白介素18(hIL-18)真核表达载体, 在毕赤酵母中高效分泌表达hIL-18.方法:通过PCR法扩增得到hIL-18基因, 构建其真核表达载体pPICZaC/hIL-18, 电转化毕氏酵母X-33, PCR、 SDS-PAGE、 Western blot等方法筛选获得高效表达rhIL-18的工程菌株, 疏水层析和阴离子交换层析纯化表达产物, 并初步测定其生物学活性.结果:rhIL-18经甲醇诱导后其表达产量约为202 mg/L.Western blot检测了rhIL-18的特异性结合活性; rhIl-18纯化后纯度达95%左右, 并证明rhIL-18能够协同IL-2诱导PBMC分泌IFN-γ.结论:构建了重组hIL-18的基因工程菌, 并在毕赤酵母中实现了高效分泌表达, 为进一步研究其活性和功能奠定了基础.     

角质细胞生长因子

角质细胞生长因子(KGF)是由成纤维细胞及其他间质细胞分泌的生长因子。按照氨基酸序列的同源性,KGF属于成纤维细胞生长因子(FGF)家族,又称FGF-7。与其他FGF不同,KGF特异地调节上皮源性细胞的生长和发育,这是由于KGF受体主要存在于上皮细胞的缘故。KGF的这一独特性质,使得它被认为在间质-上皮相互作用过程中起一种副泌介质的角色。     

人血管内皮生长因子在毕赤酵母菌中的表达和鉴定

目的 研究人血管内皮生长因子（ｈＶＥＧＦ１６５）基因在Ｐｉｃｈｉａ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母中的表达,获得高效表达的具有生物学活性的重组ＶＥＧＦ１６５。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ｈＶＥＧＦ１６５基因,经ＤＮＡ序列分析后,插入含ＡＯＸ１启动子和α分泌信号肽序列的Ｐｉｃｈｉａ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母载体中,构建重组表达质粒ｐＰＩＣ９Ｋ／ｈＶＥＧＦ１６５,转化酵母宿主菌ＫＭ７１,筛选多拷贝整合转化子,摇瓶培养,１％甲醇诱导表达。结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示,诱导４ｄ的培养上清中ｈＶＥＧＦ１６５表达量达上清总蛋白的３０％以上。ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ实验表明,表达产物具有良好的抗原性和特异性。生物学活性检测证实其具有刺激ＨＵＶＥＣ增殖的功能。结论 在Ｐｉｃｈｉａ．ｐａｓｔｏｒｉｓ表达系统中实现了ｈＶＥ     

角质细胞生长因子及其受体在人卵泡膜细胞和颗粒细胞的分布

目的　探讨角质细胞生长因子 (KGF)及其受体 (KGFR)在人卵泡膜细胞和颗粒细胞的表达。方法　采用原位杂交和免疫组化方法分别观察KGF、KGFR在人卵泡膜细胞和颗粒细胞的分布。结果　KGFmRNA存在于正常人卵泡膜细胞和颗粒细胞中 ,KGFmRNA的表达为卵泡膜细胞高于颗粒细胞 (P <0 .0 5 ) ,KGFR的表达为颗粒细胞高于卵泡膜细胞 (P<0 .0 5 ) 。结论　人卵泡膜细胞分布有KGF ,颗粒细胞分布有KGFR ,两者可能存在旁分泌的调节作用。     

VEGF_(165)cDNA在酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究

目的研究人 ＶＥＧＦ１６５基因在 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母中的表达,获得高效表达、具有生物学活性的重组ｈＶＥＧＦ１６５。方法采用ＰＣＲ扩增ｈＶＥＧＦ１６５基因,经ＤＮＡ序列分析后,插入含ＡＯＸ１启动子和α分泌信号肽序列的Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母表达载体中,构建重组质粒ｐＰＩＣ９Ｋ／ｈＶＥＧＦ１６５。经转化酵母宿主菌ＫＭ７１,筛选多拷贝整合转化子,摇瓶培养,用 １０ ｍＬ／Ｌ甲醇诱导表达。表达产物经Ｈｅｐａｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂ亲和层析纯化后,以人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）测定其生物学活性。结果ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示,表达产物以可溶性分子的形式存在于上清中,诱导４ｄ的表达量达上清中总蛋白的６０％以上。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ表明,表达产物具有良好的抗原性和特异性。经Ｈｅｐ－ａｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂ亲和层析纯化, ｒｈＶＥＧＦ１６５的纯度可达到９０％以上。生物学活性检测证实,其具有刺激脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）增殖的活性。结论在 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ表达系统中,实现了ｈＶＥＧＦ１６５的高效分泌性表达。     

新型酵母表达系统-Pichia.pastoris高效分泌型表达病毒生长因子的研究

目的实现痘苗病毒生长因子的高效分泌型表达.方法构建pPIC9K/VGF表达载体,扩增引物分别为P1TATACGTAGATAGTGGTAACG,P2TAGAATTCTTAAGTGTTTGGTTTT;采用Pichia.pastoris酵母表达系统.结果经酶切鉴定,证明克隆的基因是正确的;经SDS-PAGE分析,证明转化基因组中确实整合有VGF基因,其分子量为9.6kD;得到了高效分泌型VGF高产菌株,目的蛋白占培养液上清蛋白总量的80%以上,产量为0.45g/L.结论证实可以通过Pichia.pastoris系统制备可溶性痘苗病毒生长因子,为大规模工业生产打下基础.     

人血管内皮生长因子受体Flt-1胞外区2-3loop在Pichia.pastoris酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究

目的研究人Flt-1胞外区2-3loopcDNA在Pichia.pastoris酵母中的表达,获得高效表达的具有生物学活性的重组Flt-1(2-3)。方法采用PCR扩增Flt-1(2-3)基因,经DNA序列分析后,插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia.pastoris酵母表达载体中,构建重组质粒pPIC9K/Flt-1(2-3),转化酵母宿主菌GS115,筛选His     

人血管内皮生长因子受体胞外1-3、2-3 loopcDNA在酵母中的表达及其生物学活性研究

目的 在酵姆 中实现人血管内皮生长因子（hVEGF165)受体FLT-1胞外1-3及2-3loopcDNA的高效分泌性表达,并比较两种表达产物的生物学活性。方法 构建酵母重组表达质粒pPIC9K/FLT-1(1-3)及pPIC9K/FLT-1(2-3),并分别转化酵母宿主菌CS115,表达产物经CM-SepharoseFF阳离子交换层析和SephacrylS-100分子筛层析纯化后测定其生物学活性。结果 SDS-PACE显示,表达产物以可溶性分子形式存在于上清中,诱导4d的表达量占上清总蛋白的60%以上。表达的sFLT-1（1-3）及sFLT-1(2-3)都具有结合hVEGF165的能力和抑制hVEGF165对人脐静脉内皮细胞（HUVC）的促增殖功能,其中前者的作用虽较强,但二者相差不大。结论 获得了具有生物学活性的可溶性重组TLT-1受体胞外区1-3及2-3loop小片段,为进一步的动物实验和临床应用提供有益的资料。     

口蹄疫病毒 VP1 蛋白在酵母中的表达及免疫原性分析

目的 :利用毕赤酵母表达系统表达牛O型口蹄疫外壳蛋白(FMDVVP1) ,并对表达的蛋白进行免疫原性鉴定。方法 :将FMDVvp1基因克隆到毕赤酵母Pichiapastoris分泌性表达载体pSuperY中 ,构建重组表达载体pSuperY/vp1,经测序证明vp1基因序列的正确性。将纯化的重组质粒经线性化酶切后 ,用电转化法将pSuperY/vp1导入毕赤酵母菌种SMD116 8H中。对表达产物用SDS PAGE和Westernblot进行分析 ,并用酵母表达的FMDVVP1蛋白免疫小鼠。结果 :以重组质粒pSuperY/vp1转化毕赤酵母菌后 ,能表达相对分子量 (Mr)为 6 6 0 0 0和4 30 0 0的FMDVVP1蛋白。动物免疫结果表明 ,FMDVVP1蛋白能诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答。结论 :在毕赤酵母中成功地表达FMDVVP1蛋白 ,为研制新型FMDVVP1的基因工程疫苗奠定了基础     

人sTNFR II-IgG Fc融合蛋白在毕赤酵母菌中的表达及其产物分析

目的:在毕赤酵母菌中表达sTNFR II-IgG Fc融合蛋白。检测融合蛋白是否形成二聚体,并对其N-糖链进行分析。方法:从人淋巴细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增目的基因sTNFRII与IgG Fc,然后利用重叠延伸PCR得到嵌合体基因sTNFRII-IgG Fc,并将其插入pPIC9载体中。以重组载体转化巴斯德毕赤酵母菌中进行克隆与表达。采用ELISA筛选高表达sTNFR II-IgG Fc融合蛋白的重组毕赤酵母菌株,对融合蛋白通过还原和非还原SDS-PAGE分析其二聚体结构,采用L929细胞检测融合蛋白抗TNF-α的生物学活性,最后利用荧光辅助糖电泳(FACE)分析融合蛋白的N-糖链。结果:成功地建立了可分泌表达sTNFR II-IgG Fc融合蛋白的重组酵母菌株,摇瓶培养后融合蛋白的表达量为2mg/L。SDS-PAGE和Western blot表明,该融合蛋白能自然形成二聚体结构;可抑制TNF-α对L929细胞的杀伤作用,其中和5×104U/LTNF-α的EC50为170μg/L。FACE分析融合蛋白N-糖链的大小为11~13个糖残基。结论:在毕赤酵母菌中成功地表达了sTNFR II-IgG Fc融合蛋白,为在毕赤酵母菌中表达其他的Fc融合蛋白和抗体提供了参考。     

人TPO N端结构域在毕赤酵母中的分泌表达及产物鉴定

目的在酵母系统中分泌表达人ＴＰＯＮ－端结构域，对其生物学活性进行初步研究，为与其它ＴＰＯ分子进行ＴＰＯ糖基化生物学意义的研究打基础。方法将编码人ＴＰＯ成熟肽Ｎ端１９５个氨基酸的ｃＤＮＡ与酵母整合型载体ｐＰＩＣＺαＡ重组，构建的重组质粒用ＤｒａⅠ消化成线性ＤＮＡ，转染酵母细胞ＧＳ１１５，使ＴＰＯ基因整合到酵母染色体上；用ＴＰＯ抗体筛选获得遗传性分泌稳定表达的重组酵母细胞株；用ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ鉴定ＴＰＯ产物及分子量；用对小鼠骨髓细胞形成巨核细胞集落形成单位（Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ，ＣＦＵ－Ｍｅｇ）的方法测定活性。结果获得了ＴＰＯＮ－端结构域在酵母系统中的分泌表达，表达产物可被ＴＰＯ抗血清识别，分子量约为２２０００；其产物对小鼠骨髓细胞形成ＣＦＵ－Ｍｅｇ具有明显的刺激作用。结论在巴氏毕赤酵母系统中成功地分泌表达了有生物学活性的人ＴＰＯＮ－端结构域